Dosage basé sur le transfert d’énergie par résonance de bioluminescence (BRET) pour mesurer les interactions de CRAF avec les protéines 14-3-3 dans les cellules vivantes

Résumé

Ce protocole décrit un test basé sur BRET pour mesurer les interactions de la kinase CRAF avec les protéines 14-3-3 dans des cellules vivantes. Le protocole décrit les étapes de préparation des cellules, de lecture des émissions BRET et d’analyse des données. Un exemple de résultat avec l’identification des contrôles appropriés et le dépannage pour l’optimisation du test est également présenté.

Résumé

CRAF est un effecteur primaire des GTPases RAS et joue un rôle essentiel dans la tumorigenèse de plusieurs cancers induits par KRAS. De plus, CRAF est un point chaud pour les mutations germinales, qui causent la RASopathie développementale, le syndrome de Noonan. Toutes les kinases RAF contiennent de multiples sites de liaison dépendants de la phosphorylation pour les protéines régulatrices 14-3-3. La liaison différentielle de 14-3-3 à ces sites joue un rôle essentiel dans la formation de dimères RAF actifs au niveau de la membrane plasmique dans des conditions de signalisation et dans le maintien de l’auto-inhibition de RAF dans des conditions de repos. Comprendre comment ces interactions sont régulées et comment elles peuvent être modulées est essentiel pour identifier de nouvelles approches thérapeutiques qui ciblent la fonction RAF. Ici, je décris un test basé sur le transfert d’énergie par résonance de bioluminescence (BRET) pour mesurer les interactions de CRAF avec les protéines 14-3-3 dans des cellules vivantes. Plus précisément, ce test mesure les interactions de CRAF fusionné à un donneur de nano luciférase et de 14-3-3 fusionné à un accepteur de marqueurs Halo, où l’interaction de RAF et 14-3-3 entraîne un transfert d’énergie de donneur à accepteur et la génération du signal BRET. Le protocole montre en outre que ce signal peut être perturbé par des mutations qui empêchent la liaison de 14-3-3 à chacun de ses sites d’amarrage RAF de haute affinité. Ce protocole décrit les procédures d’ensemencement, de transfection et de replacage des cellules, ainsi que des instructions détaillées pour lire les émissions BRET, effectuer l’analyse des données et confirmer les niveaux d’expression des protéines. De plus, des exemples de résultats d’analyse, ainsi que des étapes d’optimisation et de dépannage, sont fournis.

Introduction

Les kinases RAF (ARAF, BRAF et CRAF) sont les effecteurs directs des GTPases RAS et les membres initiateurs de la cascade de kinases RAF-MEK-ERK pro-proliférative/pro-survie. Des études récentes ont montré que l’expression de CRAF joue un rôle clé dans la tumorigenèse de plusieurs cancers induits par KRAS, notamment le cancer du poumon non à petites cellules et l’adénocarcinome canalaire pancréatique 1,2,3,4,5. De plus, les mutations germinales de CRAF provoquent une forme particulièrement sévère de la RAS....

Protocole

REMARQUE : Ce test est effectué dans des cellules de 293FT. Une lignée épithéliale bien caractérisée et facilement transfectable dérivée de cellules rénales embryonnaires humaines. Une seule boîte de culture confluente de 10 cm de ces cellules fournit généralement suffisamment de cellules pour ensemencer 20 puits de plaques de culture tissulaire à 6 puits. Les étapes 1 à 3 doivent être effectuées à l’aide d’une technique stérile dans une enceinte de sécurité biologique.

1. Ensemencement cellulaire (jour 1)

REMARQUE : Dans cette étape, les cellules sont détachées de la ou des boîtes de culture tissu....

Discussion

Des études antérieures ont montré que les protéines 14-3-3 jouent un rôle essentiel dans l’activation et l’inhibition des kinases RAF. Comprendre comment ces événements de liaison sont régulés et les effets de la modulation de ces interactions sur la signalisation RAF et l’oncogenèse induite par RAF pourrait révéler de nouvelles vulnérabilités thérapeutiques qui ciblent la fonction CRAF. Cependant, le cycle d’activation de Raf est soutenu par une pléthore de protéines associées, de modifications.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
HaloTag® mouse monoclonal antibody	Promega	G9211	Antibody for detecting HaloTag tagged  proteins by immunoblot
NanoLuc® mouse monoclonal antibody	R&D Systems	MAB10026	Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot
CRAF mouse monoclonal antibody (E10)	Santa Crus Biotechnology	sc-7267	Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot
ECL anti-mouse HRP secondary antibody	Amersham	NA931-1ML	Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep)
Reagents
X-tremeGENE™ 9	Roche/Sigma	6365809001
NanoBRET™ kit	Promega	N1661	NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate
DPBS, without Ca++ and Mg++	Quality Biologicals	114-057-101
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Life Technologies	25300120
DMEM cell culture media	Life Technologies	11995073	High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium  pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin
L-Glutamine (200 mM)	Life Technologies	25030164
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140163
Opti-MEM™ I reduced serum media	Gibco	31985062	For cell transfection
Opti-MEM reduced serum media, no phenol red	Gibco	11058021	For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated).
Invitrogen Trypan Blue Stain	Thermo Scientific	T10282
NP40 lysis buffer	N/A	N/A	20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol,  NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 µM leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF.
5x gel sample buffer	N/A	N/A	240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C.
Cell lines
293FT cells (human)	Thermo Scientific	R70007
DNA vectors
pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant	N/A	N/A
pCMV5-14-3-3ζ-Halo	N/A	N/A
Equipment
EnVision 2104 Multimode Plate Reader	PerkinElmer 2104	2104-0010	600LP NanoBRET & M460/50 nm NanoBRET emmisions filters,  Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time
Invitrogen Countess™ II Automated Cell Counter	Thermo Scientific	AMQAX1000
ThermoFisher E1-ClipTip™  Multichannel  Pipettor	Thermo Scientific	4672070
Software
GraphPad Prism (version 10.0.3)	GraphPad	www.graphpad.com
Other
ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips	Thermo Scientific	94410153
Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile	Thomas Scientific	1228K16
Perkin Elmer 384-well CulturPlate™	PerkinElmer	6007680	White, polystyrene, tissue culture treated
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermo Scientific	C10228