Modèle de rongeur de perte musculaire volumétrique masséter pour l’étude des matériaux de bio-ingénierie

Résumé

Ici, nous décrivons un protocole pour la création chirurgicale d’une lésion de perte musculaire volumétrique (VML) dans le masséter de rat, fournissant un modèle reproductible et accessible pour l’étude des lésions des muscles craniofaciaux et leur traitement à l’aide de biomatériaux tels que le nouvel hydrogel.

Résumé

Les lésions de perte musculaire volumétrique craniofaciale (VML) peuvent survenir à la suite d’un traumatisme grave, d’une excision chirurgicale, d’une inflammation et d’une affection congénitale ou d’autres affections acquises. Le traitement de la VML craniofaciale implique un transfert musculaire chirurgical et fonctionnel. Cependant, ces procédures ne permettent pas de rétablir une fonction, une sensation ou une expression normales et, le plus souvent, ces affections ne sont pas traitées. Très peu de recherches ont été menées sur la régénération des muscles squelettiques dans des modèles animaux de VML craniofaciaux. Ce manuscrit décrit un modèle de rat pour l’étude des lésions craniofaciales VML et un protocole pour l’évaluation histologique des biomatériaux dans le traitement de ces blessures. De l’hydrogel liquide et des échafaudages lyophilisés sont appliqués au moment de la création chirurgicale de la VML, et les masséters sont excisés à des moments terminaux jusqu’à 12 semaines avec des taux de rétention élevés et des complications négligeables. L’hématoxyline et l’éosine (HE), le trichrome de Masson et l’analyse immunohistochimique sont utilisés pour évaluer les paramètres de la régénération des muscles squelettiques ainsi que la biocompatibilité et l’immunomodulation. Bien que nous démontrions l’étude d’un hydrogel à base d’acide hyaluronique, ce modèle fournit un moyen d’évaluer les itérations ultérieures des matériaux dans les lésions VML.

Introduction

Un traumatisme grave, une excision chirurgicale, une inflammation et d’autres affections acquises peuvent entraîner un degré de perte de tissu qui submerge les mécanismes endogènes de réparation des muscles squelettiques. La perte de cellules et de structures résidentes qui favorisent le processus de régénération primaire peut entraîner un remodelage pathologique et une fibrose tissulaire, entraînant des déficits à long terme de la fonction et de la sensation, et est appelée perte musculaire volumétrique (VML)^1,2,3. La réponse inflammatoire aux lésions VML implique un mécanisme complexe et bien documenté impliquant des macrophages, des cytokines et des cellules myogéniques qui présente de nombreuses cibles théoriques en médecine régénérative⁴. Bien que de nombreuses études in vitro aient utilisé ces cibles dans des modèles animaux de traitement de la VML des extrémités, il y a un manque de recherche sur la régénération des muscles squelettiques dans les modèles animaux de VML crâniofaciale ^5,6,7.

La perte de tissu craniofacial peut résulter d’affections telles que décrites précédemment, et un tissu craniofacial déficient peut également survenir dans des conditions congénitales telles que la fente, qui dans certains cas implique une véritable déficience volumétrique du tissu musculaire ^8,9. Parce que les muscles de la région craniofaciale sont importants pour la fonction ainsi que pour l’apparence esthétique, les effets à long terme de la VML peuvent avoir une affliction psychologique importante. Plusieurs aspects du muscle squelettique craniofacial sont différents du muscle squelettique dérivé du somite que l’on trouve dans les extrémités, notamment les variations de l’expression des gènes, de l’origine embryonnaire, du phénotype des cellules satellites, de la quantité de cellules satellites, de la composition des fibres et de l’architecture 10,11,12,13. Ces variations peuvent entraîner des lésions VML affectant le muscle craniofacial différemment du muscle dérivé du somite^14,15. À ce jour, les approches d’ingénierie tissulaire qui ont montré une augmentation de la régénération dans les modèles animaux de VML des extrémités ne se sont pas traduites de manière équivalente aux modèles animaux de VML craniofaciale¹⁶. Cela souligne la nécessité d’optimiser les approches in vivo des modèles VML craniofaciaux animaux.

Bien que plusieurs études in vivo de VML craniofaciale aient été menées, les études sont de petite taille et la création d’un défaut musculaire craniofacial robuste dans les modèles animaux est un défi ^8,13. Kim et al. ont rapporté le développement d’un modèle VML de masséter de souris. Cependant, cette étude n’a évalué l’histologie que jusqu’à 28 jours après la blessure et n’avait pas la capacité de détecter les différences dans les résultats histologiques entre les points^{temporels 17}. Rodriguez et al. ont rapporté le développement d’un modèle de VML craniofaciale de mouton. Cependant, ils ont signalé une grande variabilité au sein des groupes expérimentaux, suggérant une hétérogénéité dans la gravité de la blessure chirurgicale initiale¹⁶. Ici, nous rapportons le protocole de notre modèle VML de masséter chez le rat et démontrons son utilité dans l’évaluation des approches d’ingénierie tissulaire.

Protocole

Cette étude a été menée conformément à tous les règlements applicables, y compris le respect des recommandations énoncées dans le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Le programme institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’UCSF a approuvé toutes les procédures animales et les soins postopératoires (protocole IACUC #AN195944-01).

1. Chirurgie VML

1. Anesthésier des rats Sprague-Dawley mâles pesant de 276 à 300 g à l’âge de 12 semaines dans un contenant scellé à l’aide d’une anesthésie générale à l’isofluorane à un taux de 1 % à 5 % avant d’être transférés dans un champ chirurgical stérile.
   1. Positionnez les rongeurs sur leur côté gauche de manière à ce que le cou soit étendu dans une position neutre et que le nez soit inséré dans le cône de nez anesthésique, permettant ainsi une exposition du côté droit du visage.
   2. Réduire le débit d’isofluorane de l’induction au débit de maintenance (environ 2 %).
2. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux des rongeurs.
3. Dégagez le site opératoire, bordé d’une ligne entre le coin droit de la bouche, la base de l’oreille droite en haut et l’angle de la mandibule en bas, de la fourrure à l’aide d’une crème dépilatoire.
   1. Désinfectez le site opératoire plusieurs fois dans un mouvement circulaire à l’aide d’un gommage à l’éthanol et à la bétadine.
      REMARQUE : Le drapage stérile n’est pas utilisé dans ce protocole, compte tenu de la taille et de l’emplacement de l’accès. La procédure est menée à l’aide d’une technique aseptique conformément aux directives de soins aux animaux.
4. Créez une incision longitudinale de 3 à 4 cm de longueur allant de la moustache inférieure droite à l’oreille droite.
   1. Élever un lambeau cutané, permettant de visualiser le masséter droit ainsi que les branches buccale et mandibulaire du nerf facial (Figure 1A).
   2. Nettoyez la peau du fascia sous-jacent à l’aide d’une séparation émoussée et maintenez les bords de la peau en position rétractée à l’aide de pinces chirurgicales pour une visualisation optimale du muscle sous-jacent.
5. Faites une incision transversale de 1 à 2 cm de long dans le fascia recouvrant la partie antérieure du masséter. Utilisez une séparation émoussée pour élargir l’espace entre le fascia et le masséter en prenant soin de maintenir l’intégrité globale du fascia restant.
6. En utilisant l’incision fasciale comme fenêtre sur le masséter superficiel, créez une blessure circulaire dans le muscle mesurant 5 mm de diamètre et 5 mm de profondeur à l’aide d’une biopsie à l’emporte-pièce jetable stérilisée. Assurez-vous que le défaut est centré entre les branches buccale et mandibulaire du nerf facial, en prenant soin d’éviter tout traumatisme aux nerfs (Figure 1B).
7. Ajouter le biomatériau à la lésion du massétère circulaire (Figure 1C).
8. Une fois que l’agent est correctement en place, suturez la fenêtre fasciale d’investissement musculaire à l’aide d’une seule suture monofilament 5-0 pour éviter la migration.
   REMARQUE : Les agents sous forme solide sont directement placés dans la plaie, et le tissu peut être perturbé pour favoriser la saturation en sang, tandis que les agents liquides sont ajoutés et laissés gélifier si nécessaire ou immédiatement fermés en place à l’aide du fascia pour éviter tout mouvement indésirable. Dans l’expérience démontrée ici, un cryogel à base d’acide hyaluronique acrylé est administré.
9. Fermez la peau à l’aide d’une simple technique sous-cutanée interrompue ou courante avec un monofilament 5-0.
   1. Appliquez de la colle cutanée sur les sutures pour aider à prévenir la déhiscence de l’incision postopératoire.
10. Laissez les rats se rétablir dans une cage avec une source de chaleur externe (coussin chauffant sous la cage ou chauffe-mains stériles dans la cage) et observez pendant 30 minutes postopératoire.
11. Diluer l’antibiotique triméthoprime-sulfaméthoxazole (200 mg de triméthoprime et 40 mg de sulfaméthoxazole dans 5 ml) dans l’eau potable (5 ml/200 ml d’eau) et l’administrer dans de l’eau potable chez les rongeurs pendant 7 jours postopératoires. S’assurer que l’analgésie périopératoire est effectuée conformément aux protocoles de l’établissement.
    REMARQUE : Dans cette étude, 0,25 % de bupivacaïne SC a été administré avant l’incision chirurgicale, 0,05 mg/kg de buprénorphine SC a été administré avant la récupération de l’anesthésie et 2 mg/kg de méloxicam IP a été administré avant la récupération de l’anesthésie et de nouveau le lendemain matin.

2. Récolte, congélation et analyse du masséter

1. À des moments prédéterminés, sacrifiez les rats en induisant une surdose d’un agent chimique (par exemple, CO₂ ou anesthésique) dans la chambre d’induction de l’anesthésique.
2. Confirmez le sacrifice des rongeurs en effectuant une thoracotomie bilatérale à l’aide d’une incision unique au scalpel à travers la 4^e côte ventralement pour perforer les poumons (thoracotomie bilatérale).
3. Rouvrez l’incision chirurgicale pour permettre la visualisation du masséter et retirez la peau recouvrant le masséter pour faciliter l’accès.
4. Disséquez et retirez le masséter de la mandibule, en commençant par la séparation au niveau de l’angle mandibulaire. Assurez-vous que la dissection se produit le long de la surface de l’os pour capturer la totalité de l’épaisseur du masséter.
   1. Disséquer antérieurement le long de la mandibule, en sectionnant le point d’attache du tendon. Ensuite, disséquez le long de l’arc zygomatique vers l’arrière (Figure 1D). Enfin, disséquez l’attache postérieure car il y a un risque accru de saignement.
5. Rincez le masséter excisé dans 1x PBS à température ambiante (RT) et éliminez l’excès d’humidité en épongeant soigneusement l’échantillon avec une serviette en papier.
6. Placez le muscle dans un cryomoule et immergez-le dans un support d’enrobage à température de coupe optimale (OCT), avec l’extrémité antérieure vers le bas et l’extrémité postérieure vers le haut.
7. Ajoutez de l’isopentane dans une tasse métallique et refroidissez-la en l’immergeant dans de l’azote liquide en prenant soin d’empêcher l’azote liquide d’y pénétrer.
   1. Une fois que l’isopentane a atteint la température optimale (-140 à -149 °C) et qu’il s’est légèrement épaissi, maintenez le cryomoule contenant l’OCT et le masséter partiellement immergé dans l’isopentane jusqu’à ce que l’OCT ait gelé. Conservez le cryomoule congelé sur de la glace carbonique jusqu’à ce qu’il soit transféré dans un congélateur à -80 °C.
8. Cryosection des échantillons de masséter congelés avec une orientation telle que le pôle antérieur est sectionné en premier, en se déplaçant vers l’arrière à travers l’échantillon. Réglez la température du bloc tissulaire à -20 °C et la température de la lame de cryosection à -15 °C. Pour chaque 200 μm, coupez 4 lames (2 avec des sections de 10 μm, 2 avec des sections de 6 μm) avant de déplacer 200 μm plus loin, en coupant 4 lames supplémentaires et en répétant l’opération dans tout l’échantillon.
9. Utilisez les coupes de 10 μm pour l’analyse histologique (trichrome de Masson, hématoxyline et éosine, rouge de Picrosirius, etc.) et les coupes de 6 μm pour l’immunohistochimie.
   REMARQUE : Pour l’histologie, des coupes de 6 μm peuvent également être utilisées.
10. Capturez des images à l’aide de la microscopie optique ou de la fluorescence.
11. Mesurez les zones de section transversale de ~200 fibres musculaires du muscle masséter à l’aide du logiciel Image J.

3. Analyse immunohistochimique

1. Pour l’analyse immunohistochimique de la chaîne lourde de myosine embryonnaire, fixer les lames dans 4 % de PFA pendant 1 h à RT.
2. Lavez les diapositives en PBS 3 fois à RT, en laissant chaque lavage reposer pendant 10 min.
3. Perméabiliser les tissus en incubant les lames avec 0,5 % de Triton X-100 à RT pendant 15 min.
4. Lavez les diapositives en PBS 3 fois à RT, en laissant chaque lavage reposer pendant 10 min.
5. Incuber avec l’anticorps monoclonal primaire de souris hôtes (1:200) dans 2 % de sérum de chèvre normal (NGS) à 4 °C pendant la nuit.
6. Lavez les lames en PBS-Tween 3 fois à RT, en laissant chaque lavage reposer pendant 10 min.
7. Incuber avec un anticorps secondaire anti-souris marqué au fluorophore provenant d’un lapin hôte (1:500) dans 2 % NGS à RT pendant 2 h.
8. Lavez les lames en PBS-Tween 3 fois à RT, en laissant chaque lavage reposer pendant 10 min.
9. Montez les diapositives à l’aide de 3 gouttes de support fluorescent DAPI avant de placer une lamelle.

Résultats

Les résultats de l’évaluation de la VML craniofaciale et de la régénération tissulaire à l’aide de biomatériaux comprennent des résultats quantitatifs et qualitatifs.

La figure 2 illustre un exemple d’évaluation qualitative à l’aide du modèle décrit précédemment. L’observation de la croissance de novo des fibres musculaires dans notre hydrogel est un résultat positif qualitatif (

Discussion

Le protocole comporte plusieurs étapes critiques pour lesquelles une attention particulière est nécessaire pour obtenir un résultat optimal. L’étape 1.4 décrit l’incision initiale et la séparation brutale de la peau du fascia masséter superficiel. La dissection contondante doit être effectuée directement le long de la peau avec des ciseaux pointant loin du muscle et du fascia sous-jacents pour éviter d’entailler et de créer involontairement une fenêtre à travers le fa...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
F1.652 Myosin heavy chain (embryonic) monoclonal antibody	DSHB	F1.652
Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21242
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
Integra Standard Biopsy Punches, Disposable Standard biopsy punch; 5 mm, Diameter: 0.19 in., 0.5 cm	Integra	12460411
Mounting Medium with DAPI - Aqueous, Fluoroshield	Abcam	ab104139
Rabbit Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) preadsorbed	Abcam	ab150127
Sulfamethoxazole/Trimethoprim Oral Suspension, Cherry Flavored, 473 mL	Med-Vet International	SKU: RXBAC-SUSP