استخدام نظام تروية الأنسجة في المختبر للكشف عن الأنشطة الوظيفية للأنابيب المعوية المعزولة في الوقت الفعلي

Summary

نقدم طريقة لعزل الأنابيب المعوية للفئران وتقييم تأثير الأدوية على توترها وتواترها وسعتها في المختبر. تقدم هذه الطريقة نهجا قيما للباحثين الذين يبحثون في الأنابيب المعوية.

Abstract

تشكل أمراض الجهاز الهضمي ، التي ترتفع نسبة حدوثها ، تحديات كبيرة للبشر. الأمعاء الدقيقة جزء لا يتجزأ من هضم الطعام والدواء وامتصاصه وتلعب دورا حاسما في علاج هذه الأمراض. تستخدم تجربة حركة الأنبوب المعوي ، وهي طريقة شائعة وأساسية في المختبر ، لدراسة ديناميكيات الجهاز الهضمي. ويشمل ذلك تحضير الأنبوب المعوي المعزول ، وكذلك تعليق الأنبوب المعوي المحضر في الحمام وتوصيله بكاشف الإشارة. ويتبع ذلك تسجيل وتحليل سلسلة من المعلمات ، مثل التوتر ، والتي يمكن استخدامها لتقييم الوظيفة الحركية المعوية ، وكذلك اعتبارات الحفاظ على الأنبوب المعوي نشطا في المختبر. يعمل البرنامج الموحد من أخذ العينات إلى جمع البيانات على تحسين قابلية تكرار البيانات التجريبية بشكل كبير ويضمن صحة تسجيل التوتر المعوي بعد التدخل الفسيولوجي والمرضي والعقاقير. نقدم هنا المشاكل الرئيسية في العملية التجريبية وبروتوكولا تجريبيا مرجعيا قيما لدراسة الأدوية التي تنظم حركية الجهاز الهضمي.

Introduction

تؤثر أمراض الجهاز الهضمي ، وهي حالة سائدة ، بشكل خطير على حياة الإنسان وصحته¹. يعد اضطراب حركية الجهاز الهضمي جزءا مهما من أمراض الجهاز الهضمي الوظيفية ، ويتجلى بشكل أساسي في الأعراض المنهكة ، وتأخر إفراغ المعدة ، ومشاكل المعدة الشديدة². يمكن أن يعطل التنسيق المعدي المعوي ، ويعيق إفراغ المعدة ، ويؤثر على عدم تحمل الطعام المعوي ، وحتى يسبب انسدادا وظيفيا في الأمعاء الدقيقة أو الغليظة³. بالنسبة للمرضى الذين يخضعون لجراحة الجهاز الهضمي ، يمكن أن يؤدي هذا الاضطراب مباشرة إلى فشل الأمعاء. علاوة على ذلك ، لا يرتبط الاضطراب المعوي بأمراض الجهاز الهضمي فحسب ، بل يرتبط أيضا بالعوامل المسببة للأمراض لمختلف الأمراض الأخرى ، مثل التهاب الكبد وأمراض الجهاز العصبي المركزي. تلعب المجتمعات الميكروبية المعوية دورا تنظيميا حاسما في فسيولوجيا الأمعاء ، بما في ذلك الحركة ، والتي تؤثر لاحقا على الاستعمار داخل النظام البيئي الميكروبي⁴. مع تقدم عدوى فيروس التهاب الكبد B إلى التهاب الكبد B المزمن ، هناك درجات متفاوتة من التغيرات في النباتات المعوية. أظهر تعديل النباتات المعوية فوائد في علاج فيروس التهاب الكبد^{B 5}. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للجهاز العصبي المركزي التأثير على الأمعاء وتغيير تكوينها الميكروبي. كشفت التطورات الحديثة في تكنولوجيا تسلسل البكتيريا الدقيقة عن تفاعلات ثنائية الاتجاه بين البكتيريا المعوية ووظيفة الجهاز العصبي المركزي ، والتي ترتبط ارتباطا وثيقا بحدوث وتطور أمراض الجهاز العصبي المركزي ^6,7.

مع شيخوخة المجتمع ، يتصاعد حدوث اضطراب حركية الجهاز الهضمي ، ويرتبط بانخفاض أو فقدان الوظيفة العصبية في الجهاز العصبي المعوي والتعصيب الداخلي للأمعاء⁸. مع توسع فهمنا لأمراض الجهاز الهضمي ، تظهر العديد من الأفكار والأساليب الجديدة ، مما قد يؤدي إلى تطورات دوائية جديدة. ومع ذلك ، لا تزال العديد من هذه الأفكار افتراضية أو تنتظر نتائج التجارب السريرية الإيجابية لتتحقق ^9,10. طرق البحث الفعالة حاسمة في التغلب على أمراض الجهاز الهضمي. في السنوات الأخيرة ، ركزت الأبحاث المكثفة على أدوية الجهاز الهضمي وتنظيم الحركة. لا يمكن فصل أدوية الجهاز الهضمي وديناميكيات الجهاز الهضمي ، والعديد من الأدوية الجهازية الأخرى لها تأثيرات متفاوتة على ديناميكيات الجهاز الهضمي. على سبيل المثال ، تستخدم العقاقير غير الستيرويدية المضادة للالتهابات (مضادات الالتهاب غير الستيروئيدية) للألم والالتهاب وبطء حركة الجهاز الهضمي ، مما يزيد من خطر الإصابة بالقرحة الهضمية¹¹. من ناحية أخرى ، قد تؤثر بعض مضادات الاكتئاب على حركية الجهاز الهضمي¹². حاليا ، التجربة الدوائية الرئيسية في المختبر التي تدرس آثار أدوية الجهاز الهضمي والأدوية الجهازية الأخرى على حركية الجهاز الهضمي هي فحص حركة الأمعاء في المختبر ¹³. من خلال محاكاة الظروف الفسيولوجية ، يلاحظون التأثير المباشر للأدوية على تقلص العضلات الملساء المعوية والاسترخاء ، وتقييم آثارها المعدية المعوية. ومع ذلك ، لا يزال السبب الدقيق لاضطرابات حركية الجهاز الهضمي غير واضح ، ومن المحتمل أن يكون تفاعلا معقدا بين العوامل الوراثية والبيئية والغذائية والغدد الصم العصبية. وبالتالي ، لا يزال علاج اضطرابات حركية الجهاز الهضمي يشكل تحديات كبيرة.

الأمعاء الدقيقة ، كونها موقعا مهما للهضم والامتصاص واستقلاب الدواء ، لها أهمية في وظيفة الجهاز الهضمي. نتيجة لذلك ، يعد اختبار حركة الأنبوب المعوي المعزول أداة أساسية لدراسة أمراض الجهاز الهضمي. يتضمن ذلك إعداد ووضع الأنبوب المعوي المعزول للحيوان في الحمام ، وتوصيله بمبادل الطاقة ، واستخدام محول لتحويل الحركات الميكانيكية إلى إشارات كهربائية للتضخيم ، والتسجيل بواسطة مسجل فسيولوجي. يمكن قياس معلمات مختلفة مثل التردد ومتوسط سعة الاهتزاز والتوتر والمساحة تحت المنحنى لتقييم الوظيفة الحركية للأنبوب المعوي. توفر هذه الطريقة مزايا مثل البساطة والجدوى الاقتصادية وسهولة التحكم في الظروف التجريبية والحد الأدنى من العوامل المؤثرة والتكاثر العالي والنتائج الدقيقة والموثوقة. علاوة على ذلك ، فهو مفيد بشكل خاص للتحقيق في آلية عمل الدواء. ومع ذلك ، هناك تحديات ملحوظة في تشغيل تجربة الأنبوب المعوي المعزول ، على سبيل المثال ، يصعب الحفاظ على النشاط المعوي لفترة طويلة. لمعالجة هذه القضايا والاستفادة من التجارب في التجارب المختبرية ، ستوفر هذه الورقة مقدمة مفصلة للمشاكل الرئيسية في التشغيل التجريبي وتقدم بروتوكولا تجريبيا مرجعيا قيما لدراسة الأدوية التي تنظم حركية الجهاز الهضمي.

Protocol

هذا البروتوكول مشتق من الأدبيات المنشورة سابقا^{14،15،16،17}. تم استخدام ذكور فئران Sprague Dawley (SD) (260-300 جم ، 8-10 أسابيع) في هذه الدراسة. تمت مراجعة البروتوكول الحيواني والموافقة عليه من قبل لجنة الإدارة من جامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي (سجل رقم 2023017). قبل التجربة ، صدرت تعليمات للفئران بالصيام لمدة 24 ساعة. خلال التجربة ، تم الاحتفاظ بالفئران في غرفة وكان لها حرية الوصول إلى الطعام والماء.

1. إعداد الحل

1. تحضير محلول الملح الفسيولوجي (PSS) الذي يحتوي على 118 mM NaCl و 4.7 mM KCl و 2.5 mM CaCl₂ و 1.2 mM KH₂PO₄ و 1.2 mM MgCl₂∙6H₂O و 25 mM NaHCO₃ و 11 mM D-glucose و 5 mM HEPES (انظر جدول المواد).
2. تشبع المحاليل والفقاعة بغاز مختلط بنسبة 95٪ O₂ و 5٪ CO₂. وفي الوقت نفسه ، حافظ على قيم الأس الهيدروجيني للمحلول بين 7.38 و 7.42 مع 2 mM NaOH.
3. قم بتبريد 1/3 من PSS إلى 4 درجات مئوية وتسخين الباقي إلى 37 درجة مئوية للتجارب اللاحقة.
   ملاحظة: تم إعداد PSS في الأصل في درجة حرارة الغرفة في الخطوات 1.1-1.2

2. تشريح القناة المعوية للفئران

1. اجمع أطباق بتري المملوءة ب 4 درجات مئوية PSS وملاقط جراحية ومقص. تطبيق 2٪ إيزوفلوران لتخدير الجرذ عن طريق الاستنشاق لمدة 5 دقائق تقريبا. تحقق من أن الفئران مخدرة بعمق عن طريق إجراء اختبار قرصة إصبع القدم. إذا لزم الأمر ، يتم تطبيق أدوية تخدير إضافية. بعد ذلك ، فضح القناة المعوية عن طريق فتح تجويف البطن على طاولة العمليات.
2. ضع أنابيب المعدة والأمعاء بسرعة في طبق بتري مملوء ب 4 درجات مئوية PSS (درجة الحموضة 7.40) مع 95٪ O₂ و 5٪ CO₂ مشبع. حدد موقع الاثني عشر ، وهو بداية الأمعاء الدقيقة ، في البواب في المعدة. باستخدام الملقط ، ارفع الأنسجة المجاورة بدقة وقم بقصها بعناية بعيدا عن حافة الأمعاء بالمقص. بعد ذلك ، قسم الأمعاء إلى شرائح 1-2 سم ؛ هذه العملية برمتها موضحة في الشكل 1.

3. تعليق وتثبيت القناة المعوية (الشكل 2)

1. قم بتشغيل نظام تروية الأنسجة في المختبر واضبط درجة حرارة الحمام في الجهاز على 37 درجة مئوية. ضع PSS (37 درجة مئوية) في الحمام.
2. قم بإعداد خيط جراحي 15 سم (انظر جدول المواد) وانقعه في 4 درجات مئوية PSS مشبع بنسبة 95٪ O₂ + 5٪ CO₂. باستخدام الخيط ، قم بتأمين أحد طرفي القناة المعوية واستخدم خطاف إبرة فولاذي لتأمين الطرف الآخر.
3. تثبيت الأنبوب المعوي. قم بتركيب الجزء بخطاف الإبرة الفولاذي في الجزء السفلي من الحمام وقم بتوصيل الطرف الآخر من الخط الجراحي بمحول الطاقة. قم بتشغيل مفتاح الغاز للسماح للفقاعات بالظهور في الحمام.
4. افتح برنامج الحصول على البيانات (انظر جدول المواد) وانقر فوق ابدأ لضمان تسجيل إشارة المسار المقابلة.

4. التطبيع

1. قم بتدوير المحور الحلزوني للحمام عكس اتجاه عقارب الساعة لإرخاء الأنابيب المعوية إلى حالتها الطبيعية. انقر فوق Setup-Zero All Inputs للتأكد من ضبط التوتر الأولي للأنبوب المعوي على 0 جم في البرنامج.
2. قم بتدوير المحور الحلزوني للحمام عكس اتجاه عقارب الساعة لسحب قيمة التوتر إلى 1 جم وتثبيتها في الرقم الهيدروجيني = 7.40 ، 95٪ O₂ + 5٪ CO₂ مشبع 37 درجة مئوية PSS لمدة 30 دقيقة.
   ملاحظة: تطبيع الأنبوب المعوي هو ضبط التحميل المسبق إلى الحالة المثلى. بالنسبة لعينات التجاويف ، كان التحميل المسبق الأمثل ضروريا للحفاظ على نشاط استثنائي في المختبر. كان التحميل المسبق الأمثل لأنبوب الأمعاء الفئران 1 غرام¹⁸.

5. الكشف عن التفاعل

1. راقب موجات الانقباض التلقائي الإيقاعي في البرنامج وانتقل إلى التجربة التالية لأن هذا يشير إلى استجابة كافية.

6. الملاحظة التجريبية

1. أضف دواء الاختبار (مثل الأسيتيل كولين ، إلخ) إلى الحمام لدراسة تأثير الدواء على وظيفة الأنبوب المعوي.
   ملاحظة: تم تقييم تأثير الدواء من خلال مقارنة التغيرات قبل وبعد الإعطاء في منحنى انقباض الأمعاء. عند إضافة الدواء ، من المناسب زيادة الفقاعة لخلط الدواء ، ثم ضبط الفقاعة إلى وضعها الطبيعي بعد الخلط.

7. تحليل البيانات

ملاحظة: يحتوي نظام تروية الأنسجة في المختبر على أربع قنوات يمكنها إجراء اختبارات في وقت واحد على تأثيرات أربعة أدوية متطابقة أو مختلفة على أربعة أنابيب أمعاء. نظرا لأن المعلمات التجريبية وطرق التحليل هي نفسها لجميع القنوات ، يتم اختيار قناة واحدة كمثال لتحليل البيانات.

1. أوقف برنامج الحصول على البيانات وقم بإجراء تحليل البيانات على برنامج الحصول على البيانات هذا. قم بتحرير لوحة البيانات وحدد معلمات التحليل على النحو التالي: انقر فوق Window-Data Pad واختر متوسط التوتر للقناة.
2. حدد منحنى الانكماش قبل الإدارة وانقر فوق إضافة إلى لوحة البيانات ؛ حدد منحنى الانكماش بعد الإدارة وانقر فوق إضافة إلى لوحة البيانات. سيظهر متوسط قيمة التوتر قبل وبعد الإدارة على لوحة البيانات بدوره.
3. انقر فوق Window-Data Pad لنسخ البيانات إلى برامج التحليل الإحصائي الأخرى (انظر جدول المواد) للتحليل الإحصائي.
4. قم بتحليل المعلمات الأخرى ، مثل متوسط السعة ومتوسط التردد والتكامل (المنطقة الواقعة أسفل المنحنى) ، ما عليك سوى استبدال متوسط التوتر بالمعلمة المعنية ، والعملية هي نفسها الخطوات 6.1-6.3.
5. حفظ منحنى الانكماش: حدد منحنى الانكماش ، وانقر فوق تحرير نسخ بيانات Labchart لنسخ البيانات إلى برنامج الرسم (انظر جدول المواد) لرسم منحنى الانكماش.

8. العلاج بعد الجراحة

1. بعد الجراحة ، القتل الرحيم للحيوانات باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا.
   ملاحظة: بالنسبة للدراسة الحالية ، تم القتل الرحيم للحيوانات عن طريق استنشاق الأيزوفلوران الزائد.

النتائج

يركز الجزء الأول من الدراسة على عملية فصل الأنابيب المعوية المعزولة عن الجسم وتحويلها إلى أنابيب 2 سم في المختبر. هذه العملية موضحة بالتفصيل في الشكل 1. الجزء الثاني ينطوي على تعليق وتوحيد حلقة الأنبوب المعوي المعزولة. يتضح نجاح هذه العملية في

Discussion

يتم تحقيق حركية الجهاز الهضمي من خلال سلسلة من تقلصات العضلات الملساء المنسقة بدقة والاسترخاء. تتضمن هذه العملية تقلصا إيقاعيا لمجموعة واحدة من مجموعات العضلات ، وتقلصا منسقا لمجموعات متعددة ، وتقلصا دافعا خاصا ^20,21. قد يترافق حدوث اضطراب...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetylcholine	Sigma, USA	A6625
atropine	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	IA06501
Barium chloride	Macklin Biochemical Co.,Ltd.,Shanghai, China	B861682
CaCl2	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A501330
D-glucose	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A610219
drawing software	GraphPad Software, San Diego, California, USA	—
Epinephrine	Sigma, USA	E4642
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, China	S3872
In vitro tissue perfusion system	PowerLab, ADInstruments, Australia	ML0146
KCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100395
KH2PO4	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100781
LabChart Professional version 8.3	ADInstruments, Australia	—
MgCl2·6H2O	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100288
NaCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100241
NaHCO3	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100865
nifedipine	Macklin Biochemical Co.,Ltd.,Shanghai, China	N5087
statistical analysis software	GraphPad Software, San Diego, California, USA	—
Surgical sutures	Johnson, USA	—