JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نصف بروتوكولا للإنشاء الجراحي لإصابة فقدان العضلات الحجمي (VML) في مدع الفئران ، مما يوفر نموذجا قابلا للتكرار ويمكن الوصول إليه لدراسة إصابات العضلات القحفية الوجهية وعلاجها باستخدام المواد الحيوية مثل الهيدروجيل الجديد.

Abstract

يمكن أن تحدث إصابات فقدان العضلات الحجمي القحفية الوجهية (VML) نتيجة للصدمات الشديدة والاستئصال الجراحي والالتهاب والحالات الخلقية أو غيرها من الحالات المكتسبة. يتضمن علاج VML القحفي الوجهي نقل العضلات الجراحي والوظيفي. ومع ذلك ، فإن هذه الإجراءات غير قادرة على استعادة الوظيفة الطبيعية أو الإحساس أو التعبير ، والأكثر شيوعا ، لا يتم علاج هذه الحالات. تم إجراء القليل جدا من الأبحاث حول تجديد العضلات الهيكلية في النماذج الحيوانية ل VML القحفية الوجهية. تصف هذه المخطوطة نموذجا للفئران لدراسة إصابة VML في القحف الوجهي وبروتوكولا للتقييم النسيجي للمواد الحيوية في علاج هذه الإصابات. يتم تطبيق الهيدروجيل السائل والسقالات المجففة بالتجميد في وقت إنشاء VML الجراحي ، ويتم استئصال المضغات في نقاط زمنية نهائية تصل إلى 12 أسبوعا مع معدلات احتفاظ عالية ومضاعفات ضئيلة. يستخدم الهيماتوكسيلين واليوزين (HE) ، وثلاثي اللون ماسون ، والتحليل الكيميائي المناعي لتقييم معلمات تجديد العضلات الهيكلية بالإضافة إلى التوافق الحيوي والتعديل المناعي. بينما نوضح دراسة هيدروجيل قائم على حمض الهيالورونيك ، يوفر هذا النموذج وسيلة لتقييم التكرارات اللاحقة للمواد في إصابات VML.

Introduction

يمكن أن تؤدي الصدمات الشديدة والاستئصال الجراحي والالتهاب والحالات المكتسبة الأخرى إلى درجة من فقدان الأنسجة تطغى على آليات إصلاح العضلات الهيكلية الداخلية. يمكن أن يؤدي فقدان الخلايا والهياكل المقيمة التي تعزز عملية التجدد الأولية إلى إعادة تشكيل مرضية وتليف الأنسجة ، مما يؤدي إلى عجز طويل الأمد في الوظيفة والإحساس ويشار إليها باسم فقدان العضلات الحجمي (VML) 1،2،3. تتضمن الاستجابة الالتهابية لإصابات VML آلية موثقة جيدا ومعقدة تشمل البلاعم والسيتوكينات والخلايا العضلية التي تقدم العديد من الأهداف النظرية في الطبالتجديدي 4. في حين أن العديد من الدراسات المختبرية قد استخدمت هذه الأهداف في النماذج الحيوانية لعلاج VML للأطراف ، إلا أن هناك نقصا في الأبحاث حول تجديد عضلات الهيكل العظمي في النماذج الحيوانية ل VML القحفيةالوجهية 5،6،7.

يمكن أن ينتج فقدان الأنسجة القحفية الوجهية عن الحالات كما هو موضح سابقا ، ويمكن أن يحدث نقص الأنسجة القحفية الوجهية أيضا في الحالات الخلقية مثل الشق ، والذي ينطوي في بعض الحالات على نقص حجمي حقيقي في الأنسجة العضلية8،9. نظرا لأن عضلات المنطقة القحفية الوجهية مهمة للوظيفة وكذلك المظهر الجمالي ، فقد يكون للتأثيرات طويلة المدى ل VML معاناة نفسية كبيرة. تختلف العديد من جوانب العضلات الهيكلية القحفية الوجهية عن العضلة الهيكلية المشتقة من الجسيدات الموجودة في الأطراف ، بما في ذلك الاختلافات في التعبير الجيني ، والأصل الجنيني ، والنمط الظاهري للخلايا الساتلية ، وكمية الخلايا الساتلية ، وتكوين الألياف ، والهندسةالمعمارية 10،11،12،13. قد تؤدي هذه الاختلافات إلى إصابات VML تؤثر على العضلات القحفية الوجهية بشكل مختلف عن العضلات المشتقة من الجسد14،15. حتى الآن ، لم تترجم مناهج هندسة الأنسجة التي أثبتت أنها تزيد من التجديد في النماذج الحيوانية للأطراف VML بشكل مكافئ إلى نماذج VML القحفيةالوجهية 16. يؤكد هذا الحاجة إلى تحسين الأساليب في الجسم الحي لنماذج VML القحفية الوجهية للحيوانات.

في حين تم إجراء العديد من الدراسات في الجسم الحي على VML القحفية الوجهية ، فإن الدراسات صغيرة وإنشاء عيب قوي في العضلات القحفية الوجهية في النماذج الحيوانية يمثل تحديا8،13. أبلغ كيم وآخرون عن تطوير نموذج VML لمضغ الفأر. ومع ذلك ، قامت هذه الدراسة بتقييم الأنسجة فقط حتى 28 يوما بعد الإصابة وكان لديها قوة غير واضحة للكشف عن الاختلافات في النتائج النسيجية بين النقاطالزمنية 17. أبلغ رودريغيز وآخرون عن تطوير نموذج VML للأغنام القحفية الوجهية. ومع ذلك ، فقد أبلغوا عن تباين كبير داخل المجموعات التجريبية ، مما يشير إلى عدم التجانس في شدة الإصابة الجراحية الأولية16. هنا ، نبلغ عن بروتوكول نموذج VML الخاص بنا ونوضح فائدته في تقييم مناهج هندسة الأنسجة.

Protocol

أجريت هذه الدراسة وفقا لجميع اللوائح المعمول بها، بما في ذلك الالتزام بالتوصيات الموضحة في دليل رعاية واستخدام المختبر. وافق برنامج رعاية واستخدام المؤسسي بجامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو على جميع الإجراءات الحيوانية ورعاية ما بعد الجراحة (بروتوكول IACUC #AN195944-01).

1. جراحة VML

  1. تخدير ذكور فئران Sprague-Dawley في عمر 12 أسبوعا بوزن 276-300 جم في وعاء محكم الغلق باستخدام التخدير العام المتشادم بالإيزوفلوران بمعدل 1٪ -5٪ قبل نقلها إلى مجال جراحي معقم.
    1. ضع القوارض على جانبها الأيسر بحيث يتم تمديد الرقبة في وضع محايد وتركيب الأنف في مخروط الأنف المخدر ، مما يسمح بالتعرض للجانب الأيمن من الوجه.
    2. معدل تدفق الأيزوفلوران المستدق من الحث إلى معدل تدفق الصيانة (حوالي 2٪).
  2. ضع مرهم العين على عيون القوارض.
  3. مسح موقع الجراحة, يحدها خط بين الزاوية اليمنى من الفم, قاعدة الأذن اليمنى متفوقة, وزاوية الفك السفلي السفلي, من الفراء باستخدام كريم إزالة الشعر.
    1. قم بتطهير موقع العملية عدة مرات بحركة دائرية باستخدام كل من مقشر الإيثانول والبيتادين.
      ملاحظة: لا يتم استخدام اللف المعقم في هذا البروتوكول ، نظرا لحجم وموقع الوصول. يتم إجراء الإجراء باستخدام تقنية معقمة وفقا لإرشادات رعاية.
  4. قم بإنشاء شق طولي بطول 3-4 سم يمتد من وسادة الشعيرات اليمنى السفلية إلى الأذن اليمنى.
    1. ارفع سديلة الجلد ، مما يسمح بتصور المضغ الأيمن وكذلك الفروع الشدقية والفك السفلي للعصب الوجهي (الشكل 1 أ).
    2. قم بتنظيف الجلد من اللفافة الأساسية باستخدام فصل حاد وتثبيت حواف الجلد في وضع متراجعة باستخدام المشابك الجراحية للرؤية المثلى للعضلات الأساسية.
  5. قم بعمل شق عرضي بطول 1-2 سم في اللفافة التي تغطي الجزء الأمامي من المضطرب. استخدم الفصل غير الحاد لتوسيع المسافة بين اللفافة والمضاس مع الحرص على الحفاظ على السلامة العامة للفافة المتبقية.
  6. باستخدام شق اللفافة كنافذة على المدلك السطحي ، قم بإنشاء إصابة دائرية في العضلات بعرض 5 مم وعمقها 5 مم باستخدام خزعة مثقبة معقمة يمكن التخلص منها. تأكد من أن العيب يتركز بين الفروع الشدقية والفك السفلي للعصب الوجهي ، مع الحرص على تجنب صدمة الأعصاب (الشكل 1 ب).
  7. أضف المادة الحيوية إلى إصابة المضغة الدائرية (الشكل 1 ج).
  8. بمجرد وضع العامل في مكانه بشكل مناسب ، قم بخياطة نافذة اللفافة الاستثمارية للعضلات باستخدام خياطة واحدة 5-0 أحادية لتجنب الهجرة.
    ملاحظة: يتم وضع عوامل صلبة الشكل مباشرة في الجرح ، ويمكن أن تتزعج الأنسجة لتعزيز التشبع بالدم ، بينما تضاف العوامل السائلة وتسمح لها بالتجليل إذا لزم الأمر أو تغلق على الفور في مكانها باستخدام اللفافة لتجنب الحركة غير المرغوب فيها. في التجربة الموضحة هنا ، يتم إعطاء هلام مبرد قائم على حمض الهيالورونيك الأكريليت.
  9. أغلق الجلد باستخدام تقنية بسيطة متقطعة أو تحت الجلد مع 5-0 شعيرات أحادية.
    1. ضع غراء الجلد على الغرز للمساعدة في منع تفكك الشق بعد الجراحة.
  10. اسمح للفئران بالتعافي في قفص به مصدر تسخين خارجي (وسادة تسخين أسفل القفص أو تدفئة اليدين المعقمة في القفص) وراقب لمدة 30 دقيقة بعد الجراحة.
  11. يخفف مضاد حيوي تريميثوبريم-سلفاميثوكسازول (200 ملغ من تريميثوبريم و40 ملغ من سلفاميثوكسازول بمقدار 5 مل) في مياه الشرب (5 مل/200 مل ماء) وتطبيقه في مياه الشرب القوارض لمدة 7 أيام بعد الجراحة. التأكد من إجراء التسكين في الفترة المحيطة بالجراحة وفقا للبروتوكولات المؤسسية.
    ملاحظة: في هذه الدراسة، تم إعطاء 0.25٪ بوبيفاكائين من SC قبل الشق الجراحي، وتم إعطاء 0.05 ملغم/كغ من SC buprenorphine قبل التعافي من التخدير، و2 ملغم/كغ IP meloxicam تم إعطاؤه قبل التعافي من التخدير ومرة أخرى في صباح اليوم التالي.

2. حصاد الكتلة والتجميد والتحليل

  1. في نقاط زمنية محددة مسبقا ، قم بالتضحية بالفئران عن طريق إحداث جرعة زائدة من عامل كيميائي (على سبيل المثال ، ثاني أكسيد الكربون2 أو مخدر) في غرفة تحريض التخدير.
  2. تأكد من تضحية القوارض عن طريق إجراء بضع الصدر الثنائي باستخدام شق مشرط واحد من خلالالضلع 4 البطني لثقب الرئتين (بضع الصدر الثنائي).
  3. أعد فتح الشق الجراحي للسماح برؤية المضغ ، وإزالة الجلد المغطى بالمضغ لسهولة الوصول إليه.
  4. قم بتشريح وإزالة المضغ من الفك السفلي ، بدءا من الفصل عند زاوية الفك السفلي. تأكد من حدوث التشريح على طول سطح العظم لالتقاط سمك المضغ بالكامل.
    1. تشريح الأمام على طول الفك السفلي ، وقطع نقطة التعلق بالوتر. ثم قم بتشريح القوس الوجني للخلف (الشكل 1 د). أخيرا ، قم بتشريح المرفق الخلفي حيث يوجد خطر متزايد للنزيف.
  5. اشطف المضغ المقطوع في 1x PBS في درجة حرارة الغرفة (RT) وقم بإزالة الرطوبة الزائدة عن طريق مسح العينة جيدا بمنشفة ورقية.
  6. ضع العضلة في تبريد واغمرها في وسط تضمين درجة حرارة القطع المثلى (OCT) ، بحيث يكون الطرف الأمامي متجها لأسفل والطرف الخلفي متجها لأعلى.
  7. أضف الأيزوبنتان إلى كوب معدني وقم بتبريده عن طريق غمره في النيتروجين السائل مع العناية لمنع دخول النيتروجين السائل إليه.
    1. بمجرد أن يصل الأيزوبنتان إلى درجة الحرارة المثلى (-140 إلى -149 درجة مئوية) ويصبح سميكا قليلا ، أمسك المبرد الذي يحتوي على OCT والمضغ مغمورا جزئيا في الأيزوبنتان حتى يتجمد OCT. احتفظ بالتبريد المجمد على الثلج الجاف حتى يتم نقله إلى الفريزر عند -80 درجة مئوية.
  8. عينات القطع بالتبريد المجمدة مع الاتجاه بحيث يتم تقسيم القطب الأمامي أولا ، ويتحرك للخلف عبر العينة. اضبط درجة حرارة كتلة الأنسجة على -20 درجة مئوية ودرجة حرارة شفرة القطع بالتبريد على -15 درجة مئوية. لكل 200 ميكرومتر ، قم بقص 4 شرائح (2 مع أقسام 10 ميكرومتر ، 2 مع أقسام 6 ميكرومتر) قبل تحريك 200 ميكرومتر أكثر ، وقطع 4 شرائح إضافية وتكرارها في جميع أنحاء العينة.
  9. استخدم أقسام 10 ميكرومتر لتحليل الأنسجة (ماسون ثلاثي الألوان ، الهيماتوكسيلين والإيوسين ، بيكروزيوس الأحمر ، إلخ) وأقسام 6 ميكرومتر للكيمياء المناعية.
    ملاحظة: بالنسبة لعلم الأنسجة ، يمكن أيضا استخدام أقسام 6 ميكرومتر.
  10. التقط الصور باستخدام الفحص المجهري الضوئي أو الفلوري.
  11. قم بقياس مناطق المقطع العرضي ل ~ 200 ألياف عضلية لعضلة المضغ باستخدام برنامج Image J.

3. التحليل الكيميائي المناعي

  1. للتحليل الكيميائي المناعي لسلسلة الميوسين الجنينية الثقيلة ، قم بإصلاح الشرائح في 4٪ PFA لمدة 1 ساعة في RT.
  2. اغسل الشرائح في PBS 3 مرات في RT ، مما يسمح لكل غسلة بالجلوس لمدة 10 دقائق.
  3. تخلل الأنسجة عن طريق احتضان الشرائح بنسبة 0.5٪ Triton X-100 في RT لمدة 15 دقيقة.
  4. اغسل الشرائح في PBS 3 مرات في RT ، مما يسمح لكل غسلة بالجلوس لمدة 10 دقائق.
  5. احتضان الجسم المضاد أحادي النسيلة الأولي من الفئران المضيفة (1: 200) في مصل الماعز الطبيعي 2٪ (NGS) عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  6. اغسل الشرائح في PBS-Tween 3 مرات في RT ، مما يسمح لكل غسلة بالجلوس لمدة 10 دقائق.
  7. احتضان بجسم مضاد ثانوي مضاد للفئران المسمى بالفلوروفور من مضيف الأرانب (1: 500) في 2٪ NGS في RT لمدة ساعتين.
  8. اغسل الشرائح في PBS-Tween 3 مرات في RT ، مما يسمح لكل غسلة بالجلوس لمدة 10 دقائق.
  9. قم بتركيب الشرائح باستخدام 3 قطرات من حامل الفلورسنت DAPI قبل وضع الغطاء.

النتائج

تشمل نتائج تقييم VML القحفية الوجهية وتجديد الأنسجة باستخدام المواد الحيوية كلا من النتائج الكمية والنوعية.

يصور الشكل 2 مثالا على التقييم النوعي باستخدام النموذج الموصوف سابقا. تعد ملاحظة نمو ألياف العضلات الجديدة داخل الهيدروجيل لد...

Discussion

هناك العديد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول حيث يلزم إيلاء اهتمام خاص لتحقيق النتيجة المثلى. تصف الخطوة 1.4 الشق الأولي والفصل الحاد للجلد عن لفافة المضغ السطحية. يجب إجراء التشريح الحاد مباشرة على طول الجلد مع مقص مشيرا بعيدا عن العضلات واللفافة الأساسية لمنع الوخز وإن...

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

يتم دعم هذا البحث من قبل برنامج الزمالة البحثية لمدة عام في جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو وبرنامج مشروع C-Doctor متعدد التخصصات الانتقالي. شكرا لأعضاء مختبر بوميرانتز وبرنامج بيولوجيا القحف الوجهي في جامعة كاليفورنيا سان فرانسيسكو على مساهماتهم.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
F1.652 Myosin heavy chain (embryonic) monoclonal antibodyDSHBF1.652
Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21242
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11034
Integra Standard Biopsy Punches, Disposable Standard biopsy punch; 5 mm, Diameter: 0.19 in., 0.5 cmIntegra12460411
Mounting Medium with DAPI - Aqueous, FluoroshieldAbcamab104139
Rabbit Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) preadsorbedAbcamab150127
Sulfamethoxazole/Trimethoprim Oral Suspension, Cherry Flavored, 473 mLMed-Vet InternationalSKU: RXBAC-SUSP

References

  1. Gilbert-Honick, J., Grayson, W. Vascularized and innervated skeletal muscle tissue engineering. Adv Healthc Mater. 9 (1), 1900626 (2020).
  2. Aguilar, C. A., et al. Multiscale analysis of a regenerative therapy for treatment of volumetric muscle loss injury. Cell Death Discov. 4, 33 (2018).
  3. Corona, B. T., Wenke, J. C., Ward, C. L. Pathophysiology of volumetric muscle loss injury. Cells Tissues Organs. 202 (3-4), 180-188 (2016).
  4. Kiran, S., Dwivedi, P., Kumar, V., Price, R., Singh, U. Immunomodulation and biomaterials: Key players to repair volumetric muscle loss. Cells. 10 (8), 2016 (2021).
  5. Greising, S. M., Corona, B. T., McGann, C., Frankum, J. K., Warren, G. L. Therapeutic approaches for volumetric muscle loss injury: A systematic review and meta-analysis. Tissue Eng Part B: Rev. 25 (6), 510-525 (2019).
  6. Bosse, M. J., et al. An analysis of outcomes of reconstruction or amputation after leg-threatening injuries. N Engl J Med. 347 (24), 1924-1931 (2002).
  7. Testa, S., et al. The War after war: Volumetric muscle loss incidence, implication, current therapies and emerging reconstructive strategies, a comprehensive review. Biomedicines. 9 (5), 564 (2021).
  8. Emara, A., Shah, R. Recent update on craniofacial tissue engineering. J Tissue Eng. 12, 204173142110037 (2021).
  9. Dado, D. V., Kernahan, D. A. Anatomy of the orbicularis oris muscle in incomplete unilateral cleft lip based on histological examination. Ann Plast Surg. 15 (2), 90-98 (1985).
  10. Stål, P., Eriksson, P. O., Eriksson, A., Thornell, L. E. Enzyme-histochemical and morphological characteristics of muscle fibre types in the human buccinator and orbicularis oris. Arch Oral Biol. 35 (6), 449-458 (1990).
  11. Raposio, E., Bado, M., Verrina, G., Santi, P. Mitochondrial activity of orbicularis oris muscle in unilateral cleft lip patients. Plast Reconstr Surg. 102 (4), 968-971 (1998).
  12. Cheng, X., Shi, B., Li, J. Distinct embryonic origin and injury response of resident stem cells in craniofacial muscles. Front Physiol. 12, 690248 (2021).
  13. Carvajal Monroy, P. L., et al. A rat model for muscle regeneration in the soft palate. PLoS One. 8 (3), e59193 (2013).
  14. Ono, Y., Boldrin, L., Knopp, P., Morgan, J. E., Zammit, P. S. Muscle satellite cells are a functionally heterogeneous population in both somite-derived and branchiomeric muscles. Dev Biol. 337 (1), 29-41 (2010).
  15. Pavlath, G. K., Thaloor, D., Rando, T. A., Cheong, M., English, A. W., Zheng, B. Heterogeneity among muscle precursor cells in adult skeletal muscles with differing regenerative capacities. Dev Dyn. 212 (4), 495-508 (1998).
  16. Rodriguez, B. L., Vega-Soto, E. E., Kennedy, C. S., Nguyen, M. H., Cederna, P. S., Larkin, L. M. A tissue engineering approach for repairing craniofacial volumetric muscle loss in a sheep following a 2, 4, and 6-month recovery. PLoS One. 15 (9), e0239152 (2020).
  17. Kim, H., et al. Real-time functional assay of volumetric muscle loss injured mouse masseter muscles via nanomembrane electronics. Adv Sci. 8 (17), e2101037 (2021).
  18. Schiaffino, S., Rossi, A. C., Smerdu, V., Leinwand, L. A., Reggiani, C. Developmental myosins: expression patterns and functional significance. Skelet Muscle. 5, 22 (2015).
  19. Agarwal, M., et al. Myosin heavy chain-embryonic regulates skeletal muscle differentiation during mammalian development. Development. 147 (7), (2020).
  20. Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), e51586 (2014).
  21. Kim, J. H., et al. Neural cell integration into 3D bioprinted skeletal muscle constructs accelerates restoration of muscle function. Nat Commun. 11 (1), 1025 (2020).
  22. Anderson, S. E., et al. Determination of a critical size threshold for volumetric muscle loss in the mouse quadriceps. Tissue Eng Part C Methods. 25 (2), 59-70 (2019).
  23. Kim, J. T., Kasukonis, B. M., Brown, L. A., Washington, T. A., Wolchok, J. C. Recovery from volumetric muscle loss injury: A comparison between young and aged rats. Exp Gerontol. 83, 37-46 (2016).
  24. Guédat, C., Stergiopulos, O., Kiliaridis, S., Antonarakis, G. S. Association of masseter muscles thickness and facial morphology with facial expressions in children. Clin Exp Dent Res. 7 (5), 877-883 (2021).
  25. VanSwearingen, J. M., Cohn, J. F., Bajaj-Luthra, A. Specific impairment of smiling increases the severity of depressive symptoms in patients with facial neuromuscular disorders. Aesthetic Plast Surg. 23 (6), 416-423 (1999).
  26. Versnel, S. L., Duivenvoorden, H. J., Passchier, J., Mathijssen, I. M. J. Satisfaction with facial appearance and its determinants in adults with severe congenital facial disfigurement: A case-referent study. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 63 (10), 1642-1649 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved