Canlı Hücrelerde CRAF'ın 14-3-3 Proteinleri ile Etkileşimlerinin Ölçülmesi için Biyolüminesans Rezonans Enerji Transferi (BRET) Tabanlı Test

Özet

Bu protokol, canlı hücrelerde CRAF kinazın 14-3-3 proteinleri ile etkileşimlerini ölçmek için BRET tabanlı bir testi tanımlar. Protokol, hücrelerin hazırlanması, BRET emisyonlarının okunması ve veri analizi için adımların ana hatlarını çizmektedir. Tahlil optimizasyonu için uygun kontrollerin tanımlanması ve sorun gidermenin yer aldığı örnek bir sonuç da sunulmaktadır.

Özet

CRAF, RAS GTPazların birincil efektörüdür ve KRAS kaynaklı çeşitli kanserlerin tümör oluşumunda kritik bir rol oynar. Ek olarak, CRAF, gelişimsel RASopati, Noonan sendromuna neden olduğu gösterilen germ hattı mutasyonları için bir sıcak noktadır. Tüm RAF kinazlar, 14-3-3 düzenleyici proteinler için çoklu fosforilasyona bağlı bağlanma bölgeleri içerir. 14-3-3'ün bu bölgelere diferansiyel bağlanması, sinyalleşme koşulları altında plazma zarında aktif RAF dimerlerinin oluşumunda ve hareketsiz koşullar altında RAF otoinhibisyonunun sürdürülmesinde önemli roller oynar. Bu etkileşimlerin nasıl düzenlendiğini ve nasıl modüle edilebileceğini anlamak, RAF fonksiyonunu hedefleyen yeni terapötik yaklaşımları belirlemek için kritik öneme sahiptir. Burada, CRAF'ın canlı hücrelerde 14-3-3 proteinleri ile etkileşimlerini ölçmek için biyolüminesans rezonans enerji transferi (BRET) tabanlı bir testi anlatıyorum. Spesifik olarak, bu tahlil, bir Nano lusiferaz donörüne kaynaşmış CRAF ve bir Halo etiket alıcısına kaynaşmış 14-3-3'ün etkileşimlerini ölçer, burada RAF ve 14-3-3'ün etkileşimi, vericiden alıcıya enerji transferi ve BRET sinyalinin üretilmesi. Protokol ayrıca, bu sinyalin, yüksek afiniteli RAF yerleştirme bölgelerinin her birine 14-3-3 bağlanmasını önlediği gösterilen mutasyonlar tarafından bozulabileceğini göstermektedir. Bu protokol, BRET emisyonlarını okumak, veri analizi yapmak ve protein ekspresyon seviyelerini doğrulamak için ayrıntılı talimatlarla birlikte hücrelerin tohumlanması, transfekte edilmesi ve yeniden kaplanması prosedürlerini açıklar. Ek olarak, optimizasyon ve sorun giderme adımlarıyla birlikte örnek tahlil sonuçları sağlanır.

Giriş

RAF kinazlar (ARAF, BRAF ve CRAF), RAS, GTPazların doğrudan efektörleri ve pro-proliferatif / pro-hayatta kalma yanlısı RAF-MEK-ERK kinaz kaskadının başlatıcı üyeleridir. Son çalışmalar, CRAF ekspresyonunun küçük hücreli dışı akciğer kanseri ve pankreas duktal adenokarsinomu 1,2,3,4,5 dahil olmak üzere KRAS kaynaklı çeşitli kanserlerin tümörijenezinde anahtar bir rol oynadığını göstermiştir. Ayrıca, germline CRAF mutasyonları, RASopati'nin özellikle şiddetli bir formu olan Noonan sendromuna

Protokol

NOT: Bu test 293FT hücrelerde gerçekleştirilir. İnsan embriyonik böbrek hücrelerinden türetilen, iyi karakterize edilmiş ve kolayca transfekte edilebilir bir epitel hattı. Bu hücrelerin tek bir birleşik 10 cm'lik kültür kabı tipik olarak 20 oyuklu 6 oyuklu doku kültürü plakalarının tohumlanması için yeterli hücre sağlar. Adım 1-3, biyolojik bir güvenlik kabininde steril teknik kullanılarak gerçekleştirilmelidir.

1. Hücre tohumlama (1. Gün)

NOT: Bu adımda, hücreler doku kültürü kabından/kaplarından ayrılır, sayılır ve 2. adımda transfeksiyon için 6 oyuklu doku kültürü plakalarına ekilir (

Tartışmalar

Önceki çalışmalar, 14-3-3 proteinlerinin RAF kinazların hem aktivasyonunda hem de inhibisyonunda kritik rol oynadığını göstermiştir. Bu bağlanma olaylarının nasıl düzenlendiğini ve bu etkileşimleri modüle etmenin RAF sinyalizasyonu ve RAF güdümlü onkogenez üzerindeki etkilerini anlamak, CRAF fonksiyonunu hedef alan yeni terapötik güvenlik açıklarını ortaya çıkarabilir. Bununla birlikte, Raf aktivasyon döngüsü, çok sayıda ilişkili protein, translasyon sonrası modifikasyonlar ve hücre.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
HaloTag® mouse monoclonal antibody	Promega	G9211	Antibody for detecting HaloTag tagged  proteins by immunoblot
NanoLuc® mouse monoclonal antibody	R&D Systems	MAB10026	Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot
CRAF mouse monoclonal antibody (E10)	Santa Crus Biotechnology	sc-7267	Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot
ECL anti-mouse HRP secondary antibody	Amersham	NA931-1ML	Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep)
Reagents
X-tremeGENE™ 9	Roche/Sigma	6365809001
NanoBRET™ kit	Promega	N1661	NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate
DPBS, without Ca++ and Mg++	Quality Biologicals	114-057-101
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Life Technologies	25300120
DMEM cell culture media	Life Technologies	11995073	High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium  pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin
L-Glutamine (200 mM)	Life Technologies	25030164
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140163
Opti-MEM™ I reduced serum media	Gibco	31985062	For cell transfection
Opti-MEM reduced serum media, no phenol red	Gibco	11058021	For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated).
Invitrogen Trypan Blue Stain	Thermo Scientific	T10282
NP40 lysis buffer	N/A	N/A	20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol,  NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 µM leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF.
5x gel sample buffer	N/A	N/A	240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C.
Cell lines
293FT cells (human)	Thermo Scientific	R70007
DNA vectors
pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant	N/A	N/A
pCMV5-14-3-3ζ-Halo	N/A	N/A
Equipment
EnVision 2104 Multimode Plate Reader	PerkinElmer 2104	2104-0010	600LP NanoBRET & M460/50 nm NanoBRET emmisions filters,  Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time
Invitrogen Countess™ II Automated Cell Counter	Thermo Scientific	AMQAX1000
ThermoFisher E1-ClipTip™  Multichannel  Pipettor	Thermo Scientific	4672070
Software
GraphPad Prism (version 10.0.3)	GraphPad	www.graphpad.com
Other
ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips	Thermo Scientific	94410153
Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile	Thomas Scientific	1228K16
Perkin Elmer 384-well CulturPlate™	PerkinElmer	6007680	White, polystyrene, tissue culture treated
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermo Scientific	C10228