用于研究生物工程材料的咬肌体积损失的啮齿动物模型

摘要

在这里，我们描述了一种在大鼠咬肌中手术创建体积肌肉损失 （VML） 损伤的方案，为研究颅面肌损伤及其使用新型水凝胶等生物材料的治疗提供了一种可重复且可访问的模型。

摘要

颅面体积肌损失 （VML） 损伤可能是由于严重创伤、手术切除、炎症以及先天性或其他获得性疾病而发生的。颅面 VML 的治疗涉及手术功能性肌肉转移。然而，这些手术无法恢复正常的功能、感觉或表达，更常见的是，这些情况得不到治疗。对颅面 VML 动物模型中骨骼肌再生的研究很少。本手稿描述了用于研究颅面 VML 损伤的大鼠模型以及用于治疗这些损伤的生物材料组织学评估方案。在手术创建 VML 时应用液体水凝胶和冻干支架，并在长达 12 周的终末时间点切除咬肌，保留率高，并发症可忽略不计。苏木精和伊红 （HE）、Masson 三色和免疫组织化学分析用于评估骨骼肌再生的参数以及生物相容性和免疫调节。虽然我们展示了基于透明质酸的水凝胶的研究，但该模型提供了一种评估 VML 损伤中材料后续迭代的方法。

引言

严重的创伤、手术切除、炎症和其他获得性疾病会导致一定程度的组织损失，从而压倒内源性骨骼肌修复机制。促进初级再生过程的驻留细胞和结构的缺失会导致病理重塑和组织纤维化，从而导致功能和感觉的长期缺陷，被称为体积肌肉损失 （VML）^1,2,3。对 VML 损伤的炎症反应涉及一个有据可查的复杂机制，涉及巨噬细胞、细胞因子和肌原细胞，这在再生医学中提出了许多理论靶点⁴。虽然许多体外研究已在肢体 VML 治疗的动物模型中利用了这些靶点，但缺乏对颅面 VML 动物模型中骨骼肌再生的研究 ^5,6,7。

颅面组织丢失可能是由前面描述的情况引起的，颅面组织缺陷也可能发生在先天性疾病中，例如裂隙，在某些情况下，这涉及肌肉组织的真正体积缺陷 ^8,9。由于颅面区域的肌肉对功能和美学外观很重要，因此 VML 的长期影响可能会产生严重的心理影响。颅面骨骼肌的几个方面与四肢中发现的体节衍生的骨骼肌不同，包括基因表达、胚胎起源、卫星细胞表型、卫星细胞数量、纤维组成和结构的变化 10,11,12,13。这些变化可能导致 VML 损伤对颅面肌的影响与体节来源的肌肉不同^14,15。迄今为止，在肢体 VML 动物模型中显示可增加再生的组织工程方法尚未等同于颅面 VML 动物模型¹⁶。这强调了优化动物颅面 VML 模型的体内方法的必要性。

虽然已经进行了几项颅面 VML 的体内研究，但研究规模较小，并且在动物模型中创建强大的颅面肌缺陷具有挑战性 ^8,13。Kim 等人报道了小鼠咬肌 VML 模型的开发。然而，这项研究仅在损伤后 28 天之前评估了组织学，并且检测时间点之间组织学结果差异的能力尚不清楚¹⁷。Rodriguez 等人报道了绵羊颅面 VML 模型的开发。然而，他们报告了实验组内的高度变异性，表明初始手术损伤的严重程度存在异质性¹⁶。在这里，我们报告了大鼠咬肌 VML 模型的方案，并展示了它在评估组织工程方法中的实用性。

研究方案

这项研究是根据所有适用法规进行的，包括遵守《实验动物护理和使用指南》中概述的建议。UCSF 机构动物护理和使用计划批准了所有动物程序和术后护理（IACUC 协议 #AN195944-01）。

1. VML 手术

1. 在转移到无菌手术区域之前，使用异氟烷全身麻醉，在 12 周龄时，使用异氟烷全身麻醉在密封容器中麻醉体重 276-300 g的雄性 Sprague-Dawley 大鼠。
   1. 将啮齿动物放在左侧，使颈部伸展到中立位置，并将鼻子放入麻醉鼻锥中，从而暴露于面部右侧。
   2. 从诱导流速到维持流速的锥化异氟烷流速（约 2%）。
2. 将眼药膏涂抹在啮齿动物的眼睛上。
3. 使用脱毛霜清除手术部位，在右嘴角、右耳根部上方和下颌骨角之间划一条线。
   1. 使用乙醇和优碘磨砂膏以圆周运动对手术部位进行数次消毒。
      注意:考虑到访问的大小和位置，本协议中不使用无菌悬垂。该程序是根据动物护理指南使用无菌技术进行的。
4. 创建一个 3-4 厘米长的纵向切口，从右下胡须垫到右耳。
   1. 抬高皮瓣，可以看到右侧咬肌以及面神经的颊支和下颌支（图1A）。
   2. 使用钝分离从下面的筋膜上清除皮肤，并使用手术夹将皮肤边缘保持在缩回位置，以实现底层肌肉的最佳可视化。
5. 在咬肌前部的筋膜上做一个 1-2 厘米长的横向切口。小心使用钝分离来扩大筋膜和咬肌之间的空间，以保持剩余筋膜的整体完整性。
6. 使用筋膜切口作为浅表咬肌的窗口，使用消毒的一次性穿刺活检在肌肉中形成一个直径为 5 毫米、深 5 毫米的圆形损伤。确保缺损位于面神经的颊支和下颌支之间，小心避免对神经造成创伤（图1B）。
7. 将生物材料添加到圆形咬肌损伤中（图 1C）。
8. 一旦药物适当就位，使用单根 5-0 单丝缝合合肌肉投资筋膜窗以避免迁移。
   注意:固体形式的试剂直接放置在伤口中，可以扰动组织以促进血液饱和，而液体试剂则添加并在必要时凝胶化或立即使用筋膜封闭以避免不必要的移动。在这里演示的实验中，施用了基于丙烯酸酯化透明质酸的冷冻凝胶。
9. 使用简单的间断或运行 5-0 单丝皮下技术闭合皮肤。
   1. 在缝合线上涂抹皮肤胶，以帮助防止术后切口裂开。
10. 让大鼠在带有外部加热源（笼子下方的加热垫或笼子中的无菌暖手器）的笼子中恢复，并在术后观察 30 分钟。
11. 在饮用水（5 mL/200 mL 水）中稀释甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲噁唑抗生素（200 mg 甲氧苄啶和 40 mg 磺胺甲噁唑在 5 mL 水中），并在啮齿动物饮用水中给药 7 天术后。确保根据机构方案进行围手术期镇痛。
    注意:在本研究中，在手术切口前给予 0.25% SC 布比卡因，在麻醉恢复前给予 0.05 mg/kg SC 丁丙诺啡，在麻醉恢复前和第二天早上再次给予 2 mg/kg IP 美洛昔康。

2. 咬肌收获、冷冻和分析

1. 在预定的时间点，通过在麻醉诱导室中诱导过量的化学试剂（例如，CO₂ 或麻醉剂）来牺牲大鼠。
2. 通过使用单手术刀切口穿过^第 4 根肋骨腹侧穿刺肺部（双侧开胸术）进行双侧开胸手术来确认啮齿动物的死亡。
3. 重新打开手术切口以允许咬肌可见，并去除咬肌上方的皮肤以方便接触。
4. 解剖并从下颌骨上去除咬肌，从下颌角分离开始。确保沿骨表面进行夹层，以捕获咬肌的整个厚度。
   1. 沿下颌骨向前解剖，切断肌腱的附着点。然后，沿颧弓向后解剖（图 1D）。最后，解剖后附件，因为出血的风险增加。
5. 在室温 （RT） 下用 1x PBS 冲洗切除的咬肌，并用纸巾彻底吸干标本以去除多余的水分。
6. 将肌肉放入低温模具中，并将其浸入最佳切割温度 （OCT） 包埋介质中，前端朝下，后端朝上。
7. 将异戊烷加入金属杯中，小心地将其浸入液氮中冷却，以防止液氮进入。
   1. 一旦异戊烷达到最佳温度（-140 至 -149 °C）并略微增稠，将含有 OCT 的低温模具和咬肌部分浸入异戊烷中，直到 OCT 冻结。将冷冻的低温模具放在干冰上，直到转移到 -80 °C 的冰箱中。
8. 冷冻切片冷冻咬肌样品，其方向使前杆首先被切片，然后向后穿过样品。将组织块温度设置为 -20 °C，将冷冻切片刀片温度设置为 -15 °C。 对于每 200 μm，切割 4 张载玻片（2 张具有 10 μm 切片，2 张具有 6 μm 切片），然后进一步移动 200 μm，再切割 4 张载玻片并在整个样品中重复。
9. 使用 10 μm 切片进行组织学分析（Masson 三色、苏木精和伊红、Picrosirius Red 等），使用 6 μm 切片进行免疫组织化学。
   注:对于组织学，也可以使用 6 μm 切片。
10. 使用光学或荧光显微镜捕获图像。
11. 使用 Image J 软件测量咬肌 ~200 根肌肉纤维的横截面积。

3. 免疫组化分析

1. 对于胚胎肌球蛋白重链的免疫组织化学分析，在 RT 下将载玻片在 4% PFA 中固定 1 小时。
2. 在 RT 下用 PBS 洗涤载玻片 3 次，每次洗涤 10 分钟。
3. 通过在 RT 下用 0.5% Triton X-100 孵育载玻片 15 分钟来透化组织。
4. 在 RT 下用 PBS 洗涤载玻片 3 次，每次洗涤 10 分钟。
5. 与来自宿主小鼠的一抗 （1:200） 在 2% 正常山羊血清 （NGS） 中于 4 °C 孵育过夜。
6. 在 RT 下用 PBS-Tween 洗涤载玻片 3 次，每次洗涤静置 10 分钟。
7. 与 2% NGS 中的兔宿主荧光团标记的抗小鼠二抗 （1:500） 在 RT 下孵育 2 小时。
8. 在 RT 下用 PBS-Tween 洗涤载玻片 3 次，每次洗涤静置 10 分钟。
9. 在放置盖玻片之前，使用 3 滴 DAPI 荧光封片封固载玻片。

结果

使用生物材料评估颅面 VML 和组织再生的结果包括定量和定性结果。

图 2 描述了使用前面描述的模型的定性评估示例。在我们的水凝胶中观察到从 头 肌纤维生长是一个定性的积极结果（图 2A），并表明生物材料可以提供足够的结构支撑和生长因子或营养物质输送。在 HE 染色上可以看到水凝胶在创?...

讨论

实验方案中有几个关键步骤需要特别注意以获得最佳结果。步骤 1.4 描述了皮肤与浅表咬肌筋膜的初始切口和钝性分离。钝性解剖应直接沿皮肤进行，剪刀指向远离底层肌肉和筋膜的位置，以防止划伤和无意中穿过筋膜形成窗口。应避免浅表咬肌的尾部，以防止意外损伤下颌下静脉或颈外动脉。步骤 1.5 和 1.6 分别描述了筋膜窗和 VML 缺损的产生。应注意确保筋膜切口是穿?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
F1.652 Myosin heavy chain (embryonic) monoclonal antibody	DSHB	F1.652
Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21242
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
Integra Standard Biopsy Punches, Disposable Standard biopsy punch; 5 mm, Diameter: 0.19 in., 0.5 cm	Integra	12460411
Mounting Medium with DAPI - Aqueous, Fluoroshield	Abcam	ab104139
Rabbit Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) preadsorbed	Abcam	ab150127
Sulfamethoxazole/Trimethoprim Oral Suspension, Cherry Flavored, 473 mL	Med-Vet International	SKU: RXBAC-SUSP