Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) - בדיקה מבוססת למדידת אינטראקציות של CRAF עם 14-3-3 חלבונים בתאים חיים

Summary

פרוטוקול זה מתאר בדיקה מבוססת BRET למדידת האינטראקציות של קינאז CRAF עם 14-3-3 חלבונים בתאים חיים. הפרוטוקול מתאר שלבים להכנת התאים, קריאת פליטות BRET וניתוח נתונים. מוצגת גם תוצאה לדוגמה עם זיהוי בקרות מתאימות ופתרון בעיות עבור מיטוב מבחן.

Abstract

CRAF הוא גורם משפיע עיקרי על RAS GTPases וממלא תפקיד קריטי בגידולים של מספר סוגי סרטן המונעים על ידי KRAS. בנוסף, CRAF הוא נקודה חמה למוטציות בקו הנבט, אשר הוכחו כגורמות לראסופתיה התפתחותית, תסמונת נונאן. כל הקינאזות של חיל האוויר המלכותי מכילות אתרי קישור מרובים תלויי זרחן עבור 14-3-3 חלבוני רגולציה. הקשירה הדיפרנציאלית של 14-3-3 לאתרים אלה ממלאת תפקיד חיוני ביצירת דימרים פעילים של חיל האוויר המלכותי בקרום הפלזמה בתנאי איתות ובשמירה על עיכוב עצמי של חיל האוויר המלכותי בתנאי שקט. הבנת האופן שבו אינטראקציות אלה מווסתות וכיצד ניתן לווסת אותן היא קריטית לזיהוי גישות טיפוליות חדשות המכוונות לתפקוד חיל האוויר המלכותי. במאמר זה אני מתאר בדיקה מבוססת העברת אנרגיית תהודה ביולומינסנטית (BRET) למדידת האינטראקציות של CRAF עם 14-3-3 חלבונים בתאים חיים. באופן ספציפי, בדיקה זו מודדת את האינטראקציות של CRAF שהתמזגו לתורם ננו לוציפראז ו-14-3-3 התמזגו למקבל תג Halo, כאשר האינטראקציה של RAF ו-14-3-3 גורמת להעברת אנרגיה מתורם למקבל וליצירת אות RET. הפרוטוקול מראה עוד כי אות זה יכול להיות משובש על ידי מוטציות שהוכחו כמונעות קשירה של 14-3-3 לכל אחד מאתרי העגינה של חיל האוויר המלכותי בעל זיקה גבוהה. פרוטוקול זה מתאר את הליכי הזריעה, ההדבקה והציפוי מחדש של התאים, יחד עם הוראות מפורטות לקריאת פליטות BRE, ביצוע ניתוח נתונים ואישור רמות ביטוי חלבונים. בנוסף, תוצאות בדיקה לדוגמה, יחד עם שלבי מיטוב ופתרון בעיות, מסופקים.

Introduction

קינאזות של חיל האוויר המלכותי (ARAF, BRAF ו-CRAF) הן המשפיעות הישירות של RAS GTPases והחברים היוזמים של מפל הקינאז RAF-MEK-ERK התומך בשגשוג/הישרדות. מחקרים אחרונים הראו כי ביטוי CRAF ממלא תפקיד מפתח בגידולים של מספר סוגי סרטן המונעים על ידי KRAS, כולל סרטן ריאות של תאים לא קטנים ואדנוקרצינומה של צינור הלבלב 1,2,3,4,5. יתר על כן, מוטציות CRAF נבט לגרום צורה חמורה במיוחד של RASopathy, תסמונת Noonan ^6,7. הבנת ויסות CRAF היא קריטית לפיתוח גישות טיפוליות....

Protocol

הערה: בדיקה זו מבוצעת בתאים של 293FT. קו אפיתל מאופיין היטב וניתן להעברה בקלות הנגזר מתאי כליה עובריים אנושיים. צלחת תרבית אחת בקוטר 10 ס"מ של תאים אלה מספקת בדרך כלל מספיק תאים לזריעת 20 בארות של לוחות תרבית רקמה של 6 בארות. שלבים 1-3 חייבים להתבצע בטכניקה סטרילית בארון בטיחות ביולוגי.

1. זריעת תאים (יום 1)

הערה: בשלב הזה, התאים מנותקים מצלחת תרבית הרקמה, נספרים ונזרעים בצלחות תרבית רקמה של 6 בארות לצורך טרנספקציה בשלב 2 (איור 2).

1. שאפו את המדיה מהתאים בצלחת בקוטר 10 ס"מ. לשטוף תאים עם 5 מ"ל של מלוחים חוצצים פוספט (PBS) ולשאוף.
2. הוסף 1 מ"ל של חומצה....

תוצאות

כאשר היא מבוצעת כמתואר בפרוטוקול זה (איור 2), האינטראקציה של Nano-CRAF^WT ו-14-3-3ζ-Halo אמורה לייצר יחסי BRET מתוקנים של 50-60 mBU (איור 3A; טבלה משלימה 1). CRAF מכיל שני אתרי עגינה תלויי זרחן 14-3-3, אתר N' ואתר C (איור 1)⁸. לכן, בקרות מתאימות ל.......

Discussion

מחקרים קודמים הראו כי 14-3-3 חלבונים ממלאים תפקידים קריטיים הן בהפעלה והן בעיכוב של קינאזות RAF. הבנת האופן שבו אירועים קושרים אלה מוסדרים וההשפעות של אפנון אינטראקציות אלה על איתות RAF ואונקוגנזה מונעת על ידי חיל האוויר המלכותי עשויה לחשוף פגיעויות טיפוליות חדשות המכוונות לתפקוד CRAF. עם זאת, מ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
HaloTag® mouse monoclonal antibody	Promega	G9211	Antibody for detecting HaloTag tagged  proteins by immunoblot
NanoLuc® mouse monoclonal antibody	R&D Systems	MAB10026	Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot
CRAF mouse monoclonal antibody (E10)	Santa Crus Biotechnology	sc-7267	Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot
ECL anti-mouse HRP secondary antibody	Amersham	NA931-1ML	Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep)
Reagents
X-tremeGENE™ 9	Roche/Sigma	6365809001
NanoBRET™ kit	Promega	N1661	NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate
DPBS, without Ca++ and Mg++	Quality Biologicals	114-057-101
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Life Technologies	25300120
DMEM cell culture media	Life Technologies	11995073	High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium  pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin
L-Glutamine (200 mM)	Life Technologies	25030164
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140163
Opti-MEM™ I reduced serum media	Gibco	31985062	For cell transfection
Opti-MEM reduced serum media, no phenol red	Gibco	11058021	For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated).
Invitrogen Trypan Blue Stain	Thermo Scientific	T10282
NP40 lysis buffer	N/A	N/A	20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol,  NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 µM leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF.
5x gel sample buffer	N/A	N/A	240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C.
Cell lines
293FT cells (human)	Thermo Scientific	R70007
DNA vectors
pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant	N/A	N/A
pCMV5-14-3-3ζ-Halo	N/A	N/A
Equipment
EnVision 2104 Multimode Plate Reader	PerkinElmer 2104	2104-0010	600LP NanoBRET & M460/50 nm NanoBRET emmisions filters,  Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time
Invitrogen Countess™ II Automated Cell Counter	Thermo Scientific	AMQAX1000
ThermoFisher E1-ClipTip™  Multichannel  Pipettor	Thermo Scientific	4672070
Software
GraphPad Prism (version 10.0.3)	GraphPad	www.graphpad.com
Other
ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips	Thermo Scientific	94410153
Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile	Thomas Scientific	1228K16
Perkin Elmer 384-well CulturPlate™	PerkinElmer	6007680	White, polystyrene, tissue culture treated
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermo Scientific	C10228