Biolumineszenz-Resonanz-Energietransfer (BRET)-basierter Assay zur Messung der Wechselwirkungen von CRAF mit 14-3-3-Proteinen in lebenden Zellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen BRET-basierten Assay zur Messung der Wechselwirkungen der CRAF-Kinase mit 14-3-3-Proteinen in lebenden Zellen. Das Protokoll beschreibt die Schritte zur Vorbereitung der Zellen, zum Ablesen der BRET-Emissionen und zur Datenanalyse. Ein Beispielergebnis mit der Identifizierung geeigneter Kontrollen und der Fehlerbehebung für die Assay-Optimierung wird ebenfalls vorgestellt.

Zusammenfassung

CRAF ist ein primärer Effektor von RAS-GTPasen und spielt eine entscheidende Rolle bei der Tumorgenese mehrerer KRAS-getriebener Krebsarten. Darüber hinaus ist CRAF ein Hotspot für Keimbahnmutationen, die nachweislich die entwicklungsbedingte RASopathie, das Noonan-Syndrom, verursachen. Alle RAF-Kinasen enthalten mehrere phosphorylierungsabhängige Bindungsstellen für 14-3-3-regulatorische Proteine. Die differentielle Bindung von 14-3-3 an diese Stellen spielt eine wesentliche Rolle bei der Bildung aktiver RAF-Dimere an der Plasmamembran unter Signalbedingungen und bei der Aufrechterhaltung der RAF-Autoinhibition unter Ruhebedingungen. Zu verstehen, wie diese Wechselwirkungen reguliert werden und wie sie moduliert werden können, ist entscheidend für die Identifizierung neuer therapeutischer Ansätze, die auf die RAF-Funktion abzielen. Hier beschreibe ich einen auf Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer (BRET) basierenden Assay zur Messung der Wechselwirkungen von CRAF mit 14-3-3-Proteinen in lebenden Zellen. Insbesondere misst dieser Assay die Wechselwirkungen von CRAF, das mit einem Nano-Luciferase-Donor fusioniert ist, und 14-3-3, das mit einem Halo-Tag-Akzeptor fusioniert ist, wobei die Interaktion von RAF und 14-3-3 zu einem Energietransfer zwischen Donor und Akzeptor und der Erzeugung des BRET-Signals führt. Das Protokoll zeigt ferner, dass dieses Signal durch Mutationen gestört werden kann, die nachweislich die Bindung von 14-3-3 an jede seiner hochaffinen RAF-Andockstellen verhindern. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren für die Aussaat, Transfektion und Neubeschichtung der Zellen sowie detaillierte Anweisungen zum Ablesen von BRET-Emissionen, zur Durchführung der Datenanalyse und zur Bestätigung der Proteinexpressionsniveaus. Darüber hinaus werden Beispiel-Assay-Ergebnisse sowie Optimierungs- und Fehlerbehebungsschritte bereitgestellt.

Einleitung

RAF-Kinasen (ARAF, BRAF und CRAF) sind die direkten Effektoren der RAS-GTPasen und die initiierenden Mitglieder der pro-proliferativen/überlebensfördernden RAF-MEK-ERK-Kinase-Kaskade. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die CRAF-Expression eine Schlüsselrolle bei der Tumorgenese mehrerer KRAS-getriebener Krebsarten spielt, darunter nicht-kleinzelliger Lungenkrebs und duktales Adenokarzinom^der Bauchspeicheldrüse 1,2,3,4,5. Darüber hinaus verursachen Keimbahn-CRAF-Mutationen eine besonders schwere Form der R....

Protokoll

HINWEIS: Dieser Assay wird in 293FT-Zellen durchgeführt. Eine gut charakterisierte und leicht transfizierbare Epithellinie, die aus menschlichen embryonalen Nierenzellen gewonnen wird. Eine einzelne konfluente 10-cm-Kulturschale dieser Zellen liefert in der Regel genügend Zellen für die Aussaat von 20 Wells mit 6-Well-Gewebekulturplatten. Die Schritte 1-3 müssen in steriler Technik in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden.

1. Aussaat der Zellen (Tag 1)

HINWEIS: In diesem Schritt werden die Zellen von der/den Gewebekulturschale(n) gelöst, gezählt und in 6-Well-Gewebekulturplatte....

Diskussion

Frühere Studien haben gezeigt, dass 14-3-3-Proteine eine entscheidende Rolle sowohl bei der Aktivierung als auch bei der Hemmung von RAF-Kinasen spielen. Das Verständnis, wie diese Bindungsereignisse reguliert werden und welche Auswirkungen die Modulation dieser Wechselwirkungen auf die RAF-Signalgebung und die RAF-gesteuerte Onkogenese hat, könnte neue therapeutische Schwachstellen aufdecken, die auf die CRAF-Funktion abzielen. Der Raf-Aktivierungszyklus wird jedoch durch eine Vielzahl von assoziierten Proteinen, pos.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
HaloTag® mouse monoclonal antibody	Promega	G9211	Antibody for detecting HaloTag tagged  proteins by immunoblot
NanoLuc® mouse monoclonal antibody	R&D Systems	MAB10026	Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot
CRAF mouse monoclonal antibody (E10)	Santa Crus Biotechnology	sc-7267	Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot
ECL anti-mouse HRP secondary antibody	Amersham	NA931-1ML	Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep)
Reagents
X-tremeGENE™ 9	Roche/Sigma	6365809001
NanoBRET™ kit	Promega	N1661	NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate
DPBS, without Ca++ and Mg++	Quality Biologicals	114-057-101
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Life Technologies	25300120
DMEM cell culture media	Life Technologies	11995073	High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium  pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin
L-Glutamine (200 mM)	Life Technologies	25030164
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140163
Opti-MEM™ I reduced serum media	Gibco	31985062	For cell transfection
Opti-MEM reduced serum media, no phenol red	Gibco	11058021	For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated).
Invitrogen Trypan Blue Stain	Thermo Scientific	T10282
NP40 lysis buffer	N/A	N/A	20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol,  NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 µM leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF.
5x gel sample buffer	N/A	N/A	240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C.
Cell lines
293FT cells (human)	Thermo Scientific	R70007
DNA vectors
pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant	N/A	N/A
pCMV5-14-3-3ζ-Halo	N/A	N/A
Equipment
EnVision 2104 Multimode Plate Reader	PerkinElmer 2104	2104-0010	600LP NanoBRET & M460/50 nm NanoBRET emmisions filters,  Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time
Invitrogen Countess™ II Automated Cell Counter	Thermo Scientific	AMQAX1000
ThermoFisher E1-ClipTip™  Multichannel  Pipettor	Thermo Scientific	4672070
Software
GraphPad Prism (version 10.0.3)	GraphPad	www.graphpad.com
Other
ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips	Thermo Scientific	94410153
Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile	Thomas Scientific	1228K16
Perkin Elmer 384-well CulturPlate™	PerkinElmer	6007680	White, polystyrene, tissue culture treated
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermo Scientific	C10228