المقايسة القائمة على نقل طاقة الرنين للتلألؤ الحيوي (BRET) لقياس تفاعلات CRAF مع 14-3-3 بروتينات في الخلايا الحية

Summary

يصف هذا البروتوكول مقايسة قائمة على BRET لقياس تفاعلات كيناز CRAF مع 14-3-3 بروتينات في الخلايا الحية. يحدد البروتوكول خطوات لإعداد الخلايا ، وقراءة انبعاثات BRET ، وتحليل البيانات. يتم أيضا تقديم مثال على النتيجة مع تحديد عناصر التحكم المناسبة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لتحسين الفحص.

Abstract

CRAF هو المستجيب الأساسي ل RAS GTPases ويلعب دورا مهما في تكوين الأورام للعديد من السرطانات التي تحركها KRAS. بالإضافة إلى ذلك ، يعد CRAF نقطة ساخنة لطفرات الخط الجرثومي ، والتي ثبت أنها تسبب اعتلال RASopathy التنموي ، متلازمة نونان. تحتوي جميع كينازات RAF على مواقع ربط متعددة تعتمد على الفسفرة ل 14-3-3 بروتينات تنظيمية. يلعب الارتباط التفاضلي ل 14-3-3 لهذه المواقع أدوارا أساسية في تكوين ثنائيات RAF النشطة في غشاء البلازما في ظل ظروف الإشارات وفي الحفاظ على التثبيط الذاتي لسلاح الجو الملكي البريطاني في ظل ظروف هادئة. يعد فهم كيفية تنظيم هذه التفاعلات وكيف يمكن تعديلها أمرا بالغ الأهمية لتحديد الأساليب العلاجية الجديدة التي تستهدف وظيفة سلاح الجو الملكي البريطاني. هنا ، أصف مقايسة نقل طاقة الرنين الحيوي (BRET) لقياس تفاعلات CRAF مع 14-3-3 بروتينات في الخلايا الحية. على وجه التحديد ، يقيس هذا الفحص تفاعلات CRAF المنصهرة مع مانح نانو لوسيفيراز و 14-3-3 المنصهرة مع متقبل علامة Halo ، حيث يؤدي تفاعل RAF و 14-3-3 إلى نقل الطاقة من مانح إلى متقبل وتوليد إشارة BRET. يوضح البروتوكول كذلك أن هذه الإشارة يمكن أن تتعطل بسبب الطفرات التي تظهر لمنع ارتباط 14-3-3 بكل موقع من مواقع الإرساء عالية التقارب لسلاح الجو الملكي البريطاني. يصف هذا البروتوكول إجراءات بذر الخلايا ونقلها وإعادة طلائها ، إلى جانب تعليمات مفصلة لقراءة انبعاثات BRET ، وإجراء تحليل البيانات ، وتأكيد مستويات التعبير عن البروتين. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير أمثلة على نتائج الفحص ، جنبا إلى جنب مع خطوات التحسين واستكشاف الأخطاء وإصلاحها.

Introduction

كينازات سلاح الجو الملكي البريطاني (ARAF و BRAF و CRAF) هي المستجيبات المباشرة ل RAS GTPases والأعضاء البادئين في سلسلة كيناز RAF-MEK-ERK المؤيدة للتكاثر / المؤيدة للبقاء. أظهرت الدراسات الحديثة أن تعبير CRAF يلعب دورا رئيسيا في تكوين الأورام للعديد من السرطانات التي تحركها KRAS ، بما في ذلك سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة وسرطان الغدة القنوية البنكرياسية^{1،2،3،4،5}. علاوة على ذلك ، تسبب طفرات CRAF الجرثومية شكلا حادا بشكل خاص من اعتلال RASopathy ، متلازمة نونان ^6,7

Protocol

ملاحظة: يتم إجراء هذا الفحص في خلايا 293FT. خط ظهاري مميز جيدا وقابل للنقل بسهولة مشتق من خلايا الكلى الجنينية البشرية. عادة ما يوفر طبق استزراع واحد متلاقى بطول 10 سم لهذه الخلايا خلايا كافية لبذر 20 بئرا من ألواح زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار. يجب تنفيذ الخطوات 1-3 باستخدام تقنية معقمة في خزانة السلامة البيولوجية.

1. بذر الخلايا (اليوم الأول)

ملاحظة: في هذه الخطوة ، يتم فصل الخلايا عن طبق (أطباق) زراعة الأنسجة ، وعدها ، وزرعها في ألواح زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار لنقلها في الخطوة 2 (الشكل 2).

1. نضح الوسائط من الخلايا في طبق 10 سم. اغسل الخلايا ب 5 مل ....

النتائج

عند إجراء كما هو موضح في هذا البروتوكول (الشكل 2) ، يجب أن ينتج تفاعل Nano-CRAF^WT و 14-3-3ζ-Halo نسب BRET مصححة من 50-60 mBU (الشكل 3A ؛ الجدول التكميلي 1). يحتوي CRAF على موقعين للرسو يعتمدان على الفسفرة 14-3-3 ، موقع N وموقع C (الشكل 1)⁸. لذلك.......

Discussion

أظهرت الدراسات السابقة أن بروتينات 14-3-3 تلعب أدوارا حاسمة في كل من تنشيط وتثبيط كينازات RAF. إن فهم كيفية تنظيم هذه الأحداث الملزمة وتأثيرات تعديل هذه التفاعلات على إشارات سلاح الجو الملكي البريطاني وتكوين الأورام المدفوع بسلاح الجو الملكي البريطاني قد يكشف عن نقاط ضعف علاجية جديدة تستهدف .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
HaloTag® mouse monoclonal antibody	Promega	G9211	Antibody for detecting HaloTag tagged  proteins by immunoblot
NanoLuc® mouse monoclonal antibody	R&D Systems	MAB10026	Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot
CRAF mouse monoclonal antibody (E10)	Santa Crus Biotechnology	sc-7267	Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot
ECL anti-mouse HRP secondary antibody	Amersham	NA931-1ML	Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep)
Reagents
X-tremeGENE™ 9	Roche/Sigma	6365809001
NanoBRET™ kit	Promega	N1661	NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate
DPBS, without Ca++ and Mg++	Quality Biologicals	114-057-101
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Life Technologies	25300120
DMEM cell culture media	Life Technologies	11995073	High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium  pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin
L-Glutamine (200 mM)	Life Technologies	25030164
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140163
Opti-MEM™ I reduced serum media	Gibco	31985062	For cell transfection
Opti-MEM reduced serum media, no phenol red	Gibco	11058021	For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated).
Invitrogen Trypan Blue Stain	Thermo Scientific	T10282
NP40 lysis buffer	N/A	N/A	20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol,  NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 µM leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF.
5x gel sample buffer	N/A	N/A	240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C.
Cell lines
293FT cells (human)	Thermo Scientific	R70007
DNA vectors
pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant	N/A	N/A
pCMV5-14-3-3ζ-Halo	N/A	N/A
Equipment
EnVision 2104 Multimode Plate Reader	PerkinElmer 2104	2104-0010	600LP NanoBRET & M460/50 nm NanoBRET emmisions filters,  Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time
Invitrogen Countess™ II Automated Cell Counter	Thermo Scientific	AMQAX1000
ThermoFisher E1-ClipTip™  Multichannel  Pipettor	Thermo Scientific	4672070
Software
GraphPad Prism (version 10.0.3)	GraphPad	www.graphpad.com
Other
ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips	Thermo Scientific	94410153
Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile	Thomas Scientific	1228K16
Perkin Elmer 384-well CulturPlate™	PerkinElmer	6007680	White, polystyrene, tissue culture treated
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermo Scientific	C10228