מודל מכרסם של אובדן שרירים נפחי Masseter לחקר חומרים ביו-הנדסיים

Summary

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול ליצירה כירורגית של פגיעה באיבוד שריר נפחי (VML) במעסה החולדות, ומספקים מודל נגיש ושניתן לשחזור לחקר פציעות שריר גולגולתי והטיפול בהן באמצעות ביו-חומרים כגון ההידרוג'ל החדש.

Abstract

פציעות אובדן שרירים נפחי קרניופציאלי (VML) יכולות להתרחש כתוצאה מטראומה חמורה, כריתה כירורגית, דלקת ומצבים מולדים או נרכשים אחרים. הטיפול ב-VML גולגולתי כרוך בהעברת שרירים כירורגית ותפקודית. עם זאת, הליכים אלה אינם מסוגלים להחזיר תפקוד תקין, תחושה או ביטוי, ובדרך כלל, תנאים אלה אינם מטופלים. מעט מאוד מחקר נערך על התחדשות שרירי השלד במודלים של בעלי חיים של VML גולגולתי. כתב יד זה מתאר מודל חולדה לחקר פגיעות VML גולגולתיות ופרוטוקול להערכה היסטולוגית של ביו-חומרים בטיפול בפציעות אלה. הידרוג'ל נוזלי ופיגומים מיובשים בהקפאה מוחלים בזמן יצירת VML כירורגי, ומסים נכרתים בנקודות זמן סופניות עד 12 שבועות עם שיעורי שימור גבוהים וסיבוכים זניחים. Hematoxylin ו eosin (HE), Trichrome של Masson, וניתוח immunohistochemical משמשים להערכת פרמטרים של התחדשות שרירי השלד, כמו גם תאימות ביולוגית ואימונומודולציה. בעוד אנו מדגימים את המחקר של הידרוג'ל מבוסס חומצה היאלורונית, מודל זה מספק אמצעי להערכת איטרציות עוקבות של חומרים בפציעות VML.

Introduction

טראומה חמורה, כריתה כירורגית, דלקת ומצבים נרכשים אחרים עלולים לגרום לאובדן רקמות שמכריע את מנגנוני תיקון שרירי השלד האנדוגניים. אובדן של תאים ומבנים המקדמים את תהליך ההתחדשות הראשוני עלול לגרום לעיצוב מחדש פתולוגי ופיברוזיס רקמות, וכתוצאה מכך לליקויים ארוכי טווח של תפקוד ותחושה ומכונים אובדן שרירים נפחי (VML)^1,2,3. התגובה הדלקתית לפציעות VML כוללת מנגנון מתועד היטב ומורכב המערב מקרופאגים, ציטוקינים ותאים מיוגניים, המציג מטרות תיאורטיות רבות ברפואה רגנרטיבית⁴. בעוד שמחקרים רבים במבחנה השתמשו במטרות אלה במודלים של בעלי חיים לטיפול VML בגפיים, קיים מחסור במחקר על התחדשות שרירי השלד במודלים של בעלי חיים של VML^{גולגולתי 5,6,7}.

אובדן רקמה קרניופציאלית יכול לנבוע ממצבים כפי שתואר קודם לכן, ורקמת גולגולת חסרה יכולה להתרחש גם במצבים מולדים כגון שסע, אשר במקרים מסוימים כרוך בחסר נפחי אמיתי של רקמת שריר ^8,9. מכיוון שהשרירים באזור הגולגולת חשובים לתפקוד כמו גם למראה אסתטי, השפעות ארוכות טווח של VML עשויות להיות בעלות סבל פסיכולוגי משמעותי. מספר היבטים של שרירי השלד הגולגולתיים שונים משרירי השלד שמקורם בסומיט הנמצאים בגפיים, כולל שינויים בביטוי גנים, מוצא עוברי, פנוטיפ תאי לוויין, כמות תאי לוויין, הרכב סיבים וארכיטקטורה 10,11,12,13. שינויים אלה עלולים לגרום לפציעות VML המשפיעות על שריר הגולגולת באופן שונה מאשר שריר^14,15 שמקורו בסומיט. עד כה, גישות של הנדסת רקמות שהוכחו כמגבירות התחדשות במודלים של בעלי חיים של VML בגפיים לא תורגמו באופן שווה למודלים של VML קרניופציאלי^{בבעלי חיים 16}. זה מדגיש את הצורך למטב גישות in vivo למודלים של VML קרניופציאלי של בעלי חיים.

בעוד שמספר מחקרי in vivo של VML גולגולתי נערכו, המחקרים קטנים ויצירת פגם חזק בשריר הגולגולת במודלים של בעלי חיים מאתגרת ^8,13. קים ואחרים דיווחו על פיתוח מודל VML למעסה עכבר. עם זאת, מחקר זה העריך את ההיסטולוגיה רק עד 28 ימים לאחר הפציעה והיה לו כוח לא ברור לזהות הבדלים בתוצאות היסטולוגיות בין נקודות זמן¹⁷. רודריגז ועמיתיו דיווחו על פיתוח מודל VML גולגולתי לכבשים. עם זאת, הם דיווחו על שונות גבוהה בתוך קבוצות הניסוי, מה שמרמז על הטרוגניות בחומרת הפגיעה הכירורגית הראשונית¹⁶. כאן, אנו מדווחים על הפרוטוקול של מודל VML שלנו למסה חולדות ומדגימים את התועלת שלו בהערכת גישות של הנדסת רקמות.

Protocol

מחקר זה נערך בהתאם לכל התקנות הרלוונטיות, לרבות עמידה בהמלצות המפורטות במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. התוכנית המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של UCSF אישרה את כל ההליכים והטיפול בבעלי חיים לאחר הניתוח (פרוטוקול IACUC #AN195944-01).

1. ניתוח VML

1. יש להרדים חולדות ספראג-דולי זכרים בגיל 12 שבועות במשקל 276-300 גרם במיכל אטום באמצעות הרדמה כללית איזופלואורנית בשיעור של 1%-5% לפני העברתם לשדה כירורגי סטרילי.
   1. מקמו את המכרסמים בצדם השמאלי כך שהצוואר מורחב בתנוחה ניטרלית והאף מותאם לקונוס ההרדמה, מה שמאפשר חשיפה לצד ימין של הפנים.
   2. קצב זרימה איזופלואורני מתחדד מהאינדוקציה ועד לקצב זרימת התחזוקה (כ-2%).
2. החל משחה אופתלמית על העיניים של מכרסמים.
3. נקה את אתר הניתוח, הגובל בקו בין הפינה הימנית של הפה, בסיס אוזן ימין עליון, וזווית הלסת התחתונה, של פרווה באמצעות קרם depilatory.
   1. יש לחטא את אתר הניתוח מספר פעמים בתנועה מעגלית באמצעות אתנול וקרצוף בטאדין.
      הערה: נשפך סטרילי אינו משמש בפרוטוקול זה, בהתחשב בגודל ובמיקום הגישה. ההליך מתבצע בטכניקה אספטית בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי חיים.
4. יוצרים חתך אורכי באורך 3-4 ס"מ המשתרע מכרית השפם הימנית התחתונה ועד לאוזן ימין.
   1. הרימו דש עור, מה שמאפשר הדמיה של המעסה הימני, כמו גם של הענפים הבוקליים והמנדיבולריים של עצב הפנים (איור 1A).
   2. נקו את העור מהפאשיה שמתחתיה באמצעות הפרדה קהה והחזיקו את קצוות העור בתנוחה נסוגה באמצעות מלחציים כירורגיים להדמיה אופטימלית של השריר שמתחתיו.
5. בצע חתך רוחבי באורך 1-2 ס"מ בפאשיה שמעל החלק הקדמי של המעסה. השתמשו בהפרדה קהה כדי להרחיב את המרווח בין הפאשיה למעסה תוך הקפדה על השלמות הכללית של הפאשיה הנותרת.
6. שימוש בחתך הפשיאלי כחלון למסה השטחית, יוצרים פגיעה מעגלית בשריר בגודל 5 מ"מ לרוחב ועומק 5 מ"מ באמצעות ביופסיית אגרוף חד פעמית מעוקרת. ודאו שהפגם ממורכז בין הענפים הבוקליים והמנדיבולריים של עצב הפנים, תוך הקפדה על מניעת טראומה לעצבים (איור 1B).
7. הוסיפו את החומר הביולוגי לפציעת המסה המעגלית (איור 1C).
8. ברגע שהסוכן נמצא במקומו כראוי, תפרו את החלון הפאשיאלי השקיע שרירים באמצעות תפר מונופילמנט יחיד של 5-0 כדי למנוע נדידה.
   הערה: חומרים מוצקים ממוקמים ישירות בפצע, והרקמה יכולה להיות מופרעת כדי לקדם רוויה עם דם, בעוד חומרים נוזליים מתווספים ומותר gelate במידת הצורך או סגור מיד במקום באמצעות fascia כדי למנוע תנועה לא רצויה. בניסוי שהודגם כאן, ניתן קריוגל מבוסס חומצה היאלורונית אקריליאטית.
9. סגור את העור באמצעות טכניקה תת עורית פשוטה קטועה או ריצה עם מונופילמנט 5-0.
   1. יש למרוח דבק עור על התפרים כדי לסייע במניעת חתך לאחר הניתוח.
10. אפשרו לחולדות להתאושש בכלוב עם מקור חימום חיצוני (כרית חימום מתחת לכלוב או מחממי ידיים סטריליים בכלוב) והתבוננו במשך 30 דקות לאחר הניתוח.
11. לדלל אנטיביוטיקה trimethoprim-sulfamethoxazole (200 מ"ג של trimethoprim ו 40 מ"ג של sulfamethoxazole ב 5 מ"ל) במי שתייה (5 מ"ל / 200 מ"ל מים) ולתת אותו מכרסמים מי שתייה במשך 7 ימים לאחר הניתוח. ודא ששיכוך כאבים פריאופרטיבי מתבצע על פי פרוטוקולים מוסדיים.
    הערה: במחקר זה, 0.25% SC bupivacaine ניתן לפני חתך ניתוחי, 0.05 מ"ג / ק"ג SC buprenorphine ניתן לפני התאוששות מהרדמה, ו 2 מ"ג / ק"ג IP meloxicam ניתן לפני התאוששות מהרדמה ושוב למחרת בבוקר.

2. קציר, הקפאה וניתוח של Masseter

1. בנקודות זמן קבועות מראש, הקריבו את החולדות על ידי גרימת מנת יתר של חומר כימי (למשל,_CO2 או חומר הרדמה) בתא השראת ההרדמה.
2. לאשר הקרבת מכרסמים על ידי ביצוע בית החזה דו צדדי באמצעות חתך אזמל יחיד^{דרך צלע} 4 גחון כדי לנקב את הריאות (דו צדדי thoracotomy).
3. פתח מחדש את החתך הניתוחי כדי לאפשר הדמיה של המעסה, והסר את העור שמעל המעסה כדי להקל על הגישה.
4. לנתח ולהסיר את המעסה מן הלסת התחתונה, החל הפרדה בזווית mandibular. ודא שהדיסקציה מתרחשת לאורך פני העצם כדי ללכוד את כל עובי המסה.
   1. חותכים קדמית לאורך הלסת התחתונה, ומנתקים את נקודת החיבור של הגיד. לאחר מכן, נתחו לאורך הקשת הזיגומטית מאחור (איור 1D). לבסוף, לנתח את החיבור האחורי כמו קיים סיכון מוגבר לדימום.
5. שטפו את המעסה שנכרת ב-1x PBS בטמפרטורת החדר (RT) והסירו לחות מוגזמת על ידי ניקוי יסודי של הדגימה במגבת נייר.
6. הניחו את השריר בקריומולד והטביעו אותו בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) במדיית הטבעה, כאשר הקצה הקדמי פונה כלפי מטה והקצה האחורי פונה כלפי מעלה.
7. הוסיפו איזופנטאן לכוס מתכת וקררו אותה על ידי טבילתה בחנקן נוזלי בזהירות כדי למנוע חנקן נוזלי להיכנס אליה.
   1. לאחר שהאיזופנטאן הגיע לטמפרטורה אופטימלית (-140 עד -149 מעלות צלזיוס) והתעבה מעט, החזיקו את הקריומולד המכיל OCT ואת המסה שקועים חלקית באיזופנטאן עד שה-OCT קפא. שומרים את הקריומולד הקפוא על קרח יבש עד להעברתו למקפיא בטמפרטורה של -80°C.
8. קריוסקציה הקפיאה דגימות מסה עם הכיוון כך שהקוטב הקדמי נחתך ראשון, נע אחורית דרך הדגימה. הגדר את טמפרטורת בלוק הרקמה ל -20 ° C ואת טמפרטורת להב ההקפאה ל -15 ° C. עבור כל 200 מיקרומטר, חתכו 4 שקופיות (2 עם מקטעים של 10 מיקרומטר, 2 עם מקטעים של 6 מיקרומטר) לפני שתזיזו 200 מיקרומטר הלאה, חתכו 4 שקופיות נוספות וחזרו על עצמן לאורך הדגימה.
9. השתמש בחתכי 10 מיקרומטר לניתוח היסטולוגיה (טריכרום של מאסון, המטוקסילין ואוסין, אדום פיקרוסיריוס וכו ') ובחתכי 6 מיקרומטר לאימונוהיסטוכימיה.
   הערה: עבור היסטולוגיה, ניתן להשתמש גם במקטעים של 6 מיקרומטר.
10. צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ אור או פלואורסצנטי.
11. מדוד את אזורי החתך של ~200 סיבי שריר של שריר המסה באמצעות תוכנת Image J.

3. ניתוח אימונוהיסטוכימי

1. לניתוח אימונוהיסטוכימי של שרשרת כבדה של מיוזין עוברי, תקן שקופיות ב- 4% PFA למשך שעה אחת ב- RT.
2. שטפו את המגלשות ב-PBS 3 פעמים ב-RT, ואפשרו לכל שטיפה לשבת במשך 10 דקות.
3. חדרו רקמות על ידי דגירה של המגלשות עם 0.5% Triton X-100 ב-RT למשך 15 דקות.
4. שטפו את המגלשות ב-PBS 3 פעמים ב-RT, ואפשרו לכל שטיפה לשבת במשך 10 דקות.
5. יש לדגור עם נוגדן חד-שבטי ראשוני מעכברים מארחים (1:200) בסרום עיזים תקין (NGS) ב-4°C למשך הלילה.
6. שטפו את המגלשות ב-PBS-Tween 3 פעמים ב-RT, ואפשרו לכל שטיפה לשבת במשך 10 דקות.
7. דגרו עם נוגדן משני נגד עכבר עם תווית פלואורופור מפונדקאי ארנב (1:500) ב-2% NGS ב-RT במשך שעתיים.
8. שטפו את המגלשות ב-PBS-Tween 3 פעמים ב-RT, ואפשרו לכל שטיפה לשבת במשך 10 דקות.
9. הרכיבו את המגלשות באמצעות 3 טיפות של תושבת פלואורסצנטית DAPI לפני הנחת הכיסוי.

תוצאות

התוצאות להערכת VML גולגולתי והתחדשות רקמות באמצעות ביו-חומרים כוללות תוצאות כמותיות ואיכותיות כאחד.

איור 2 מציג דוגמה להערכה איכותנית באמצעות המודל שתואר קודם לכן. התצפית על גדילת סיבי שריר דה נובו בתוך ההידרוג'ל שלנו היא תוצאה חיובית ...

Discussion

ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול שבהם נדרשת תשומת לב מיוחדת כדי להשיג תוצאה אופטימלית. שלב 1.4 מתאר את החתך הראשוני וההפרדה הקהה של העור מהפאשיה השטחית. דיסקציה קהה צריכה להיעשות ישירות לאורך העור עם מספריים המצביעים הרחק מהשריר התחתון והפאשיה כדי למנוע ניקוב ויצירת חל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
F1.652 Myosin heavy chain (embryonic) monoclonal antibody	DSHB	F1.652
Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21242
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
Integra Standard Biopsy Punches, Disposable Standard biopsy punch; 5 mm, Diameter: 0.19 in., 0.5 cm	Integra	12460411
Mounting Medium with DAPI - Aqueous, Fluoroshield	Abcam	ab104139
Rabbit Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) preadsorbed	Abcam	ab150127
Sulfamethoxazole/Trimethoprim Oral Suspension, Cherry Flavored, 473 mL	Med-Vet International	SKU: RXBAC-SUSP