Dosage basé sur le transfert d’énergie par résonance de bioluminescence (BRET) pour mesurer les interactions de CRAF avec les protéines 14-3-3 dans les cellules vivantes

Résumé

Ce protocole décrit un test basé sur BRET pour mesurer les interactions de la kinase CRAF avec les protéines 14-3-3 dans des cellules vivantes. Le protocole décrit les étapes de préparation des cellules, de lecture des émissions BRET et d’analyse des données. Un exemple de résultat avec l’identification des contrôles appropriés et le dépannage pour l’optimisation du test est également présenté.

Résumé

CRAF est un effecteur primaire des GTPases RAS et joue un rôle essentiel dans la tumorigenèse de plusieurs cancers induits par KRAS. De plus, CRAF est un point chaud pour les mutations germinales, qui causent la RASopathie développementale, le syndrome de Noonan. Toutes les kinases RAF contiennent de multiples sites de liaison dépendants de la phosphorylation pour les protéines régulatrices 14-3-3. La liaison différentielle de 14-3-3 à ces sites joue un rôle essentiel dans la formation de dimères RAF actifs au niveau de la membrane plasmique dans des conditions de signalisation et dans le maintien de l’auto-inhibition de RAF dans des conditions de repos. Comprendre comment ces interactions sont régulées et comment elles peuvent être modulées est essentiel pour identifier de nouvelles approches thérapeutiques qui ciblent la fonction RAF. Ici, je décris un test basé sur le transfert d’énergie par résonance de bioluminescence (BRET) pour mesurer les interactions de CRAF avec les protéines 14-3-3 dans des cellules vivantes. Plus précisément, ce test mesure les interactions de CRAF fusionné à un donneur de nano luciférase et de 14-3-3 fusionné à un accepteur de marqueurs Halo, où l’interaction de RAF et 14-3-3 entraîne un transfert d’énergie de donneur à accepteur et la génération du signal BRET. Le protocole montre en outre que ce signal peut être perturbé par des mutations qui empêchent la liaison de 14-3-3 à chacun de ses sites d’amarrage RAF de haute affinité. Ce protocole décrit les procédures d’ensemencement, de transfection et de replacage des cellules, ainsi que des instructions détaillées pour lire les émissions BRET, effectuer l’analyse des données et confirmer les niveaux d’expression des protéines. De plus, des exemples de résultats d’analyse, ainsi que des étapes d’optimisation et de dépannage, sont fournis.

Introduction

Les kinases RAF (ARAF, BRAF et CRAF) sont les effecteurs directs des GTPases RAS et les membres initiateurs de la cascade de kinases RAF-MEK-ERK pro-proliférative/pro-survie. Des études récentes ont montré que l’expression de CRAF joue un rôle clé dans la tumorigenèse de plusieurs cancers induits par KRAS, notamment le cancer du poumon non à petites cellules et l’adénocarcinome canalaire pancréatique 1,2,3,4,5. De plus, les mutations germinales de CRAF provoquent une forme particulièrement sévère de la RASopathie, le syndrome de Noonan ^6,7. La compréhension de la régulation de la CRAF est essentielle pour développer des approches thérapeutiques efficaces qui ciblent sa fonction dans les cellules.

Toutes les kinases RAF peuvent être divisées en deux domaines fonctionnels, un domaine catalytique C-terminal (CAT) et un domaine régulateur N-terminal (REG), qui contrôle son activité (Figure 1A)⁸. Le domaine REG englobe le domaine de liaison RAS (RBD), le domaine riche en cystéine (CRD) et une région riche en sérine/thréonine (riche en S/T). Notamment, la région riche en S/T contient le site N', qui se lie à 14-3-3 de manière dépendante de la phosphorylation (S259 dans CRAF ; Graphique 1A) ⁸. Le domaine CAT englobe le domaine kinase, ainsi qu’un deuxième site d’amarrage 14-3-3 de haute affinité, appelé site C'(S621 en CRAF ; Graphique 1A) ⁸. La liaison différentielle des protéines dimériques 14-3-3 aux sites N’et C', ainsi que le CRD, jouent un rôle essentiel dans l’activation et l’inhibition de RAF 9,10,11,12,13. Dans des conditions normales de signalisation, l’activation de RAF est initiée par son recrutement dans la membrane plasmique par RAS, ce qui lui permet de former des dimères actifs, dont l’hétérodimère BRAF-CRAF est la forme active prédominante^14,15. Les analyses biochimiques avec BRAF et CRAF, ainsi que les structures de microscopie électronique cryogénique (Cryo-EM) des BRAF dimériques, indiquent qu’un dimère 14-3-3 stabilise les dimères RAF actifs en se liant simultanément au site C’des deux protomères RAF (Figure 1B)9,13,16,17. À l’inverse, des études ont montré que dans des conditions de repos, RAF adopte une confirmation cytosolique, auto-inhibée, où le domaine REG se lie au domaine CAT et inhibe son activité 12,18,19,20. Cet état fermé est stabilisé par un dimère 14-3-3 lié au CRD et au site N’dans le domaine REG et au site C’dans le domaine CAT (Figure 1B)10,13,21. Dans BRAF, ce modèle est soutenu par les structures Cryo-EM récentes de monomères BRAF auto-inhibés et par nos études biochimiques précédentes 10,12,13,21,22. Cependant, alors qu’il est démontré que le 14-3-3 joue un rôle inhibiteur dans la régulation²³ de la CRA, un état auto-inhibé de type BRAF peut jouer un rôle moindre dans la régulation¹² de la CRAC ; par conséquent, d’autres études sont nécessaires pour clarifier les mécanismes par lesquels les protéines 14-3-3 régulent l’activité de CRAF. La régulation des kinases RAF médiée par 14-3-3 nécessite une pléthore d’événements de phosphorylation et de désphosphorylation RAF, la liaison à diverses protéines régulatrices et des interactions avec la membrane plasmique⁸. Par conséquent, il est essentiel que les interactions 14-3-3-RAF soient mesurées dans des conditions physiologiquement pertinentes et en présence d’une bicouche lipidique intacte.

Pour résoudre ce problème, la technologie NanoBRET (ci-après appelée N-BRET ; voir le tableau des matériaux pour les détails du kit) a été utilisée pour développer un test basé sur la proximité permettant de mesurer les interactions de CRAF avec les protéines 14-3-3 dans les cellules vivantes (Figure 1C). Ce système basé sur BRET mesure les interactions de deux protéines d’intérêt (POI), où une protéine est marquée avec un donneur de nanoluciférase (Nano) et l’autre avec un marqueur Halo, pour le marquage avec le ligand accepteur d’énergie Halo618^22,24. L’interaction des protéines d’intérêt entraîne un transfert d’énergie de donneur à accepteur, qui à son tour génère le signal BRET (Figure 1C). La protéine donneuse Nano extrêmement brillante (émission (em) 460 nm) et le ligand Halo618 (em 618 nm) offrent une séparation spectrale et une sensibilité supérieures à celles de BRET conventionnelles, ce qui en fait une plate-forme idéale pour étudier les interactions plus faibles et détecter les changements subtils de liaison²⁴. En effet, nous avons précédemment développé un test basé sur N-BRET pour mesurer les interactions auto-inhibitrices des domaines RAF REG et CAT, ce qui a été essentiel pour la caractérisation d’un panel de mutations RASopathy dans le CRD BRAF et a démontré l’importance critique de ce domaine pour maintenir l’autoinhibition et prévenir l’activation constitutive de BRAF¹².

Le test décrit ici mesure les interactions de CRAF, fusionné à une étiquette Nano N-terminale (Nano-CRAF), et de l’isoforme zêta de 14-3-3 fusionnée à l’étiquette Halo C-terminale (14-3-3ζ-Halo ; Figure 1C). Nous montrons que les interactions de Nano-CRAF avec 14-3-3ζ-Halo génèrent un signal BRET robuste, qui peut à son tour être perturbé par des mutations qui empêchent la liaison de 14-3-3 au site N'(S259A) et/ou au site C'(S621A). Le protocole suivant fournit des étapes détaillées pour effectuer, optimiser et dépanner ce test.

Protocole

REMARQUE : Ce test est effectué dans des cellules de 293FT. Une lignée épithéliale bien caractérisée et facilement transfectable dérivée de cellules rénales embryonnaires humaines. Une seule boîte de culture confluente de 10 cm de ces cellules fournit généralement suffisamment de cellules pour ensemencer 20 puits de plaques de culture tissulaire à 6 puits. Les étapes 1 à 3 doivent être effectuées à l’aide d’une technique stérile dans une enceinte de sécurité biologique.

1. Ensemencement cellulaire (jour 1)

REMARQUE : Dans cette étape, les cellules sont détachées de la ou des boîtes de culture tissulaire, comptées et ensemencées dans des plaques de culture tissulaire à 6 puits pour la transfection à l’étape 2 (Figure 2).

1. Aspirez le milieu des cellules dans la parabole de 10 cm. Laver les cellules avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et aspirer.
2. Ajouter 1 ml d’acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et incuber pendant 3 à 5 minutes à 37 °C pour détacher les cellules de la boîte.
3. Ajoutez 9 ml de milieu complet Dulbecco’s modified eagle (DMEM) dans les cellules pour neutraliser la trypsine et pipetez de haut en bas à plusieurs reprises pour générer une suspension unicellulaire homogène.
4. Transférez immédiatement 20 μL de cellules dans un tube de 1,7 ml et mélangez avec 20 μL de colorant bleu trypan. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé (Table des matériaux) ou d’un hémocytomètre.
5. Diluer les cellules à 2 x 10⁵ cellules/mL dans un milieu DMEM complet et ajouter 2 mL dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire à 6 puits (4 x 10⁵ cellules/puits). Incuber les cellules à 37 °C et 10 % de CO₂ pendant la nuit.
   REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser des cellules de 293FT qui ont été passées moins de 20x. Nous avons précédemment constaté que l’utilisation de cellules avec un plus grand nombre de passages peut entraîner une réduction des rapports BRET et une augmentation de la variabilité du signal de puits à puits.

2. Transfection cellulaire (jour 2)

REMARQUE : Ici, les cellules sont transfectées avec les constructions d’expression pCMV5-NanoLuc-CRAF et pCMV5-14-3-3ζ-Halo, ainsi que le vecteur vide pCDNA3.1 (Figure 2).

1. Avant la transfection, diluer les plasmides N-BRET à 5 ng/μL et pCDNA3.1 à 100 ng/μL, et numéroter un ensemble de tubes stériles de 1,7 mL.
2. Ajoutez 100 μL de milieu de transfection (voir le tableau des matériaux pour plus de détails) dans chaque tube, ainsi que 5 ng de pCMV5-NanoLuc-CRAF, 10 ng de pCMV5-14-3-3ζ et 200 ng de PCDNA3.1.
3. Ajouter 2 μL de réactif de transfection (voir le tableau des matériaux pour plus de détails) et agiter doucement pour mélanger. Faites tourner brièvement les tubes dans une microcentrifugeuse pour vous assurer que tout le liquide est recueilli au fond des tubes, puis incubez à environ 25 °C pendant 15 min.
4. Ajouter des complexes de transfection goutte à goutte aux cellules et incuber à 37 °C/10 % de CO₂ pendant 16 à 20 h pour permettre l’expression des protéines marquées Halo et Nano.
   REMARQUE : L’ajout d’un vecteur vide (pCDNA3.1) est essentiel pour obtenir une efficacité de transfection élevée des constructions d’expression de N-BRET. L’absence d’ajout de vecteur vide entraîne une réduction des niveaux d’expression des protéines 14-3-3ζ-Halo et Nano-CRAF et, à son tour, entraîne des rapports BRET faibles et incohérents, comme nous l’avons vu précédemment²².

3. Replacage cellulaire (jour 3)

REMARQUE : Dans cette étape, les cellules sont transférées sur une plaque de 384 puits et soit un ligand Halo 618 (+ligand ; Table des matériaux) ou DMSO (+véhicule) est ajouté pour la lecture des émissions BRET à l’étape 4. Les cellules restantes sont transférées sur des plaques de culture fraîches à 6 puits pour l’analyse par transfert Western à l’étape 5 (figure 2).

1. Rassemblez les matériaux suivants et préparez la zone de travail comme décrit ci-dessous.
   1. À l’aide d’un bain-marie à 37 °C, préchauffer la trypsine-EDTA, avec des milieux de dosage sans sérum et des milieux de dosage supplémentés à 10 % de FBS (voir la table des matériaux pour plus de détails).
   2. En fonction du nombre d’échantillons à mesurer, pré-étiqueter trois ensembles de tubes stériles de 1,7 mL (ensembles 1 à 3) et un ensemble de tubes stériles à fond conique de 15 mL. Équipez une centrifugeuse à godet oscillant d’inserts de tube de 15 ml et pré-refroidissez à 4 °C.
   3. Placez les articles suivants dans la hotte de culture tissulaire : réservoirs de réactifs, plaques de culture tissulaire à 384 puits, plaques de culture tissulaire à 6 puits, pipette multicanaux et pointes, lames/chambres de comptage cellulaire et coloration au bleu trypan (table des matériaux), ainsi que les ensembles de tubes 1 à 3 de 1,7 ml.
2. Récoltez et comptez les cellules comme décrit ci-dessous.
   1. Aspirez le milieu des plaques à 6 puits et ajoutez 250 μL de trypsine-EDTA aux cellules. Incuber les plaques à 6 puits à 37 °C jusqu’à ce que les cellules commencent à se détacher (3-5 min).
   2. Ajouter 1 mL de milieu de dosage complété à 10 % de FBS dans chaque puits pour neutraliser la trypsine et pipeter vigoureusement de haut en bas pour générer une suspension unicellulaire.
   3. Transférez 1 mL de suspension cellulaire dans les tubes de 15 mL pré-étiquetés. Ajouter 1 mL de milieu de dosage complété à 10 % de FBS dans chacun des tubes de 15 mL.
   4. Retournez les tubes 5 fois pour mélanger et transférez immédiatement 20 μL de suspension cellulaire dans le tube 1.
   5. Centrifugeuse dans la centrifugeuse à godet pivotant pré-refroidie pendant 5 min à ~250 x g. Au cours de l’étape de centrifugation, mélangez 20 μL de colorant cellulaire au bleu trypan avec les cellules du tube 1, puis comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé ou d’un hémocytomètre. Un rendement de 6-8 x 10⁵ cellules/mL est typique.
   6. Retirez les tubes de 15 mL de la centrifugeuse et aspirez le média des pastilles de cellule. Remettre les pastilles cellulaires en suspension à 2 x 10⁵ cellules/mL dans un milieu de dosage sans sérum et pipeter vigoureusement pour générer une suspension unicellulaire.
      REMARQUE : L’utilisation de milieux de test sans sérum est utilisée pour mettre au repos les voies de signalisation cellulaire normales.
3. Replaquez les cellules en plaques à 384 puits et à 6 puits comme décrit ci-dessous.
   1. Retournez les tubes de 15 mL plusieurs fois pour assurer une suspension cellulaire homogène et transférez les tubes de 500 μL dans les ensembles 2 et 3 de 1,7 mL.
   2. Ajouter 0,5 μL de DMSO (+véhicule) à la série 2 et 0,5 μL de ligand Halo 618 (+ligand) à la sonde 3 et à la pipette pour mélanger.
   3. Transférez les suspensions cellulaires +véhicule et +ligand dans des puits séparés des réservoirs de réactifs. À l’aide de la pipette multicanaux (Table des matériaux), transférez 40 μL de la suspension cellulaire +véhicule des réservoirs de réactifs vers les puits quadruplés de la plaque de culture à 384 puits. Répétez cette étape pour les suspensions de cellules +ligand.
   4. Transférez les cellules restantes dans des plaques de culture fraîches à 6 puits. Incuber les plaques de 384 puits et de 6 puits pendant la nuit à 37 °C et 5 % de CO₂.

4. Lecture des émissions de BRET (jour 4)

REMARQUE : Dans cette étape, le substrat de nanoluciférase (voir le tableau des matériaux pour plus de détails) est ajouté aux cellules de la plaque de culture à 384 puits et les émissions de l’accepteur N-BRET (618 nm) et du donneur (460 nm) sont lues (Figure 2). Les rapports BRET corrigés sont ensuite calculés.

1. Préchauffer le milieu de dosage sans sérum dans un bain d’eau à 37 °C et décongeler le substrat de nanoluciférase à 25 °C. Diluer le substrat de nanoluciférase 1:100 dans un milieu de dosage sans sérum et transférer dans un réservoir de réactifs. Préparez suffisamment de ce mélange pour ajouter 10 μL dans chaque puits de la plaque de 384 puits, plus 10 à 15 % de volume supplémentaire.
2. À l’aide d’une pipette multicanaux (Table of Materials), transférez 10 μL du mélange de substrat dans chacun des puits contenant des cellules dans la plaque de culture à 384 puits. Faites pivoter doucement la plaque pendant 1 min, manuellement ou à l’aide d’un agitateur orbital.
3. Insérez la plaque à 384 puits dans le lecteur de plaques multimode et enregistrez les émissions de 460 nm et 618 nm pour tous les puits contenant des cellules.
   REMARQUE : Pour le lecteur de plaques multimode utilisé pour cette étape (voir le tableau des matériaux pour plus de détails), une hauteur de lecture de 6,5 mm, avec une mesure de temps de lecture de 0,1 s a été utilisée, mais une optimisation supplémentaire peut être nécessaire si vous utilisez d’autres lecteurs de plaques.
4. Calculez individuellement les rapports BRET bruts pour +véhicule et +ligand en unités milliBRET (mBU), à l’aide de l’équation suivante :
   
5. Calculer le rapport BRET corrigé en soustrayant le rapport BRET +véhicule de celui du +ligand (tableau supplémentaire 1).
   REMARQUE : Lorsque l’on compare les résultats de plusieurs expériences, les rapports BRET corrigés peuvent être regroupés et normalisés à la moyenne de la paire N-BRET de type sauvage (WT), composée de Nano-CRAF^WT et de 14-3-3ζ^WT-Halo (tableau supplémentaire 1).

5. Confirmation des niveaux d’expression des protéines (jours 4 et 5)

REMARQUE : Dans cette étape, les cellules des plaques à 6 puits sont lysées et les niveaux d’expression protéique des protéines Nano-CRAF et 14-3-3ζ-Halo sont déterminés par analyse par western blot à l’aide d’anticorps spécifiques aux marqueurs Halo et Nano. (Figure 2).

1. Ajouter des inhibiteurs de protéase et de phosphatase au tampon de lyse NP40 (tableau des matériaux), en autorisant 200 μL de tampon de lyse par échantillon.
2. Aspirez le milieu à partir de plaques à 6 puits contenant des cellules. Lavez les cellules une fois avec 1 ml de PBS froid et aspirez.
3. Ajouter 125 μL de tampon de lyse NP40 dans chaque puits et incuber des plaques de 6 puits à 4 °C sur une plate-forme à bascule pendant 15 min pour lyser les cellules.
4. Transférez les lysats dans des tubes de 1,7 mL sur de la glace et centrifugez-les à 20 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Remettez les lysats éliminés sur de la glace et déterminez la concentration en protéines à l’aide de dosages disponibles dans le commerce, tels que les dosages de Bradford ou d’acide bicchoninique (BCA).
5. Normaliser la concentration en protéines dans tous les échantillons en transférant un volume approprié de lysat et de tampon de lyse NP40 dans des tubes frais de 1,7 mL jusqu’à un volume total de 100 μL.
6. Faites bouillir 5 tampons d’échantillon de protéines (table des matériaux) pendant 1 min et ajoutez 25 μL à chaque échantillon. Faites bouillir les échantillons pendant 5 à 6 minutes, puis centrifugez brièvement les tubes par impulsions pour vous assurer que tout l’échantillon s’accumule à la base du tube.
7. Chargez 25 μL d’échantillon dans chaque puits de gels de protéines dupliqués (gel 1 et gel 2), puis transférez les protéines sur des membranes de nitrocellulose ou de PVDF à l’aide des procédures standard de transfert Western, comme décrit précédemment²².
8. Bloquer les membranes dans 3 % de BSA-PBS à 25 °C pendant 30 minutes, puis incuber les membranes pendant la nuit avec l’anticorps Halo (dilution 1:1 000 ; Gel 1) et soit de la nanoluciférase, soit de l’anticorps CRAF (dilution 1:500 ; Gel 2) dans une solution saline tris-tamponnée, complété par 0,2 % de Tween-20 (TBST ; Table des matériaux).
9. Laver les membranes 1x pendant 5 min dans 10 mL de TBST, puis incuber à température ambiante pendant 1 h avec un anticorps secondaire HRP anti-souris, dilué 1:10 000 dans du TBST.
10. Laver les membranes 3 fois sur une plate-forme basculante dans 10 mL de TBST à 25 °C pendant 5 min chacune. Retirez le TBST et visualisez les bandes protéiques à l’aide de réactifs ECL et d’un processeur de film à rayons X ou d’un autre système d’imagerie approprié.

Résultats

Lorsqu’elle est effectuée comme décrit dans ce protocole (Figure 2), l’interaction de Nano-CRAF^WT et de 14-3-3ζ-Halo devrait produire des rapports BRET corrigés de 50-60 mBU (Figure 3A ; Tableau supplémentaire 1). CRAF contient deux sites d’amarrage 14-3-3 dépendants de la phosphorylation, le site N’et le site C'(Figure 1)⁸. Par conséquent, les contrôles appropriés...

Discussion

Des études antérieures ont montré que les protéines 14-3-3 jouent un rôle essentiel dans l’activation et l’inhibition des kinases RAF. Comprendre comment ces événements de liaison sont régulés et les effets de la modulation de ces interactions sur la signalisation RAF et l’oncogenèse induite par RAF pourrait révéler de nouvelles vulnérabilités thérapeutiques qui ciblent la fonction CRAF. Cependant, le cycle d’activation de Raf est soutenu par une pléthore de protéines associées, de modifications...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
HaloTag® mouse monoclonal antibody	Promega	G9211	Antibody for detecting HaloTag tagged  proteins by immunoblot
NanoLuc® mouse monoclonal antibody	R&D Systems	MAB10026	Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot
CRAF mouse monoclonal antibody (E10)	Santa Crus Biotechnology	sc-7267	Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot
ECL anti-mouse HRP secondary antibody	Amersham	NA931-1ML	Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep)
Reagents
X-tremeGENE™ 9	Roche/Sigma	6365809001
NanoBRET™ kit	Promega	N1661	NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate
DPBS, without Ca++ and Mg++	Quality Biologicals	114-057-101
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Life Technologies	25300120
DMEM cell culture media	Life Technologies	11995073	High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium  pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin
L-Glutamine (200 mM)	Life Technologies	25030164
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140163
Opti-MEM™ I reduced serum media	Gibco	31985062	For cell transfection
Opti-MEM reduced serum media, no phenol red	Gibco	11058021	For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated).
Invitrogen Trypan Blue Stain	Thermo Scientific	T10282
NP40 lysis buffer	N/A	N/A	20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol,  NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 µM leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF.
5x gel sample buffer	N/A	N/A	240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C.
Cell lines
293FT cells (human)	Thermo Scientific	R70007
DNA vectors
pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant	N/A	N/A
pCMV5-14-3-3ζ-Halo	N/A	N/A
Equipment
EnVision 2104 Multimode Plate Reader	PerkinElmer 2104	2104-0010	600LP NanoBRET & M460/50 nm NanoBRET emmisions filters,  Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time
Invitrogen Countess™ II Automated Cell Counter	Thermo Scientific	AMQAX1000
ThermoFisher E1-ClipTip™  Multichannel  Pipettor	Thermo Scientific	4672070
Software
GraphPad Prism (version 10.0.3)	GraphPad	www.graphpad.com
Other
ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips	Thermo Scientific	94410153
Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile	Thomas Scientific	1228K16
Perkin Elmer 384-well CulturPlate™	PerkinElmer	6007680	White, polystyrene, tissue culture treated
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermo Scientific	C10228