In vitro Tissue Perfusion System을 사용하여 분리된 장관의 기능적 활동을 실시간으로 감지

요약

쥐의 장관을 분리하고 약물이 시험관 내에서 장력, 빈도 및 진폭에 미치는 영향을 평가하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 장관을 조사하는 연구자에게 유용한 접근 방식을 제공합니다.

초록

발병률이 높은 위장 질환은 인간에게 상당한 문제를 제기합니다. 소장은 식품과 약물의 소화 및 흡수에 필수적이며 이러한 질병을 치료하는 데 중요한 역할을 합니다. 일반적이고 필수적인 체외 방법인 장 이동 실험은 위장 역학을 연구하는 데 활용됩니다. 여기에는 격리 된 장관의 준비뿐만 아니라 준비된 장관을 욕조에 현탁시키고 신호 감지기에 연결하는 것이 포함됩니다. 그 다음에는 장 운동 기능을 평가하는 데 사용할 수 있는 장력과 같은 일련의 매개변수를 기록하고 분석하며, 시험 관 내에서 장을 활성 상태로 유지하기 위한 고려 사항을 확인합니다. 샘플링에서 데이터 수집에 이르는 표준화된 프로그램은 실험 데이터의 반복성을 크게 향상시키고 생리학적, 병리학적, 약물적 개입 후 장 긴장 기록의 신뢰성을 보장합니다. 여기에서 우리는 실험 운영의 주요 문제와 위장 운동성을 조절하는 약물을 연구하기 위한 귀중한 참조 실험 프로토콜을 제시합니다.

서문

널리 퍼진 질환인 위장 질환은 인간의 삶과 건강에 심각한 영향을 미칩니다¹. 위장관 운동성 장애는 기능성 위장관 질환의 중요한 부분으로, 주로 쇠약 증상, 위 배출 지연, 심각한 위 문제 등으로 나타난다². 이는 위장 협응을 방해하고, 위 배출을 방해하며, 장내 음식 과민증에 영향을 미치고, 소장 또는 대장의 기능 장애를 유발할 수 있습니다³. 위장관 수술을 받는 환자의 경우, 이 질환은 장 부전으로 직결될 수 있습니다. 또한, 장 질환은 위장 질환뿐만 아니라 간염 및 중추 신경계 질환과 같은 다양한 다른 질병의 발병 인자와도 관련이 있습니다. 장내 미생물 군집은 운동성을 포함한 장 생리학에서 중요한 조절 역할을 하며, 이는 결과적으로 미생물 생태계 내 집락화에 영향을 미친다⁴. B형 간염 바이러스 감염이 만성 B형 간염으로 진행됨에 따라 장내 세균총의 변화 정도는 다양합니다. 장내 세균총을 조절하는 것은 B형 간염 바이러스 치료에 도움이 되는 것으로 입증되었다⁵. 또한 중추 신경계는 장에 영향을 미치고 미생물 구성을 변경할 수 있습니다. 최근 미생물 염기서열 분석 기술의 발전으로 장내 미생물과 중추신경계 기능 사이의 양방향 상호작용이 밝혀졌으며, 이는 중추신경계 질환의 발생 및 진행과 밀접한 관련이 있습니다 ^6,7.

사회의 고령화에 따라 위장 운동 장애의 발병률이 증가하고 있으며, 이는 장 신경계의 신경 기능 저하 또는 상실 및 장의 내재적 신경 분포와 관련이 있다⁸. 위장 질환에 대한 이해가 넓어짐에 따라 수많은 새로운 아이디어와 접근 방식이 등장하여 잠재적으로 새로운 약물 개발로 이어질 수 있습니다. 그러나 이러한 아이디어 중 다수는 여전히 가설이거나 ^9,10을 구체화하기 위해 긍정적인 임상 시험 결과를 기다리고 있습니다. 효과적인 연구 방법은 위장 질환을 극복하는 데 매우 중요합니다. 최근 몇 년 동안 위장관 약물과 운동 조절에 대한 광범위한 연구가 집중되었습니다. 위장 약물과 위장 역학은 불가분의 관계이며, 다른 많은 전신 약물은 위장 역학에 다양한 영향을 미칩니다. 예를 들어, 비스테로이드성 항염증제(NSAIDs)는 통증과 염증, 느린 위장관 운동에 사용되어 소화성 궤양의 위험을 높인다¹¹. 반면에, 일부 항우울제는 위장 운동성에 영향을 미칠 수 있다¹². 현재 위장관 약물 및 기타 전신 약물이 위장 운동성에 미치는 영향을 연구하는 주요 in vitro pharmacological experiment는 in vitro intestine movement assay¹³입니다. 그들은 생리학적 조건을 시뮬레이션하여 약물이 장 평활근 수축 및 이완에 미치는 직접적인 영향을 관찰하고 위장 효과를 평가합니다. 그러나 위장 운동 장애의 정확한 원인은 불분명하며, 유전적, 환경적, 식이요법 및 신경내분비 요인의 복잡한 상호 작용일 가능성이 있습니다. 결과적으로, 위장 운동 장애의 치료는 계속해서 상당한 도전을 제기하고 있습니다.

소장은 소화, 흡수 및 약물 대사에 중요한 부위로서 위장 기능에 중요한 역할을 합니다. 결과적으로 고립된 장관의 움직임 검사는 위장 질환을 연구하는 데 필수적인 도구입니다. 여기에는 동물의 분리된 장관을 준비하여 욕조에 넣고, 에너지 교환기에 연결하고, 변환기를 사용하여 기계적 움직임을 증폭을 위한 전기 신호로 변환하고, 생리학적 레코더로 기록하는 것이 포함됩니다. 주파수, 진동의 평균 진폭, 장력 및 곡선 아래 면적과 같은 다양한 매개변수를 측정하여 장관의 운동 기능을 평가할 수 있습니다. 이 방법은 단순성, 경제적 타당성, 실험 조건의 손쉬운 제어, 최소한의 영향 요인, 높은 재현성 및 정확하고 신뢰할 수 있는 결과와 같은 이점을 제공합니다. 또한 약물 작용 메커니즘을 조사하는 데 특히 유용합니다. 그러나 고립된 장관관 실험의 운영에는 주목할 만한 문제가 있는데, 예를 들어 장 활동을 오랫동안 유지하기 어렵다는 것입니다. 이러한 문제를 해결하고 체외 실험 경험을 바탕으로 이 논문은 실험 운영의 주요 문제에 대한 자세한 소개를 제공하고 위장 운동성을 조절하는 약물을 연구하기 위한 귀중한 참조 실험 프로토콜을 제시합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 이전에 발표된 문헌 ^14,15,16,17에서 파생되었습니다. 본 연구에는 수컷 Sprague Dawley (SD) 랫트(260-300g, 8-10주령)가 사용되었습니다. 동물 프로토콜은 Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (기록 번호 2023017)의 관리 위원회에서 검토하고 승인했습니다. 실험에 앞서, 쥐들은 24시간 동안 금식하도록 지시받았다. 실험 기간 동안 쥐들은 동물의 방에 갇혀 있었고 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있었다.

1. 솔루션 준비

1. 118 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 2.5 mM CaCl₂, 1.2 mM KH₂PO₄ , 1.2 mM MgCl₂∙6H₂O, 25 mM NaHCO₃, 11 mM D- 글루코스 및 5 mM HEPES를 함유하는 생리염 용액 (PSS)을 제조합니다 ( 재료 표 참조).
2. 용액을 포화시키고 95 % O₂ 및 5 % CO₂ 의 혼합 가스로 기포시킵니다. 한편, 2mM NaOH로 7.38에서 7.42 사이의 용액의 pH 값을 유지하십시오.
3. 후속 실험을 위해 PSS의 1/3을 4°C로 예냉각하고 나머지를 37°C로 예열합니다.
   참고: PSS는 원래 1.1-1.2단계에서 실온에서 준비되었습니다.

2. 쥐의 창자 절제

1. 4°C PSS로 채워진 페트리 접시, 수술용 핀셋 및 가위를 모읍니다. 2% 이소플루란을 투여하여 약 5분 동안 흡입을 통해 쥐를 마취시킵니다. 발가락 꼬집기 테스트를 수행하여 쥐가 깊이 마취되었는지 확인합니다. 필요한 경우 추가 마취제를 투여하십시오. 다음으로, 수술대에서 복강을 열어 장관을 노출시킵니다.
2. 4 % O₂ 및 95 % CO 2 및 5 % CO₂ 로 채워진 7.40 ° C PSS (pH 5)로 채워진 페트리 접시에 위와 장 튜브를 빠르게 놓습니다. 소장의 시작 부분인 십이지장(duodenum)을 위의 유문(pylorus)에 위치시킵니다. 핀셋을 사용하여 인접한 조직을 섬세하게 들어 올리고 가위로 장 가장자리에서 조심스럽게 잘라냅니다. 그 후, 장을 1-2cm 세그먼트로 나눕니다. 이 전체 프로세스는 그림 1에 나와 있습니다.

3. 장관의 현탁 및 고정(그림 2)

1. 체외 조직 관류 시스템을 켜고 기기의 수조 온도를 37°C로 조정합니다. PSS(37°C)를 욕조에 넣습니다.
2. 15cm 수술용 봉합사( 재료 표 참조)를 준비하고 4% O₂ + 95% CO₂로 포화된 5°C PSS에 담그십시오. 봉합사를 사용하여 장관의 한쪽 끝을 고정하고 강철 바늘 고리를 사용하여 다른 쪽 끝을 고정합니다.
3. 장 튜브를 설치합니다. 수조 바닥에 있는 강철 바늘 고리로 세그먼트를 장착하고 수술 라인의 다른 쪽 끝을 변환기에 부착합니다. 가스 스위치를 켜서 욕조에 거품이 나올 수 있도록 합니다.
4. 데이터 수집 소프트웨어를 열고( 재료 표 참조) 시작을 클릭하여 해당 경로 신호가 기록되고 있는지 확인합니다.

4. 정규화

1. 욕조의 나선형 축을 시계 반대 방향으로 회전하여 장관을 자연 상태로 이완시킵니다. Setup-Zero All Inputs 를 클릭하여 소프트웨어에서 장관의 초기 장력이 0g 으로 설정되어 있는지 확인합니다.
2. 수조의 나선형 축을 시계 반대 방향으로 회전시켜 장력 값을 1g 으로 당기고 pH = 7.40, 95%_O2 + 5% CO₂ 포화 37°C PSS에서 30분 동안 안정화시킵니다.
   참고: 장관의 정상화는 예압을 최적의 상태로 조정하는 것입니다. 캐비티 샘플의 경우, in vitro에서 탁월한 활성을 유지하기 위해 최적의 예압이 필요했습니다. 쥐의 장관의 최적 예압은 1g¹⁸이었다.

5. 반응성 감지

1. 소프트웨어에서 리드미컬한 자발적 수축파를 관찰하고 충분한 반응을 나타내므로 다음 실험을 진행하십시오.

6. 실험적 관찰

1. 시험약(예: 아세틸콜린 등)을 욕조에 첨가하여 약물이 장관 기능에 미치는 영향을 연구합니다.
   참고: 약물의 효과는 장 수축 곡선에서 투여 전과 후의 변화를 비교하여 평가되었습니다. 약물을 첨가할 때는 기포를 높여 약물을 혼합한 후 배합 후 기포를 정상으로 조정하는 것이 적절합니다.

7. 데이터 분석

참고: 체외 조직 관류 시스템에는 4개의 장이 튜브에 대한 4개의 동일하거나 다른 약물의 효과에 대한 테스트를 동시에 수행할 수 있는 4개의 채널이 있습니다. 실험 파라미터와 분석 방법은 모든 채널에서 동일하기 때문에 데이터 분석을 위한 예로 하나의 채널을 선택합니다.

1. 데이터 수집 소프트웨어를 중지하고 이 데이터 수집 소프트웨어에서 데이터 분석을 수행합니다. 데이터 보드를 편집하고 다음과 같이 분석 매개 변수를 선택하십시오. Window-Data Pad를 클릭하고 채널의 평균 장력을 선택합니다.
2. 관리하기 전에 수축 곡선을 선택하고 데이터 패드에 추가를 클릭하십시오. 관리 후 수축 곡선을 선택하고 데이터 패드에 추가를 클릭합니다. 투여 전후의 평균 장력 값이 데이터 패드에 차례로 나타납니다.
3. Window-Data Pad를 클릭하여 통계 분석을 위해 데이터를 다른 통계 분석 소프트웨어(재료 표 참조)로 복사합니다.
4. 평균 진폭, 평균 주파수 및 적분(곡선 아래 면적)과 같은 다른 매개변수를 분석하고 평균 장력을 해당 매개변수로 교체하기만 하면 작동은 6.1-6.3단계와 동일합니다.
5. 수축 곡선 저장: 수축 곡선을 선택하고 Labchart Data 편집-복사 를 클릭하여 데이터를 도면 소프트웨어( 재료 표 참조)로 복사하여 수축 곡선을 그립니다.

8. 수술 후 치료

1. 수술 후에는 기관에서 승인한 프로토콜에 따라 동물을 안락사시킵니다.
   참고: 본 연구를 위해 동물은 과도한 이소플루란을 흡입하여 안락사시켰습니다.

결과

연구의 첫 번째 부분은 신체에서 분리된 장 튜브를 분리하여 체외에서 2cm 튜브로 변환하는 과정에 중점을 둡니다. 이 프로세스는 그림 1에 자세히 설명되어 있습니다. 두 번째 부분은 고립된 장 튜브 링의 현탁 및 표준화와 관련이 있습니다. 이 과정의 성공은 그림 2에서 입증되며, 이는 정상 튜브의 자동 리듬 수축을 보?...

토론

위장 운동성은 정밀하게 조정된 일련의 평활근 수축과 이완에 의해 이루어집니다. 이 과정에는 한 그룹의 근육 그룹의 리드미컬 수축, 여러 그룹의 조정 수축 및 특수 추진 수축이 포함됩니다^20,21. 위장 운동 장애의 발생은 중추 신경계, 자율 신경계, 장 신경계 및 위장 평활근과 같은 다양한 수준의 기능 장애와 관련이 있을 수 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetylcholine	Sigma, USA	A6625
atropine	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	IA06501
Barium chloride	Macklin Biochemical Co.,Ltd.,Shanghai, China	B861682
CaCl2	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A501330
D-glucose	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A610219
drawing software	GraphPad Software, San Diego, California, USA	—
Epinephrine	Sigma, USA	E4642
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, China	S3872
In vitro tissue perfusion system	PowerLab, ADInstruments, Australia	ML0146
KCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100395
KH2PO4	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100781
LabChart Professional version 8.3	ADInstruments, Australia	—
MgCl2·6H2O	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100288
NaCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100241
NaHCO3	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100865
nifedipine	Macklin Biochemical Co.,Ltd.,Shanghai, China	N5087
statistical analysis software	GraphPad Software, San Diego, California, USA	—
Surgical sutures	Johnson, USA	—