Utilizzo di un sistema di perfusione tissutale in vitro per rilevare le attività funzionali dei tubi intestinali isolati in tempo reale

Riepilogo

Presentiamo un metodo per isolare i tubi intestinali di ratto e valutare l'impatto dei farmaci sulla loro tensione, frequenza e ampiezza in vitro. Questo metodo offre un approccio prezioso per i ricercatori che studiano i tubi intestinali.

Abstract

Le malattie gastrointestinali, che hanno un'elevata incidenza, rappresentano sfide considerevoli per l'uomo. L'intestino tenue è parte integrante della digestione e dell'assorbimento di alimenti e farmaci e svolge un ruolo cruciale nel trattamento di queste malattie. L'esperimento del movimento del tubo intestinale, un metodo in vitro comune ed essenziale, viene utilizzato per studiare la dinamica gastrointestinale. Ciò include la preparazione del tubo intestinale isolato, nonché la sospensione del tubo intestinale preparato nella vasca da bagno e il suo collegamento a un rilevatore di segnale. Segue la registrazione e l'analisi di una serie di parametri, come la tensione, che possono essere utilizzati per valutare la funzione motoria intestinale, nonché le considerazioni per mantenere attivo il tubo intestinale in vitro. Il programma standardizzato dal campionamento alla raccolta dei dati migliora notevolmente la ripetibilità dei dati sperimentali e garantisce l'autenticità della registrazione della tensione intestinale dopo interventi fisiologici, patologici e farmacologici. Qui presentiamo le principali problematiche in fase sperimentale e un valido protocollo sperimentale di riferimento per lo studio di farmaci che regolano la motilità gastrointestinale.

Introduzione

Le malattie gastrointestinali, una condizione prevalente, hanno un grave impatto sulla vita e sulla salute umana¹. Il disturbo della motilità gastrointestinale è una parte importante delle malattie gastrointestinali funzionali, che si manifesta principalmente con sintomi debilitanti, svuotamento gastrico ritardato e gravi problemi gastrici². Può interrompere la coordinazione gastrointestinale, ostacolare lo svuotamento gastrico, influire sull'intolleranza alimentare intestinale e persino causare ostruzione funzionale nell'intestino tenue o^crasso. Per i pazienti sottoposti a chirurgia gastrointestinale, questo disturbo può portare direttamente all'insufficienza intestinale. Inoltre, i disturbi intestinali non sono solo correlati alle malattie gastrointestinali, ma anche ai fattori patogeni di varie altre malattie, come l'epatite e le malattie del sistema nervoso centrale. Le comunità microbiche intestinali svolgono un ruolo cruciale nella fisiologia intestinale, compresa la motilità, che successivamente influenza la colonizzazione all'interno dell'ecosistema microbico⁴. Man mano che l'infezione da virus dell'epatite B progredisce verso l'epatite B cronica, ci sono vari gradi di cambiamenti nella flora intestinale. La modulazione della flora intestinale ha dimostrato benefici nel trattamento del virus dell'epatite B⁵. Inoltre, il sistema nervoso centrale può influenzare l'intestino e alterarne la composizione microbica. I recenti progressi nella tecnologia di sequenziamento della microflora hanno scoperto interazioni bidirezionali tra la microflora intestinale e la funzione del sistema nervoso centrale, strettamente associate all'insorgenza e alla progressione delle malattie del sistema nervoso centrale ^6,7.

Con l'invecchiamento della società, l'incidenza del disturbo della motilità gastrointestinale è in aumento, legato al declino o alla perdita della funzione neuronale nel sistema nervoso enterico e nell'innervazione intrinseca dell'intestino⁸. Man mano che la nostra comprensione delle malattie gastrointestinali si amplia, emergono numerose nuove idee e approcci, che potenzialmente portano allo sviluppo di nuovi farmaci. Tuttavia, molte di queste idee sono ancora ipotetiche o attendono risultati positivi degli studi clinici per concretizzarsi ^9,10. Metodi di ricerca efficaci sono fondamentali per superare le malattie gastrointestinali. Negli ultimi anni, un'ampia ricerca si è concentrata sui farmaci gastrointestinali e sulla regolazione della motilità. I farmaci gastrointestinali e le dinamiche gastrointestinali sono inseparabili e molti altri farmaci sistemici hanno effetti variabili sulle dinamiche gastrointestinali. Ad esempio, i farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS) sono utilizzati per il dolore e l'infiammazione e per rallentare il movimento gastrointestinale, aumentando il rischio di ulcera peptica¹¹. D'altra parte, alcuni antidepressivi possono influenzare la motilità gastrointestinale¹². Attualmente, il principale esperimento farmacologico in vitro che studia gli effetti dei farmaci gastrointestinali e di altri farmaci sistemici sulla motilità gastrointestinale è il saggio di movimento intestinale in vitro ¹³. Simulando le condizioni fisiologiche, osservano l'impatto diretto dei farmaci sulla contrazione e sul rilassamento della muscolatura liscia intestinale, valutandone gli effetti gastrointestinali. Tuttavia, la causa precisa dei disturbi della motilità gastrointestinale rimane poco chiara, probabilmente una complessa interazione di fattori genetici, ambientali, dietetici e neuroendocrini. Di conseguenza, il trattamento dei disturbi della motilità gastrointestinale continua a porre sfide significative.

L'intestino tenue, essendo un sito cruciale per la digestione, l'assorbimento e il metabolismo dei farmaci, ha un'importanza significativa nella funzione gastrointestinale. Di conseguenza, il test del movimento del tubo intestinale isolato è uno strumento essenziale per lo studio delle malattie gastrointestinali. Ciò comporta la preparazione e il posizionamento del tubo intestinale isolato dell'animale in un bagno, il collegamento a uno scambiatore di energia, l'utilizzo di un trasduttore per convertire i movimenti meccanici in segnali elettrici per l'amplificazione e la registrazione da parte di un registratore fisiologico. Vari parametri come la frequenza, l'ampiezza media della vibrazione, la tensione e l'area sotto la curva possono essere misurati per valutare la funzione motoria del tubo intestinale. Questo metodo offre vantaggi quali semplicità, fattibilità economica, facile controllo delle condizioni sperimentali, fattori di influenza minimi, elevata riproducibilità e risultati accurati e affidabili. Inoltre, è particolarmente utile per studiare il meccanismo d'azione dei farmaci. Tuttavia, ci sono notevoli sfide nel funzionamento dell'esperimento del tubo intestinale isolato, ad esempio, l'attività intestinale è difficile da mantenere a lungo. Per affrontare questi problemi e attingere alle esperienze negli esperimenti in vitro , questo articolo fornirà un'introduzione dettagliata ai problemi chiave nel funzionamento sperimentale e presenterà un valido protocollo sperimentale di riferimento per lo studio di farmaci che regolano la motilità gastrointestinale.

Protocollo

Questo protocollo è derivato dalla letteratura precedentemente pubblicata 14,15,16,17. Per il presente studio sono stati utilizzati ratti maschi Sprague Dawley (SD) (260-300 g, 8-10 settimane di età). Il protocollo sugli animali è stato rivisto e approvato dal Comitato di Gestione dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu (Record No. 2023017). Prima dell'esperimento, i ratti sono stati istruiti a digiunare per 24 ore. Durante l'esperimento, i ratti sono stati tenuti in una camera per animali e hanno avuto libero accesso a cibo e acqua.

1. Preparazione della soluzione

1. Preparare una soluzione salina fisiologica (PSS) contenente 118 mM di NaCl, 4,7 mM di KCl, 2,5 mM di CaCl₂, 1,2 mM di KH₂PO₄, 1,2 mM di MgCl₂∙6H₂O, 25 mM di NaHCO₃, 11 mM di D-glucosio e 5 mM di HEPES (vedere la Tabella dei materiali).
2. Saturare le soluzioni e far bollire con un gas misto di 95% O₂ e 5% CO₂. Nel frattempo, mantenere i valori di pH della soluzione tra 7,38 e 7,42 con 2 mM di NaOH.
3. Preraffreddare 1/3 del PSS a 4 °C e preriscaldare il resto a 37 °C per gli esperimenti successivi.
   NOTA: il PSS è stato originariamente preparato a temperatura ambiente nei passaggi 1.1-1.2

2. Dissezione del canale intestinale di ratto

1. Raccogli piastre di Petri riempite con PSS a 4°C, pinzette chirurgiche e forbici. Somministrare isoflurano al 2% per anestetizzare il ratto attraverso l'inalazione per circa 5 minuti. Verificare che il ratto sia profondamente anestetizzato conducendo un test di pizzicamento delle dita. Se necessario, somministrare ulteriori anestetici. Successivamente, esporre il canale intestinale aprendo la cavità addominale su un tavolo operatorio.
2. Posizionare rapidamente i tubi dello stomaco e dell'intestino in una capsula di Petri riempita con PSS a 4 °C (pH 7,40) con il 95% di O₂ e il 5% di CO₂ saturi. Individua il duodeno, che è l'inizio dell'intestino tenue, nel piloro dello stomaco. Usando una pinzetta, solleva delicatamente il tessuto adiacente e taglialo con cura lontano dal bordo dell'intestino con le forbici. Successivamente, dividere l'intestino in segmenti di 1-2 cm; l'intero processo è illustrato nella Figura 1.

3. Sospensione e fissazione del canale intestinale (Figura 2)

1. Accendere il sistema di perfusione tissutale in vitro e regolare la temperatura del bagno nello strumento a 37 °C. Introdurre il PSS (37 °C) nella vasca da bagno.
2. Preparare una sutura chirurgica di 15 cm (vedi Tabella dei Materiali) e immergerla in PSS a 4 °C cioè satura con il 95% di O₂ + 5% di CO₂. Usando la sutura, fissare un'estremità del canale intestinale e utilizzare un gancio per aghi in acciaio per fissare l'altra estremità.
3. Installare il tubo intestinale. Montare il segmento con il gancio dell'ago in acciaio sul fondo della vasca e fissare l'altra estremità della linea chirurgica al trasduttore. Accendere l'interruttore del gas per consentire alle bolle di emergere nella vasca da bagno.
4. Aprire il software di acquisizione dati (vedere la Tabella dei materiali) e fare clic su Avvia per assicurarsi che il segnale di percorso corrispondente venga registrato.

4. Normalizzazione

1. Ruotare l'asse a spirale del bagno in senso antiorario per rilassare i tubi intestinali al loro stato naturale. Fare clic su Setup-Zero All Inputs per assicurarsi che la tensione iniziale del tubo intestinale sia impostata su 0 g nel software.
2. Ruotare l'asse a spirale del bagno in senso antiorario per portare il valore di tensione a 1 g e stabilizzarlo nel pH = 7,40, 95% O₂ + 5% CO₂ saturo 37 °C PSS per 30 min.
   NOTA: La normalizzazione del tubo intestinale serve a regolare il suo precarico a uno stato ottimale. Per i campioni di cavità, era necessario un precarico ottimale per mantenere un'attività eccezionale in vitro. Il precarico ottimale del tubo intestinale di ratto era di 1 g¹⁸.

5. Rilevamento della reattività

1. Osservare le onde di contrazione ritmiche spontanee nel software e procedere all'esperimento successivo poiché ciò indica una risposta sufficiente.

6. Osservazione sperimentale

1. Aggiungere il farmaco in esame (come l'acetilcolina, ecc.) al bagno per studiare l'effetto del farmaco sulla funzione del tubo intestinale.
   NOTA: L'effetto del farmaco è stato valutato confrontando i cambiamenti pre e post somministrazione nella curva di costrizione intestinale. Quando il farmaco viene aggiunto, è opportuno aumentare la bolla per mescolare il farmaco, quindi regolare la bolla alla normalità dopo la miscelazione.

7. Analisi dei dati

NOTA: Il sistema di perfusione tissutale in vitro ha quattro canali che possono condurre simultaneamente test sugli effetti di quattro farmaci identici o diversi su quattro provette intestinali. Poiché i parametri sperimentali e i metodi di analisi sono gli stessi per tutti i canali, un canale viene selezionato come esempio per l'analisi dei dati.

1. Arrestare il software di acquisizione dati ed eseguire l'analisi dei dati su questo software di acquisizione dati. Modificare la scheda dati e selezionare i parametri di analisi come segue: Fare clic su Window-Data Pad e scegliere la tensione media per il canale.
2. Selezionare la curva di contrazione prima della somministrazione e fare clic su Aggiungi al data pad; selezionare la curva di contrazione dopo la somministrazione e fare clic su Aggiungi al data pad. Il valore medio di tensione prima e dopo la somministrazione apparirà a turno sul data pad.
3. Fare clic su Window-Data Pad per copiare i dati su altri software di analisi statistica (vedere la Tabella dei materiali) per l'analisi statistica.
4. Analizza altri parametri, come l'ampiezza media, la frequenza media e l'integrale (area sotto la curva), sostituisci semplicemente la tensione media con il rispettivo parametro e l'operazione è la stessa dei passaggi 6.1-6.3.
5. Salva curva di contrazione: Seleziona la curva di contrazione, fai clic su Modifica-Copia dati Labchart per copiare i dati nel software di disegno (vedi la Tabella dei materiali) per disegnare la curva di contrazione.

8. Trattamento post-chirurgico

1. Dopo l'intervento chirurgico, sopprimere gli animali seguendo protocolli approvati istituzionalmente.
   NOTA: Per il presente studio, gli animali sono stati soppressi inalando un eccesso di isoflurano.

Risultati

La prima parte dello studio si concentra sul processo di separazione dei tubi intestinali isolati dal corpo e sulla loro conversione in tubi di 2 cm in vitro. Questo processo è illustrato in dettaglio nella Figura 1. La seconda parte prevede la sospensione e la standardizzazione dell'anello del tubo intestinale isolato. Il successo di questo processo è dimostrato nella Figura 2, che mostra la contrazione ritmica autom...

Discussione

La motilità gastrointestinale è ottenuta da una serie di contrazioni e rilassamenti della muscolatura liscia coordinati con precisione. Questo processo comporta la contrazione ritmica di un gruppo di gruppi muscolari, la contrazione coordinata di più gruppi e la speciale contrazione propulsiva^20,21. L'insorgenza di disturbi della motilità gastrointestinale può essere associata a disfunzioni a diversi livelli, come il sistema...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetylcholine	Sigma, USA	A6625
atropine	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	IA06501
Barium chloride	Macklin Biochemical Co.,Ltd.,Shanghai, China	B861682
CaCl2	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A501330
D-glucose	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A610219
drawing software	GraphPad Software, San Diego, California, USA	—
Epinephrine	Sigma, USA	E4642
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, China	S3872
In vitro tissue perfusion system	PowerLab, ADInstruments, Australia	ML0146
KCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100395
KH2PO4	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100781
LabChart Professional version 8.3	ADInstruments, Australia	—
MgCl2·6H2O	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100288
NaCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100241
NaHCO3	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100865
nifedipine	Macklin Biochemical Co.,Ltd.,Shanghai, China	N5087
statistical analysis software	GraphPad Software, San Diego, California, USA	—
Surgical sutures	Johnson, USA	—