שימוש במערכת זילוח רקמות חוץ גופית כדי לזהות את הפעילות התפקודית של צינורות מעי מבודדים בזמן אמת

Summary

אנו מציגים שיטה לבידוד צינורות מעיים של חולדות ולהערכת ההשפעה של תרופות על המתח, התדירות והמשרעת שלהן במבחנה. שיטה זו מציעה גישה רבת ערך לחוקרים החוקרים את צינורות המעי.

Abstract

מחלות במערכת העיכול, ששכיחותן גבוהה, מציבות אתגרים לא מבוטלים בפני בני אדם. המעי הדק הוא חלק בלתי נפרד מעיכול המזון והתרופות וספיגתו וממלא תפקיד מכריע בטיפול במחלות אלו. ניסוי תנועת צינור המעי, שיטה נפוצה וחיונית במבחנה , משמש לחקר הדינמיקה של מערכת העיכול. זה כולל את הכנת צינור המעי המבודד, כמו גם את ההשעיה של צינור המעי מוכן באמבטיה ואת החיבור שלה לגלאי אותות. זה ואחריו הקלטה וניתוח של סדרה של פרמטרים, כגון מתח, אשר ניתן להשתמש בהם כדי להעריך את תפקוד מוטורי המעי, כמו גם שיקולים לשמירה על צינור המעי פעיל במבחנה. התוכנית המתוקננת מהדגימה לאיסוף הנתונים משפרת מאוד את יכולת החזרה של נתוני הניסוי ומבטיחה את האותנטיות של רישום מתח המעי לאחר התערבות פיזיולוגית, פתולוגית ותרופתית. כאן אנו מציגים את הבעיות העיקריות בפעולה ניסיונית ופרוטוקול ניסויי ייחוס רב ערך לחקר תרופות המווסתות את תנועתיות מערכת העיכול.

Introduction

מחלות במערכת העיכול, מצב שכיח, משפיעות קשות על חיי אדם ובריאותו¹. הפרעת תנועתיות במערכת העיכול היא חלק חשוב ממחלות תפקודיות במערכת העיכול, המתבטאת בעיקר בתסמינים מתישים, עיכוב בריקון קיבה ובעיות קיבה קשות². זה יכול לשבש את תיאום מערכת העיכול, לעכב ריקון קיבה, להשפיע על אי סבילות למזון במעי, ואפילו לגרום לחסימה תפקודית במעי הדק או הגס³. עבור חולים שעוברים ניתוח במערכת העיכול, הפרעה זו יכולה להוביל ישירות לכשל מעיים. יתר על כן, הפרעת מעיים אינה קשורה רק למחלות במערכת העיכול אלא גם לגורמים פתוגניים של מחלות שונות אחרות, כגון הפטיטיס ומחלות מערכת העצבים המרכזית. קהילות חיידקי מעיים ממלאות תפקיד רגולטורי מכריע בפיזיולוגיה של המעי, כולל תנועתיות, אשר לאחר מכן משפיעה על התיישבות במערכת האקולוגית המיקרוביאלית⁴. ככל שזיהום בנגיף הפטיטיס B מתקדם להפטיטיס B כרונית, ישנן דרגות שונות של שינויים בפלורת המעיים. אפנון פלורת המעי הוכיח יתרונות בטיפול בנגיף הפטיטיס B⁵. בנוסף, מערכת העצבים המרכזית יכולה להשפיע על המעי ולשנות את הרכב החיידקים שלו. ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיית ריצוף המיקרופלורה חשפה אינטראקציות דו-כיווניות בין מיקרופלורת המעי לבין תפקוד מערכת העצבים המרכזית, הקשורות קשר הדוק עם התרחשות והתקדמות של מחלות מערכת העצבים המרכזית ^6,7.

עם הזדקנות החברה, שכיחות הפרעת תנועתיות מערכת העיכול מסלימה, קשורה לירידה או אובדן של תפקוד עצבי במערכת העצבים האנטרית ואת עצבוב פנימי של המעי⁸. ככל שההבנה שלנו של מחלות במערכת העיכול מתרחבת, רעיונות וגישות חדשים רבים מופיעים, מה שעשוי להוביל לפיתוחים חדשים של תרופות. עם זאת, רבים מהרעיונות הללו עדיין היפותטיים או ממתינים לתוצאות חיוביות של ניסויים קליניים כדי להתממש ^9,10. שיטות מחקר יעילות חיוניות להתגברות על מחלות במערכת העיכול. בשנים האחרונות התמקד מחקר נרחב בתרופות במערכת העיכול ובוויסות תנועתיות. תרופות במערכת העיכול ודינמיקה של מערכת העיכול הן בלתי נפרדות, ולתרופות סיסטמיות רבות אחרות יש השפעות שונות על הדינמיקה של מערכת העיכול. לדוגמה, תרופות נוגדות דלקת לא סטרואידיות (NSAIDs) משמשות לכאב ודלקת ולתנועה איטית של מערכת העיכול, מה שמגביר את הסיכון לכיב פפטי¹¹. מצד שני, תרופות נוגדות דיכאון מסוימות עשויות להשפיע על תנועתיות מערכת העיכול¹². כיום, הניסוי הפרמקולוגי העיקרי במבחנה החוקר את ההשפעות של תרופות במערכת העיכול ותרופות סיסטמיות אחרות על תנועתיות מערכת העיכול הוא בדיקת תנועת המעי במבחנה ¹³. על ידי סימולציה של מצבים פיזיולוגיים, הם צופים בהשפעה ישירה של תרופות על התכווצות שרירים חלקים במעיים והרפיה, ומעריכים את ההשפעות שלהם במערכת העיכול. עם זאת, הגורם המדויק להפרעות תנועתיות במערכת העיכול עדיין אינו ברור, ככל הנראה יחסי גומלין מורכבים של גורמים גנטיים, סביבתיים, תזונתיים ונוירואנדוקריניים. כתוצאה מכך, הטיפול בהפרעות תנועתיות במערכת העיכול ממשיך להוות אתגרים משמעותיים.

המעי הדק, בהיותו אתר חיוני לעיכול, ספיגה ומטבוליזם של תרופות, הוא בעל משמעות בתפקוד מערכת העיכול. כתוצאה מכך, בדיקת תנועת צינור המעי המבודד היא כלי חיוני לחקר מחלות במערכת העיכול. זה כרוך בהכנה והנחת צינור המעי המבודד של בעל החיים באמבטיה, חיבורו למחליף אנרגיה, שימוש במתמר להמרת תנועות מכניות לאותות חשמליים להגברה, והקלטה על ידי מקליט פיזיולוגי. ניתן למדוד פרמטרים שונים כגון תדירות, משרעת ממוצעת של רטט, מתח ושטח מתחת לעקומה כדי להעריך את התפקוד המוטורי של צינור המעי. שיטה זו מציעה יתרונות כגון פשטות, כדאיות כלכלית, שליטה קלה בתנאי הניסוי, גורמים משפיעים מינימליים, יכולת שחזור גבוהה ותוצאות מדויקות ואמינות. יתר על כן, זה שימושי במיוחד לחקר מנגנון הפעולה של סמים. עם זאת, ישנם אתגרים בולטים בהפעלת ניסוי צינור המעי המבודד, למשל, פעילות המעי קשה לשמור על זמן רב. כדי להתמודד עם בעיות אלה ולשאוב מניסיון בניסויים במבחנה , מאמר זה יספק מבוא מפורט לבעיות המפתח בתפעול הניסוי ויציג פרוטוקול ניסויי ייחוס רב ערך לחקר תרופות המווסתות את תנועתיות מערכת העיכול.

Protocol

פרוטוקול זה נגזר מספרות 14,15,16,17 שפורסמה בעבר. חולדות זכרים מסוג Sprague Dawley (SD) (260-300 גרם, בני 8-10 שבועות) שימשו במחקר הנוכחי. פרוטוקול בעלי החיים נבדק ואושר על ידי ועדת הניהול מאוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית (רשומה מס' 2023017). לפני הניסוי הונחו החולדות לצום במשך 24 שעות. במהלך הניסוי, החולדות הוחזקו בחדר בעלי חיים והייתה להן גישה חופשית למזון ומים.

1. הכנת פתרון

1. הכינו תמיסת מלח פיזיולוגית (PSS) המכילה 118 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 2.5 mM CaCl₂, 1.2 mM KH₂PO₄, 1.2 mM MgCl₂∙6H₂O, 25 mM NaHCO₃, 11 mM D-glucose ו-5 mM HEPES (ראו טבלת חומרים).
2. להרוות את התמיסות ולבעבע עם גז מעורב של 95% O₂ ו 5% CO₂. בינתיים, לשמור על ערכי ה- pH של התמיסה בין 7.38 ל 7.42 עם 2 mM NaOH.
3. מצננים מראש 1/3 מה-PSS ל-4°C ומחממים מראש את השאר ל-37°C לניסויים הבאים.
   הערה: PSS הוכן במקור בטמפרטורת החדר בשלבים 1.1-1.2

2. דיסקציה של תעלת המעי של חולדה

1. אספו צלחות פטרי מלאות ב-PSS בטמפרטורה של 4°C, פינצטה כירורגית ומספריים. מתן איזופלורן 2% להרדים את החולדה באמצעות שאיפה למשך כ-5 דקות. ודאו שהחולדה מורדמת עמוקות על ידי ביצוע בדיקת צביטת בוהן. במידת הצורך, לנהל הרדמה נוספת. לאחר מכן, לחשוף את תעלת המעי על ידי פתיחת חלל הבטן על שולחן ניתוחים.
2. הניחו במהירות את צינורות הקיבה והמעי בצלחת פטרי מלאה ב-4°C PSS (pH 7.40) עם רווי 95% O₂ ו-5% CO₂ . אתר את התריסריון, שהוא תחילת המעי הדק, בפילורוס של הבטן. בעזרת פינצטה, הרימו בעדינות את הרקמה הסמוכה וקצצו אותה בזהירות מקצה המעי בעזרת מספריים. לאחר מכן, לחלק את המעי למקטעים 1-2 ס"מ; כל התהליך הזה מומחש באיור 1.

3. השעיה וקיבוע של תעלת המעי (איור 2)

1. הפעל את מערכת זילוח רקמות החוץ גופית והתאם את טמפרטורת האמבטיה במכשיר ל -37 מעלות צלזיוס. הכניסו את ה-PSS (37°C) לאמבטיה.
2. הכינו תפר כירורגי בקוטר 15 ס"מ (ראו טבלת חומרים) והשרו אותו ב-PSS של 4°C הרווי ב-95% O₂ + 5% CO₂. באמצעות התפר, לאבטח קצה אחד של תעלת המעי ולהשתמש וו מחט פלדה כדי לאבטח את הקצה השני.
3. התקן את צינור המעי. הרכיבו את הקטע עם וו מחט הפלדה בתחתית האמבטיה וחברו את הקצה השני של קו הניתוח למתמר. הפעל את מתג הגז כדי לאפשר לבועות לצאת באמבטיה.
4. פתח את תוכנת רכישת הנתונים (ראה טבלת חומרים) ולחץ על התחל כדי לוודא שאות הנתיב המתאים מוקלט.

4. נורמליזציה

1. סובב את הציר הספירלי של האמבטיה נגד כיוון השעון כדי להרפות את צינורות המעי למצבם הטבעי. לחץ על Setup-Zero All Input כדי לוודא שהמתח הראשוני של צינור המעי מוגדר ל- 0 גרם בתוכנה.
2. סובב את הציר הספירלי של האמבטיה נגד כיוון השעון כדי למשוך את ערך המתח ל -1 גרם ולייצב אותו ב- pH = 7.40, 95% O₂ + 5% CO₂ רווי 37 ° C PSS למשך 30 דקות.
   הערה: הנורמליזציה של צינור המעי היא להתאים את preload שלה למצב אופטימלי. עבור דגימות חלל, היה צורך בעומס מקדים אופטימלי כדי לשמור על פעילות יוצאת דופן במבחנה. העומס האופטימלי מראש של צינור המעי של החולדה היה 1 גרם¹⁸.

5. זיהוי תגובתיות

1. התבונן בגלי ההתכווצות הספונטניים הקצובים בתוכנה והמשך לניסוי הבא מכיוון שזה מצביע על תגובה מספקת.

6. תצפית ניסויית

1. הוסף את תרופת הבדיקה (כגון אצטילכולין וכו ') לאמבטיה כדי ללמוד את השפעת התרופה על תפקוד צינור המעי.
   הערה: השפעת התרופה הוערכה על ידי השוואת שינויים לפני ואחרי מתן התרופה בעקומת התכווצות המעי. כאשר התרופה מתווספת, ראוי להגדיל את הבועה כדי לערבב את התרופה, ולאחר מכן להתאים את הבועה למצב נורמלי לאחר ערבוב.

7. ניתוח נתונים

הערה: למערכת זילוח רקמות חוץ גופית יש ארבעה ערוצים שיכולים לבצע בו זמנית בדיקות על ההשפעות של ארבע תרופות זהות או שונות על ארבעה צינורות מעי. מכיוון שהפרמטרים הניסיוניים ושיטות הניתוח זהים לכל הערוצים, נבחר ערוץ אחד כדוגמה לניתוח נתונים.

1. עצור את תוכנת רכישת הנתונים ובצע ניתוח נתונים בתוכנה זו לרכישת נתונים. ערוך את לוח הנתונים ובחר את פרמטרי הניתוח באופן הבא: לחץ על Window-Data Pad ובחר את המתח הממוצע עבור הערוץ.
2. בחר את עקומת ההתכווצות לפני הניהול ולחץ על הוסף ללוח הנתונים; בחר את עקומת ההתכווצות לאחר הניהול ולחץ על הוסף ללוח הנתונים. ערך המתח הממוצע לפני ואחרי הניהול יופיע בלוח הנתונים בתורו.
3. לחץ על Window-Data Pad כדי להעתיק נתונים לתוכנות ניתוח סטטיסטיות אחרות (ראה טבלת חומרים) לצורך ניתוח סטטיסטי.
4. נתח פרמטרים אחרים, כגון משרעת ממוצעת, תדירות ממוצעת ואינטגרל (שטח מתחת לעקומה), פשוט החלף את המתח הממוצע בפרמטר המתאים, והפעולה זהה לשלבים 6.1-6.3.
5. שמור עקומת התכווצות: בחר את עקומת ההתכווצות, לחץ על ערוך-העתק נתוני Labchart כדי להעתיק נתונים לתוכנת ציור (ראה טבלת חומרים) כדי לצייר את עקומת ההתכווצות.

8. טיפול לאחר הניתוח

1. לאחר הניתוח, יש להרדים את בעלי החיים בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי הממסד.
   הערה: במחקר הנוכחי, בעלי החיים הומתו על ידי שאיפת עודף איזופלורן.

תוצאות

חלקו הראשון של המחקר מתמקד בתהליך הפרדת צינורות המעי המבודדים מהגוף והפיכתם לצינורות בקוטר 2 ס"מ במבחנה. התהליך הזה מומחש בפירוט באיור 1. החלק השני כולל את ההשעיה ואת סטנדרטיזציה של טבעת צינור המעי המבודד. ההצלחה של התהליך הזה מודגמת באיור...

Discussion

תנועתיות מערכת העיכול מושגת על ידי סדרה של התכווצויות שרירים חלקים מתואמים במדויק והרפיה. תהליך זה כולל כיווץ ריתמי של קבוצה אחת של קבוצות שרירים, כיווץ מתואם של מספר קבוצות, וכיווץ הנעה מיוחד^20,21. התרחשות של הפרעות תנועתיות במערכת העיכול ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetylcholine	Sigma, USA	A6625
atropine	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	IA06501
Barium chloride	Macklin Biochemical Co.,Ltd.,Shanghai, China	B861682
CaCl2	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A501330
D-glucose	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A610219
drawing software	GraphPad Software, San Diego, California, USA	—
Epinephrine	Sigma, USA	E4642
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, China	S3872
In vitro tissue perfusion system	PowerLab, ADInstruments, Australia	ML0146
KCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100395
KH2PO4	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100781
LabChart Professional version 8.3	ADInstruments, Australia	—
MgCl2·6H2O	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100288
NaCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100241
NaHCO3	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100865
nifedipine	Macklin Biochemical Co.,Ltd.,Shanghai, China	N5087
statistical analysis software	GraphPad Software, San Diego, California, USA	—
Surgical sutures	Johnson, USA	—