İzole Edilmiş Bağırsak Tüplerinin Fonksiyonel Aktivitelerini Gerçek Zamanlı Olarak Tespit Etmek için İn Vitro Doku Perfüzyon Sistemi Kullanma

Özet

Sıçan bağırsak tüplerini izole etmek ve ilaçların gerginlik, frekans ve amplitüd üzerindeki etkisini in vitro olarak değerlendirmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, bağırsak tüplerini araştıran araştırmacılar için değerli bir yaklaşım sunmaktadır.

Özet

Görülme sıklığı yüksek olan gastrointestinal hastalıklar, insanlar için önemli zorluklar oluşturmaktadır. İnce bağırsak, gıda ve ilaç sindirimi ve emiliminin ayrılmaz bir parçasıdır ve bu hastalıkların tedavisinde çok önemli bir rol oynar. Gastrointestinal dinamikleri incelemek için yaygın ve temel bir in vitro yöntem olan bağırsak tüpü hareket deneyi kullanılır. Bu, izole edilmiş bağırsak tüpünün hazırlanmasının yanı sıra hazırlanan bağırsak tüpünün banyoda askıya alınmasını ve bir sinyal dedektörüne bağlanmasını içerir. Bunu, bağırsak motor fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılabilecek gerginlik gibi bir dizi parametrenin kaydedilmesi ve analizinin yanı sıra bağırsak tüpünü in vitro olarak aktif tutmaya yönelik hususlar takip eder. Örneklemeden veri toplamaya kadar standartlaştırılmış program, deneysel verilerin tekrarlanabilirliğini büyük ölçüde artırır ve fizyolojik, patolojik ve ilaç müdahalesinden sonra bağırsak gerginliğinin kaydının gerçekliğini sağlar. Burada, deneysel çalışmadaki temel sorunları ve gastrointestinal motiliteyi düzenleyen ilaçları incelemek için değerli bir referans deneysel protokol sunuyoruz.

Giriş

Yaygın bir durum olan mide-bağırsak hastalıkları, insan hayatını ve sağlığını ciddi şekilde etkilemektedir¹. Gastrointestinal motilite bozukluğu, fonksiyonel gastrointestinal hastalıkların önemli bir parçasıdır ve öncelikle zayıflatıcı semptomlar, gecikmiş mide boşalması ve ciddi mide sorunları ile kendini gösterir². Gastrointestinal koordinasyonu bozabilir, mide boşalmasını engelleyebilir, bağırsak gıda intoleransını etkileyebilir ve hatta ince veya kalın bağırsakta fonksiyonel tıkanıklığa neden olabilir³. Gastrointestinal cerrahi geçiren hastalar için bu bozukluk doğrudan bağırsak yetmezliğine yol açabilir. Ayrıca, bağırsak bozukluğu sadece gastrointestinal hastalıklarla değil, aynı zamanda hepatit ve merkezi sinir sistemi hastalıkları gibi diğer çeşitli hastalıkların patojenik faktörleriyle de ilgilidir. Bağırsak mikrobiyal toplulukları, daha sonra mikrobiyal ekosistem içindeki kolonizasyonu etkileyen motilite de dahil olmak üzere bağırsak fizyolojisinde çok önemli bir düzenleyici rol oynar⁴. Hepatit B virüsü enfeksiyonu kronik hepatit B'ye ilerledikçe, bağırsak florasında değişen derecelerde değişiklikler olur. Bağırsak florasının modüle edilmesi, hepatit B virüsü tedavisinde faydalar göstermiştir⁵. Ek olarak, merkezi sinir sistemi bağırsağı etkileyebilir ve mikrobiyal bileşimini değiştirebilir. Mikroflora dizileme teknolojisindeki son gelişmeler, merkezi sinir sistemi hastalıklarının ortaya çıkması ve ilerlemesi ile yakından ilişkili olan bağırsak mikroflorası ile merkezi sinir sistemi fonksiyonu arasındaki çift yönlü etkileşimleri ortaya çıkarmıştır ^6,7.

Toplumun yaşlanmasıyla birlikte, enterik sinir sistemindeki nöronal fonksiyonun azalması veya kaybı ve bağırsağın içsel innervasyonu ile bağlantılı olarak gastrointestinal motilite bozukluğu insidansı artmaktadır⁸. Gastrointestinal hastalıklar hakkındaki anlayışımız genişledikçe, potansiyel olarak yeni ilaç gelişmelerine yol açan çok sayıda yeni fikir ve yaklaşım ortaya çıkmaktadır. Bununla birlikte, bu fikirlerin çoğu hala varsayımsaldır veya ^9,10'un gerçekleşmesi için olumlu klinik araştırma sonuçlarını beklemektedir. Gastrointestinal hastalıkların üstesinden gelmede etkili araştırma yöntemleri çok önemlidir. Son yıllarda, gastrointestinal ilaçlar ve motilite regülasyonu üzerine kapsamlı araştırmalar yapılmıştır. Gastrointestinal ilaçlar ve gastrointestinal dinamikler birbirinden ayrılamaz ve diğer birçok sistemik ilacın gastrointestinal dinamikler üzerinde farklı etkileri vardır. Örneğin, steroid olmayan antienflamatuar ilaçlar (NSAID'ler) ağrı ve iltihaplanma ve yavaş gastrointestinal hareket için kullanılır ve peptik ülser riskini artırır¹¹. Öte yandan, bazı antidepresanlar gastrointestinal motiliteyi etkileyebilir¹². Şu anda, gastrointestinal ilaçların ve diğer sistemik ilaçların gastrointestinal motilite üzerindeki etkilerini inceleyen ana in vitro farmakolojik deney, in vitro bağırsak hareketi testidir¹³. Fizyolojik koşulları simüle ederek, ilaçların bağırsak düz kas kasılması ve gevşemesi üzerindeki doğrudan etkisini gözlemler ve gastrointestinal etkilerini değerlendirirler. Bununla birlikte, gastrointestinal motilite bozukluklarının kesin nedeni belirsizliğini korumaktadır, muhtemelen genetik, çevresel, diyet ve nöroendokrin faktörlerin karmaşık bir etkileşimidir. Sonuç olarak, gastrointestinal motilite bozukluklarının tedavisi önemli zorluklar oluşturmaya devam etmektedir.

Sindirim, emilim ve ilaç metabolizması için çok önemli bir bölge olan ince bağırsak, gastrointestinal fonksiyonda önem taşır. Sonuç olarak, izole bağırsak tüpü hareket testi, gastrointestinal hastalıkları incelemek için önemli bir araçtır. Bu, hayvanın izole edilmiş bağırsak tüpünün bir banyoya hazırlanmasını ve yerleştirilmesini, bir enerji eşanjörüne bağlanmasını, mekanik hareketleri amplifikasyon için elektrik sinyallerine dönüştürmek için bir dönüştürücü kullanılmasını ve fizyolojik bir kayıt cihazı ile kaydedilmesini içerir. Bağırsak tüpünün motor fonksiyonunu değerlendirmek için frekans, ortalama titreşim genliği, gerginlik ve eğrinin altındaki alan gibi çeşitli parametreler ölçülebilir. Bu yöntem, basitlik, ekonomik fizibilite, deney koşullarının kolay kontrolü, minimum etki faktörleri, yüksek tekrarlanabilirlik, doğru ve güvenilir sonuçlar gibi avantajlar sunar. Ayrıca, uyuşturucu etki mekanizmasının araştırılması için özellikle yararlıdır. Bununla birlikte, izole bağırsak tüpü deneyinin çalışmasında dikkate değer zorluklar vardır, örneğin, bağırsak aktivitesinin uzun süre sürdürülmesi zordur. Bu sorunları ele almak ve in vitro deneylerdeki deneyimlerden yararlanmak için, bu makale deneysel operasyondaki temel sorunlara ayrıntılı bir giriş sağlayacak ve gastrointestinal motiliteyi düzenleyen ilaçları incelemek için değerli bir referans deneysel protokol sunacaktır.

Protokol

Bu protokol daha önce yayınlanmış literatürden^{türetilmiştir} 14,15,16,17. Bu çalışma için erkek Sprague Dawley (SD) sıçanları (260-300 g, 8-10 haftalık) kullanıldı. Hayvan protokolü, Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Yönetim Komitesi tarafından gözden geçirildi ve onaylandı (Kayıt No. 2023017). Deneyden önce, sıçanlara 24 saat oruç tutmaları talimatı verildi. Deney sırasında, fareler bir hayvan odasında tutuldu ve yiyecek ve suya serbestçe erişebildiler.

1. Çözelti hazırlama

1. 118 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 2.5 mM CaCl₂, 1.2 mM KH₂PO₄, 1.2 mM MgCl₂∙6H₂O, 25 mM NaHCO₃, 11 mM D-glikoz ve 5 mM HEPES içeren fizyolojik tuz çözeltisi (PSS) hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
2. Çözeltileri doyurun ve %95_O2 ve %5 CO₂ karışımlı bir gazla kabarcıklandırın. Bu arada, çözeltinin pH değerlerini 2 mM NaOH ile 7.38 ile 7.42 arasında tutun.
3. Sonraki deneyler için PSS'nin 1/3'ünü 4 °C'ye önceden soğutun ve geri kalanını 37 °C'ye ısıtın.
   NOT: PSS orijinal olarak oda sıcaklığında adım 1.1-1.2'de hazırlanmıştır

2. Sıçan bağırsak kanal diseksiyonu

1. 4°C PSS, cerrahi cımbız ve makasla doldurulmuş Petri kaplarını toplayın. Sıçanı yaklaşık 5 dakika inhalasyon yoluyla uyuşturmak için% 2 izofluran uygulayın. Bir ayak parmağı sıkıştırma testi yaparak farenin derin bir şekilde uyuşturulduğunu doğrulayın. Gerekirse, ek anestezikler uygulayın. Daha sonra, karın boşluğunu bir ameliyat masasında açarak bağırsak kanalını ortaya çıkarın.
2. Mide ve bağırsak tüplerini hızlı bir şekilde %95_O2 ve %5 CO₂ doymuş 4 °C PSS (pH 7.40) ile doldurulmuş bir Petri kabına yerleştirin. İnce bağırsağın başlangıcı olan duodenum'u mide pilorunda bulun. Cımbız kullanarak, bitişik dokuyu nazikçe kaldırın ve bağırsağın kenarından makasla dikkatlice kesin. Daha sonra bağırsağı 1-2 cm'lik segmentlere bölün; bu sürecin tamamı Şekil 1'de gösterilmiştir.

3. Bağırsak kanalının askıya alınması ve sabitlenmesi (Şekil 2)

1. İn vitro doku perfüzyon sistemini açın ve cihazdaki banyo sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın. PSS'yi (37 °C) banyoya yerleştirin.
2. 15 cm'lik bir cerrahi sütür hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve %95 O₂ + %5 CO₂ ile doyurulmuş 4 °C PSS'ye batırın. Sütürü kullanarak bağırsak kanalının bir ucunu sabitleyin ve diğer ucunu sabitlemek için çelik bir iğne kancası kullanın.
3. Bağırsak tüpünü takın. Segmenti banyonun altındaki çelik iğne kancası ile monte edin ve cerrahi hattın diğer ucunu dönüştürücüye takın. Banyoda kabarcıkların ortaya çıkmasına izin vermek için gaz anahtarını açın.
4. Veri toplama yazılımını açın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve ilgili yol sinyalinin kaydedildiğinden emin olmak için Başlat'a tıklayın.

4. Normalleşme

1. Bağırsak tüplerini doğal durumlarına gevşetmek için banyonun spiral eksenini saat yönünün tersine çevirin. Yazılımda bağırsak tüpünün başlangıç geriliminin 0 g olarak ayarlandığından emin olmak için Setup-Zero All Inputs'a tıklayın.
2. Gerilim değerini 1 g'a çekmek için banyonun spiral eksenini saat yönünün tersine çevirin ve pH = 7.40,% 95 O₂ +% 5 CO₂ doymuş 37 ° C PSS'de 30 dakika boyunca sabitleyin.
   NOT: Bağırsak tüpünün normalleşmesi, ön yükünü en uygun duruma getirmektir. Boşluk numuneleri için, in vitro olarak istisnai aktiviteyi sürdürmek için optimal bir ön yük gerekliydi. Sıçan bağırsak tüpünün optimal ön yükü 1 g¹⁸ idi.

5. Reaktivitenin tespiti

1. Yazılımdaki ritmik spontan kasılma dalgalarını gözlemleyin ve yeterli bir yanıtı gösterdiği için bir sonraki deneye geçin.

6. Deneysel gözlem

1. İlacın bağırsak tüpü fonksiyonu üzerindeki etkisini incelemek için test ilacını (asetilkolin vb.) banyoya ekleyin.
   NOT: İlacın etkisi, bağırsak daralma eğrisindeki uygulama öncesi ve sonrası değişiklikler karşılaştırılarak değerlendirildi. İlaç eklendiğinde, ilacı karıştırmak için kabarcığı artırmak ve karıştırdıktan sonra kabarcığı normale ayarlamak uygundur.

7. Veri analizi

NOT: İn vitro doku perfüzyon sistemi, dört aynı veya farklı ilacın dört bağırsak tüpü üzerindeki etkileri üzerinde aynı anda testler yapabilen dört kanala sahiptir. Deneysel parametreler ve analiz yöntemleri tüm kanallar için aynı olduğundan, veri analizi için örnek olarak bir kanal seçilmiştir.

1. Veri toplama yazılımını durdurun ve bu veri toplama yazılımı üzerinde veri analizi yapın. Veri panosunu düzenleyin ve analiz parametrelerini aşağıdaki gibi seçin: Window-Data Pad'e tıklayın ve kanal için ortalama gerilimi seçin.
2. Uygulamadan önce kasılma eğrisini seçin ve Veri Pedi'ne Ekle'ye tıklayın; Uygulamadan sonra kasılma eğrisini seçin ve Veri pedine ekle'ye tıklayın. Uygulamadan önceki ve sonraki ortalama gerginlik değeri sırayla veri pedinde görünecektir.
3. Verileri istatistiksel analiz için diğer istatistiksel analiz yazılımlarına kopyalamak için Window-Data Pad'e tıklayın (Malzeme Tablosuna bakın).
4. Ortalama genlik, ortalama frekans ve integral (eğrinin altındaki alan) gibi diğer parametreleri analiz edin, ortalama gerilimi ilgili parametreyle değiştirin ve işlem 6.1-6.3 adımlarıyla aynıdır.
5. Kasılma eğrisini kaydedin: Kasılma eğrisini seçin, daralma eğrisini çizmek için verileri çizim yazılımına kopyalamak için Labchart Verilerini Düzenle-Kopyala'ya tıklayın ( Malzeme Tablosuna bakın).

8. Ameliyat sonrası tedavi

1. Ameliyattan sonra, kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek hayvanlara ötenazi yapın.
   NOT: Bu çalışma için, hayvanlara fazla izofluran solunarak ötenazi uygulandı.

Sonuçlar

Çalışmanın ilk bölümünde izole edilmiş barsak tüplerinin vücuttan ayrıştırılarak in vitro olarak 2 cm'lik tüpler haline getirilmesi işlemi üzerinde durulmaktadır. Bu işlem Şekil 1'de ayrıntılı olarak gösterilmiştir. İkinci kısım, izole edilmiş bağırsak tüpü halkasının askıya alınmasını ve standardizasyonunu içerir. Bu işlemin başarısı, normal bir tüpün otomatik ritmik kasılmasını gösteren

Tartışmalar

Gastrointestinal motilite, bir dizi hassas koordineli düz kas kasılması ve gevşemesi ile gerçekleştirilir. Bu süreç, bir grup kas grubunun ritmik kasılmasını, birden fazla grubun koordineli kasılmasını ve özel itici kasılmayı içerir^20,21. Gastrointestinal motilite bozukluklarının ortaya çıkması, merkezi sinir sistemi, otonom sinir sistemi, enterik sinir sistemi ve gastrointestinal düz kas gibi farklı düz...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetylcholine	Sigma, USA	A6625
atropine	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	IA06501
Barium chloride	Macklin Biochemical Co.,Ltd.,Shanghai, China	B861682
CaCl2	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A501330
D-glucose	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A610219
drawing software	GraphPad Software, San Diego, California, USA	—
Epinephrine	Sigma, USA	E4642
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, China	S3872
In vitro tissue perfusion system	PowerLab, ADInstruments, Australia	ML0146
KCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100395
KH2PO4	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100781
LabChart Professional version 8.3	ADInstruments, Australia	—
MgCl2·6H2O	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100288
NaCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100241
NaHCO3	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100865
nifedipine	Macklin Biochemical Co.,Ltd.,Shanghai, China	N5087
statistical analysis software	GraphPad Software, San Diego, California, USA	—
Surgical sutures	Johnson, USA	—