Ensayo basado en transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET) para medir las interacciones de CRAF con proteínas 14-3-3 en células vivas

Resumen

Este protocolo describe un ensayo basado en BRET para medir las interacciones de la quinasa CRAF con las proteínas 14-3-3 en células vivas. El protocolo describe los pasos para la preparación de las celdas, la lectura de las emisiones BRET y el análisis de datos. También se presenta un ejemplo de resultado con la identificación de los controles adecuados y la resolución de problemas para la optimización del ensayo.

Resumen

El CRAF es un efector primario de las GTPasas RAS y desempeña un papel fundamental en la tumorigénesis de varios cánceres impulsados por KRAS. Además, el CRAF es un punto caliente para las mutaciones de la línea germinal, que se ha demostrado que causan la RASopatía del desarrollo, síndrome de Noonan. Todas las quinasas RAF contienen múltiples sitios de unión dependientes de la fosforilación para las proteínas reguladoras 14-3-3. La unión diferencial de 14-3-3 a estos sitios desempeña un papel esencial en la formación de dímeros activos de RAF en la membrana plasmática en condiciones de señalización y en el mantenimiento de la autoinhibición de RAF en condiciones de reposo. Comprender cómo se regulan estas interacciones y cómo se pueden modular es fundamental para identificar nuevos enfoques terapéuticos que se dirijan a la función de la RAF. Aquí, describo un ensayo basado en la transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET) para medir las interacciones de CRAF con proteínas 14-3-3 en células vivas. En concreto, este ensayo mide las interacciones de CRAF fusionado con un donante de nanoluciferasa y 14-3-3 fusionado con un aceptor de etiquetas Halo, donde la interacción de RAF y 14-3-3 da lugar a la transferencia de energía de donante a aceptor y a la generación de la señal BRET. El protocolo muestra además que esta señal puede ser interrumpida por mutaciones que se ha demostrado que evitan la unión de 14-3-3 a cada uno de sus sitios de acoplamiento RAF de alta afinidad. Este protocolo describe los procedimientos para sembrar, transfectar y replantear las células, junto con instrucciones detalladas para leer las emisiones de BRET, realizar análisis de datos y confirmar los niveles de expresión de proteínas. Además, se proporcionan ejemplos de resultados de ensayos, junto con pasos de optimización y solución de problemas.

Introducción

Las quinasas RAF (ARAF, BRAF y CRAF) son los efectores directos de las GTPasas RAS y los miembros iniciadores de la cascada de quinasas RAF-MEK-ERK pro-proliferativa/pro-supervivencia. Estudios recientes han demostrado que la expresión de CRAF desempeña un papel clave en la tumorigénesis de varios cánceres impulsados por KRAS, incluido el cáncer de pulmón de células no pequeñas y el adenocarcinoma ductal de páncreas 1,2,3,4,5. Además, las mutaciones de la línea germinal en CRAF causan una forma particularme....

Protocolo

NOTA: Este ensayo se realiza en celdas de 293 pies. Una línea epitelial bien caracterizada y fácilmente transfectable derivada de células embrionarias de riñón humano. Una sola placa de cultivo confluente de 10 cm de estas células suele proporcionar suficientes células para sembrar 20 pocillos de placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos. Los pasos 1 a 3 deben realizarse utilizando técnica estéril en una cabina de seguridad biológica.

1. Siembra de células (Día 1)

NOTA: En este paso, las células se separan de la(s) placa(s) de cultivo de tejidos, se cuentan y se siembran en placas de cultivo de te....

Discusión

Estudios previos han demostrado que las proteínas 14-3-3 desempeñan un papel fundamental tanto en la activación como en la inhibición de las quinasas RAF. Comprender cómo se regulan estos eventos de unión y los efectos de la modulación de estas interacciones en la señalización de RAF y la oncogénesis impulsada por RAF puede descubrir nuevas vulnerabilidades terapéuticas que se dirigen a la función de CRAF. Sin embargo, el ciclo de activación de Raf está respaldado por una gran cantidad de proteínas asociad.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
HaloTag® mouse monoclonal antibody	Promega	G9211	Antibody for detecting HaloTag tagged  proteins by immunoblot
NanoLuc® mouse monoclonal antibody	R&D Systems	MAB10026	Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot
CRAF mouse monoclonal antibody (E10)	Santa Crus Biotechnology	sc-7267	Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot
ECL anti-mouse HRP secondary antibody	Amersham	NA931-1ML	Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep)
Reagents
X-tremeGENE™ 9	Roche/Sigma	6365809001
NanoBRET™ kit	Promega	N1661	NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate
DPBS, without Ca++ and Mg++	Quality Biologicals	114-057-101
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Life Technologies	25300120
DMEM cell culture media	Life Technologies	11995073	High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium  pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin
L-Glutamine (200 mM)	Life Technologies	25030164
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140163
Opti-MEM™ I reduced serum media	Gibco	31985062	For cell transfection
Opti-MEM reduced serum media, no phenol red	Gibco	11058021	For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated).
Invitrogen Trypan Blue Stain	Thermo Scientific	T10282
NP40 lysis buffer	N/A	N/A	20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol,  NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 µM leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF.
5x gel sample buffer	N/A	N/A	240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C.
Cell lines
293FT cells (human)	Thermo Scientific	R70007
DNA vectors
pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant	N/A	N/A
pCMV5-14-3-3ζ-Halo	N/A	N/A
Equipment
EnVision 2104 Multimode Plate Reader	PerkinElmer 2104	2104-0010	600LP NanoBRET & M460/50 nm NanoBRET emmisions filters,  Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time
Invitrogen Countess™ II Automated Cell Counter	Thermo Scientific	AMQAX1000
ThermoFisher E1-ClipTip™  Multichannel  Pipettor	Thermo Scientific	4672070
Software
GraphPad Prism (version 10.0.3)	GraphPad	www.graphpad.com
Other
ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips	Thermo Scientific	94410153
Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile	Thomas Scientific	1228K16
Perkin Elmer 384-well CulturPlate™	PerkinElmer	6007680	White, polystyrene, tissue culture treated
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermo Scientific	C10228