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Dieses Protokoll beschreibt einen BRET-basierten Assay zur Messung der Wechselwirkungen der CRAF-Kinase mit 14-3-3-Proteinen in lebenden Zellen. Das Protokoll beschreibt die Schritte zur Vorbereitung der Zellen, zum Ablesen der BRET-Emissionen und zur Datenanalyse. Ein Beispielergebnis mit der Identifizierung geeigneter Kontrollen und der Fehlerbehebung für die Assay-Optimierung wird ebenfalls vorgestellt.
CRAF ist ein primärer Effektor von RAS-GTPasen und spielt eine entscheidende Rolle bei der Tumorgenese mehrerer KRAS-getriebener Krebsarten. Darüber hinaus ist CRAF ein Hotspot für Keimbahnmutationen, die nachweislich die entwicklungsbedingte RASopathie, das Noonan-Syndrom, verursachen. Alle RAF-Kinasen enthalten mehrere phosphorylierungsabhängige Bindungsstellen für 14-3-3-regulatorische Proteine. Die differentielle Bindung von 14-3-3 an diese Stellen spielt eine wesentliche Rolle bei der Bildung aktiver RAF-Dimere an der Plasmamembran unter Signalbedingungen und bei der Aufrechterhaltung der RAF-Autoinhibition unter Ruhebedingungen. Zu verstehen, wie diese Wechselwirkungen reguliert werden und wie sie moduliert werden können, ist entscheidend für die Identifizierung neuer therapeutischer Ansätze, die auf die RAF-Funktion abzielen. Hier beschreibe ich einen auf Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer (BRET) basierenden Assay zur Messung der Wechselwirkungen von CRAF mit 14-3-3-Proteinen in lebenden Zellen. Insbesondere misst dieser Assay die Wechselwirkungen von CRAF, das mit einem Nano-Luciferase-Donor fusioniert ist, und 14-3-3, das mit einem Halo-Tag-Akzeptor fusioniert ist, wobei die Interaktion von RAF und 14-3-3 zu einem Energietransfer zwischen Donor und Akzeptor und der Erzeugung des BRET-Signals führt. Das Protokoll zeigt ferner, dass dieses Signal durch Mutationen gestört werden kann, die nachweislich die Bindung von 14-3-3 an jede seiner hochaffinen RAF-Andockstellen verhindern. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren für die Aussaat, Transfektion und Neubeschichtung der Zellen sowie detaillierte Anweisungen zum Ablesen von BRET-Emissionen, zur Durchführung der Datenanalyse und zur Bestätigung der Proteinexpressionsniveaus. Darüber hinaus werden Beispiel-Assay-Ergebnisse sowie Optimierungs- und Fehlerbehebungsschritte bereitgestellt.
RAF-Kinasen (ARAF, BRAF und CRAF) sind die direkten Effektoren der RAS-GTPasen und die initiierenden Mitglieder der pro-proliferativen/überlebensfördernden RAF-MEK-ERK-Kinase-Kaskade. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die CRAF-Expression eine Schlüsselrolle bei der Tumorgenese mehrerer KRAS-getriebener Krebsarten spielt, darunter nicht-kleinzelliger Lungenkrebs und duktales Adenokarzinomder Bauchspeicheldrüse 1,2,3,4,5. Darüber hinaus verursachen Keimbahn-CRAF-Mutationen eine besonders schwere Form der RASopathie, das Noonan-Syndrom 6,7. Das Verständnis der CRAF-Regulation ist entscheidend für die Entwicklung erfolgreicher therapeutischer Ansätze, die auf seine Funktion in Zellen abzielen.
Alle RAF-Kinasen können in zwei funktionelle Domänen unterteilt werden, eine C-terminale katalytische (CAT) Domäne und eine N-terminale regulatorische (REG) Domäne, die ihre Aktivität steuert (Abbildung 1A)8. Die REG-Domäne umfasst die RAS-Bindungsdomäne (RBD), die Cystein-reiche Domäne (CRD) und eine serin/Threonin-reiche Region (S/T-reich). Bemerkenswert ist, dass die S/T-reiche Region die N'-Stelle enthält, die phosphorylierungsabhängig an 14-3-3 bindet (S259 in CRAF; Abbildung 1A) 8. Die CAT-Domäne umfasst die Kinase-Domäne zusammen mit einer zweiten hochaffinen 14-3-3-Andockstelle, die als C'-Stelle bezeichnet wird (S621 in CRAF; Abbildung 1A) 8. Die differentielle Bindung von dimeren 14-3-3-Proteinen an die N'- und C'-Stellen spielt zusammen mit der CRD eine entscheidende Rolle sowohl bei der RAF-Aktivierung als auch bei der Hemmung 9,10,11,12,13. Unter normalen Signalbedingungen wird die RAF-Aktivierung durch seine Rekrutierung an die Plasmamembran durch RAS initiiert, wodurch aktive Dimere gebildet werden können, von denen das BRAF-CRAF-Heterodimer die vorherrschende aktive Formist 14,15. Biochemische Assays mit BRAF und CRAF sowie kryogene Elektronenmikroskopie-Strukturen (Kryo-EM) von dimerem BRAF deuten darauf hin, dass ein 14-3-3-Dimer aktive RAF-Dimere stabilisiert, indem es gleichzeitig an die C'-Stelle beider RAF-Protomere bindet (Abbildung 1B)9,13,16,17. Umgekehrt haben Studien gezeigt, dass RAF unter Ruhebedingungen eine zytosolische, autoinhibierte Bestätigung annimmt, bei der die REG-Domäne an die CAT-Domäne bindet und deren Aktivität hemmt 12,18,19,20. Dieser geschlossene Zustand wird durch ein 14-3-3-Dimer stabilisiert, das an die CRD- und N'-Stelle in der REG-Domäne und an die C'-Stelle in der CAT-Domäne gebunden ist (Abbildung 1B)10,13,21. Bei BRAF wird dieses Modell durch neuere Kryo-EM-Strukturen von autoinhibierten BRAF-Monomeren und durch unsere früheren biochemischen Studienunterstützt 10,12,13,21,22. Während jedoch gezeigt wurde, dass 14-3-3 eine hemmende Rolle bei der CRAF-Regulationspielt 23, könnte ein BRAF-ähnlicher autoinhibierter Zustand eine geringere Rolle bei der CRAF-Regulation spielen12; daher sind weitere Studien erforderlich, um die Mechanismen zu klären, durch die 14-3-3-Proteine die CRAF-Aktivität regulieren. Die 14-3-3-vermittelte Regulation von RAF-Kinasen erfordert eine Vielzahl von RAF-Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsereignissen, die Bindung an verschiedene regulatorische Proteine und Wechselwirkungen mit der Plasmamembran8. Daher ist es wichtig, dass 14-3-3-RAF-Wechselwirkungen unter physiologisch relevanten Bedingungen und in Gegenwart einer intakten Lipiddoppelschicht gemessen werden.
Um dieses Problem zu lösen, wurde die NanoBRET-Technologie (im Folgenden als N-BRET bezeichnet; siehe Materialtabelle für Details zum Kit) eingesetzt, um einen näherungsbasierten Assay zur Messung der Wechselwirkungen von CRAF mit 14-3-3-Proteinen in lebenden Zellen zu entwickeln (Abbildung 1C). Dieses BRET-basierte System misst die Wechselwirkungen von zwei Proteinen von Interesse (POI), wobei ein Protein mit einem Nanoluciferase (Nano)-Donor und das andere mit einem Halo-Tag markiert wird, um mit dem Halo618-Energieakzeptorliganden22,24 markiert zu werden. Die Interaktion der interessierenden Proteine führt zu einem Energietransfer von Donor zu Akzeptor, der wiederum das BRET-Signal erzeugt (Abbildung 1C). Das extrem helle Nano-Donorprotein (Emission (em) 460 nm) und der Halo618-Ligand (em 618 nm) bieten eine größere spektrale Trennung und Empfindlichkeit als herkömmliche BRET, was es zu einer idealen Plattform für die Untersuchung schwächerer Wechselwirkungen und den Nachweis subtiler Änderungen in der Bindungmacht 24. In der Tat haben wir zuvor einen N-BRET-basierten Assay zur Messung der autoinhibitorischen Wechselwirkungen der RAF REG- und CAT-Domänen entwickelt, der für die Charakterisierung einer Reihe von RASopathie-Mutationen in der BRAF-CRD unerlässlich war und die entscheidende Bedeutung dieser Domäne für die Aufrechterhaltung der Autoinhibition und die Verhinderung der konstitutiven BRAF-Aktivierung demonstrierte12.
Der hier beschriebene Assay misst die Wechselwirkungen von CRAF, das mit einem N-terminalen Nano-Tag (Nano-CRAF) fusioniert ist, und der Zeta-Isoform von 14-3-3, die mit einem C-terminalen Halo-Tag fusioniert ist (14-3-3ζ-Halo; Abbildung 1C). Wir zeigen, dass die Wechselwirkungen von Nano-CRAF mit 14-3-3ζ-Halo ein robustes BRET-Signal erzeugen, das wiederum durch Mutationen gestört werden kann, die eine Bindung von 14-3-3 an die N'-Stelle (S259A) und/oder die C'-Stelle (S621A) verhindern. Das folgende Protokoll enthält detaillierte Schritte zur Durchführung, Optimierung und Fehlerbehebung dieses Assays.
HINWEIS: Dieser Assay wird in 293FT-Zellen durchgeführt. Eine gut charakterisierte und leicht transfizierbare Epithellinie, die aus menschlichen embryonalen Nierenzellen gewonnen wird. Eine einzelne konfluente 10-cm-Kulturschale dieser Zellen liefert in der Regel genügend Zellen für die Aussaat von 20 Wells mit 6-Well-Gewebekulturplatten. Die Schritte 1-3 müssen in steriler Technik in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden.
1. Aussaat der Zellen (Tag 1)
HINWEIS: In diesem Schritt werden die Zellen von der/den Gewebekulturschale(n) gelöst, gezählt und in 6-Well-Gewebekulturplatten für die Transfektion in Schritt 2 ausgesät (Abbildung 2).
2. Zelltransfektion (Tag 2)
HINWEIS: Hier werden die Zellen mit den Expressionskonstrukten pCMV5-NanoLuc-CRAF und pCMV5-14-3-3ζ-Halo zusammen mit dem leeren Vektor pCDNA3.1 transfiziert (Abbildung 2).
3. Neubeschichtung der Zellen (Tag 3)
HINWEIS: In diesem Schritt werden die Zellen auf eine 384-Well-Platte übertragen und entweder Halo 618-Ligand (+Ligand; Tabelle der Materialien) oder DMSO (+Fahrzeug) wird zum Ablesen der BRET-Emissionen in Schritt 4 hinzugefügt. Die verbleibenden Zellen werden für die Western-Blot-Analyse in Schritt 5 auf frische 6-Well-Kulturplatten überführt (Abbildung 2).
4. Ablesen der BRET-Emissionen (Tag 4)
HINWEIS: In diesem Schritt wird das Nanoluziferase-Substrat (siehe Materialtabelle für Details) zu den Zellen in der 384-Well-Kulturplatte hinzugefügt und die N-BRET-Akzeptor- (618 nm) und Donor-Emissionen (460 nm) werden abgelesen (Abbildung 2). Anschließend werden die korrigierten BRET-Verhältnisse berechnet.
5. Bestätigung der Proteinexpressionsniveaus (Tage 4 und 5)
HINWEIS: In diesem Schritt werden die Zellen in den 6-Well-Platten lysiert und die Proteinexpressionsniveaus der Nano-CRAF- und 14-3-3ζ-Halo-Proteine durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Antikörpern, die für die Halo- und Nano-Tags spezifisch sind, bestimmt. (Abbildung 2).
Wenn die Wechselwirkung von Nano-CRAFWT und 14-3-3ζ-Halo wie in diesem Protokoll beschrieben durchgeführt wird, sollte sie korrigierte BRET-Verhältnisse von 50-60 mBU erzeugen (Abbildung 3A; Ergänzende Tabelle 1). CRAF enthält zwei phosphorylierungsabhängige 14-3-3-Andockstellen, die N'-Stelle und die C'-Stelle (Abbildung 1)8. Daher umfassen geeignete Kontrollen zur Verringer...
Frühere Studien haben gezeigt, dass 14-3-3-Proteine eine entscheidende Rolle sowohl bei der Aktivierung als auch bei der Hemmung von RAF-Kinasen spielen. Das Verständnis, wie diese Bindungsereignisse reguliert werden und welche Auswirkungen die Modulation dieser Wechselwirkungen auf die RAF-Signalgebung und die RAF-gesteuerte Onkogenese hat, könnte neue therapeutische Schwachstellen aufdecken, die auf die CRAF-Funktion abzielen. Der Raf-Aktivierungszyklus wird jedoch durch eine Vielzahl von assoziierten Proteinen, pos...
Nichts offenzulegen.
Dieses Projekt wurde teilweise mit Bundesmitteln des National Cancer Institute, National Institutes of Health, unter der Projektnummer ZIA BC 010329 finanziert.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibodies | |||
HaloTag® mouse monoclonal antibody | Promega | G9211 | Antibody for detecting HaloTag tagged proteins by immunoblot |
NanoLuc® mouse monoclonal antibody | R&D Systems | MAB10026 | Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot |
CRAF mouse monoclonal antibody (E10) | Santa Crus Biotechnology | sc-7267 | Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot |
ECL anti-mouse HRP secondary antibody | Amersham | NA931-1ML | Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep) |
Reagents | |||
X-tremeGENE™ 9 | Roche/Sigma | 6365809001 | |
NanoBRET™ kit | Promega | N1661 | NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate |
DPBS, without Ca++ and Mg++ | Quality Biologicals | 114-057-101 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Life Technologies | 25300120 | |
DMEM cell culture media | Life Technologies | 11995073 | High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin |
L-Glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030164 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140163 | |
Opti-MEM™ I reduced serum media | Gibco | 31985062 | For cell transfection |
Opti-MEM reduced serum media, no phenol red | Gibco | 11058021 | For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated). |
Invitrogen Trypan Blue Stain | Thermo Scientific | T10282 | |
NP40 lysis buffer | N/A | N/A | 20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol, NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 µM leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF. |
5x gel sample buffer | N/A | N/A | 240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C. |
Cell lines | |||
293FT cells (human) | Thermo Scientific | R70007 | |
DNA vectors | |||
pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant | N/A | N/A | |
pCMV5-14-3-3ζ-Halo | N/A | N/A | |
Equipment | |||
EnVision 2104 Multimode Plate Reader | PerkinElmer 2104 | 2104-0010 | 600LP NanoBRET & M460/50 nm NanoBRET emmisions filters, Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time |
Invitrogen Countess™ II Automated Cell Counter | Thermo Scientific | AMQAX1000 | |
ThermoFisher E1-ClipTip™ Multichannel Pipettor | Thermo Scientific | 4672070 | |
Software | |||
GraphPad Prism (version 10.0.3) | GraphPad | www.graphpad.com | |
Other | |||
ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips | Thermo Scientific | 94410153 | |
Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile | Thomas Scientific | 1228K16 | |
Perkin Elmer 384-well CulturPlate™ | PerkinElmer | 6007680 | White, polystyrene, tissue culture treated |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 |
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