Модель жевательной объемной мышечной потери у грызунов для изучения биоинженерных материалов

Резюме

В данной статье мы описываем протокол хирургического создания объемной мышечной потери (VML) у крысы-массажиста, обеспечивая воспроизводимую и доступную модель для изучения черепно-лицевых мышечных травм и их лечения с использованием биоматериалов, таких как новый гидрогель.

Аннотация

Черепно-лицевая потеря объемной мышечной массы (ВМЛ) может возникнуть в результате тяжелой травмы, хирургического иссечения, воспаления и врожденных или других приобретенных заболеваний. Лечение черепно-лицевой ВМЛ включает в себя хирургический, функциональный мышечный перенос. Тем не менее, эти процедуры не могут восстановить нормальную функцию, чувствительность или выражение, и чаще всего эти состояния не лечатся. Было проведено очень мало исследований по регенерации скелетных мышц на животных моделях черепно-лицевой ВМЛ. В данной рукописи описывается модель крысы для изучения черепно-лицевой травмы ВМЛ и протокол гистологической оценки биоматериалов при лечении этих травм. Жидкий гидрогель и лиофилизированные каркасы наносятся во время хирургического создания VML, а жевательные масла удаляются в терминальных временных точках до 12 недель с высокой скоростью удержания и незначительными осложнениями. Гематоксилин и эозин (ПЭ), трихром Массона и иммуногистохимический анализ используются для оценки параметров регенерации скелетных мышц, а также биосовместимости и иммуномодуляции. В то время как мы демонстрируем исследование гидрогеля на основе гиалуроновой кислоты, эта модель предоставляет средства для оценки последующих итераций материалов при травмах VML.

Введение

Тяжелая травма, хирургическое иссечение, воспаление и другие приобретенные состояния могут привести к такой степени потери тканей, которая подавляет эндогенные механизмы восстановления скелетных мышц. Потеря резидентных клеток и структур, способствующих первичному регенеративному процессу, может привести к патологическому ремоделированию и фиброзу тканей, что приводит к долгосрочному дефициту функции и чувствительности и называется объемной потерей мышечной массы (VML)^1,2,3. Воспалительная реакция на повреждения ВМЛ включает в себя хорошо задокументированный и сложный механизм с участием макрофагов, цитокинов и миогенных клеток, который представляет собой множество теоретических мишеней в регенеративной медицине⁴. В то время как во многих исследованиях in vitro эти мишени использовались на животных моделях лечения VML конечностей, существует недостаток исследований регенерации скелетных мышц на животных моделях черепно-лицевой VML ^5,6,7.

Потеря черепно-лицевой ткани может быть результатом состояний, описанных ранее, а дефицит черепно-лицевой ткани также может возникать при врожденных состояниях, таких как расщелина, которая в некоторых случаях включает в себя истинный объемный дефицит мышечной ткани ^8,9. Поскольку мышцы черепно-лицевой области важны для функционирования, а также для эстетического вида, долгосрочные последствия ВМЛ могут иметь значительные психологические последствия. Некоторые аспекты черепно-лицевых скелетных мышц отличаются от скелетных мышц конечностей, полученных из сомитов, включая вариации экспрессии генов, эмбрионального происхождения, фенотипа сателлитных клеток, количества сателлитных клеток, состава волокон и архитектуры 10,11,12,13. Эти вариации могут привести к травмам VML, влияющим на черепно-лицевую мышцу иначе, чем на мышцы^, полученные от сомитов^14,15. На сегодняшний день подходы тканевой инженерии, показавшие увеличение регенерации в животных моделях ВМЛ конечностей, не были эквивалентно перенесены на черепно-лицевые модели ВМЛ на животных¹⁶. Это подчеркивает необходимость оптимизации подходов in vivo к черепно-лицевым моделям VML у животных.

Несмотря на то, что было проведено несколько исследований черепно-лицевой ВМЛ in vivo, исследования невелики, и создание надежного дефекта черепно-лицевой мышцы на животных моделях является сложной задачей ^8,13. Kim et al. сообщили о разработке жевательной модели VML для мыши. Тем не менее, это исследование оценивало гистологию только до 28 дней после травмы и имело неясную способность обнаруживать различия в гистологических исходах между временными точками¹⁷. Rodriguez et al. сообщили о разработке черепно-лицевой модели VML овец. Тем не менее, они сообщили о высокой вариабельности в экспериментальных группах, что свидетельствует о неоднородности тяжести исходной хирургической травмы^. В этой статье мы представляем протокол нашей жевательной модели VML на крысе и демонстрируем его полезность для оценки подходов тканевой инженерии.

протокол

Данное исследование проводилось в соответствии со всеми применимыми нормами, в том числе с соблюдением рекомендаций, изложенных в Руководстве по уходу за лабораторными животными и их использованию. Программа институционального ухода за животными и их использования UCSF одобрила все процедуры для животных и послеоперационный уход (протокол IACUC #AN195944-01).

1. Хирургия VML

1. Обезболите самцов крыс Спрэг-Доули в возрасте 12 недель массой тела 276-300 г в герметичном контейнере с использованием изофторновой общей анестезии в дозе 1%-5% перед переводом в стерильное хирургическое поле.
   1. Расположите грызунов на левом боку так, чтобы шея была вытянута в нейтральном положении, а нос вошел в носовой конус с анестезирующим веществом, что позволило бы получить доступ к правой стороне лица.
   2. Конусируйте расход изофлуорана от индукционного до поддерживающего расхода (примерно 2%).
2. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза грызунов.
3. Очистите операционное место, окаймленное линией между правым уголком рта, основанием правого уха вверху и углом нижней челюсти от шерсти с помощью крема для депиляции.
   1. Продезинфицируйте операционное место несколько раз круговыми движениями, используя скраб из этанола и бетадина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильная драпировка не используется в этом протоколе, учитывая размер и место доступа. Процедура проводится с использованием асептической техники в соответствии с рекомендациями по уходу за животными.
4. Сделайте продольный разрез длиной 3-4 см, простирающийся от нижней правой подушечки усов до правого уха.
   1. Приподнимите кожный лоскут, что позволит визуализировать правую жевательную мышцу, а также щечную и нижнечелюстную ветви лицевого нерва (рис. 1A).
   2. Очистите кожу от подлежащей фасции с помощью тупого разделения и удерживайте края кожи в отведенном положении с помощью хирургических зажимов для оптимальной визуализации подлежащей мышцы.
5. Сделайте поперечный разрез длиной 1-2 см в фасции, перекрывающей переднюю часть массажника. Используйте тупое разделение, чтобы расширить пространство между фасцией и жевательной резиной, с осторожностью сохраняя общую целостность оставшейся фасции.
6. Используя фасциальный разрез в качестве окна к поверхностному массажисту, создайте круговую травму в мышце размером 5 мм в поперечнике и 5 мм в глубину с помощью стерилизованной одноразовой пункционной биопсии. Убедитесь, что дефект расположен между щечной и нижнечелюстной ветвями лицевого нерва, стараясь не травмировать нервы (Рисунок 1B).
7. Добавьте биоматериал к кольцевой жевательной травме (рис. 1C).
8. После того, как средство будет на месте, зашите фасциальное окно, инвестирующее мышцы, с помощью одного монофиламентного шва 5-0, чтобы избежать миграции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Твердые агенты помещаются непосредственно в рану, и ткань может быть нарушена для обеспечения насыщения кровью, в то время как жидкие агенты добавляются и при необходимости получают желатин или немедленно закрываются на месте с помощью фасции, чтобы избежать нежелательного движения. В показанном здесь эксперименте вводится криогель на основе акрилированной гиалуроновой кислоты.
9. Закройте кожу с помощью простой прерывистой или бегущей подкожной техники мононитью 5-0.
   1. Нанесите клей на кожу поверх швов, чтобы предотвратить расхождение послеоперационного разреза.
10. Дайте крысам восстановиться в клетке с внешним источником тепла (грелкой под клеткой или стерильными грелками для рук в клетке) и наблюдайте в течение 30 минут после операции.
11. Разведите антибиотик триметоприм-сульфаметоксазол (200 мг триметоприма и 40 мг сульфаметоксазола в 5 мл) в питьевой воде (5 мл/200 мл воды) и введите его в питьевую воду грызунов в течение 7 дней после операции. Убедитесь, что периоперационная анальгезия проводится в соответствии с протоколами учреждения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании 0,25% подкожного бупивакаина вводили до хирургического разреза, 0,05 мг/кг подкожного бупренорфина вводили до восстановления после анестезии, и 2 мг/кг IP-мелоксикама вводили до восстановления после анестезии и повторно на следующее утро.

2. Жевательный сбор, заморозка и анализ

1. В заранее определенные моменты времени принесите крыс в жертву, вызвав передозировку химического агента (например, CO₂ или анестетика) в камере индукции анестетика.
2. Подтвердите жертвоприношение грызуна путем проведения двусторонней торакотомии с использованием одного разреза скальпеля через^4-е ребро вентрально для пункции легких (двусторонняя торакотомия).
3. Снова откройте хирургический разрез, чтобы обеспечить визуализацию массажиста, и удалите кожу, лежащую над жевательной мышцей, для облегчения доступа.
4. Рассеките и удалите жевательную мышцу от нижней челюсти, начиная с отделения под нижним углом. Убедитесь, что рассечение происходит вдоль поверхности кости, чтобы захватить всю толщину жевательной мышцы.
   1. Рассекайте спереди вдоль нижней челюсти, разрезая точку прикрепления сухожилия. Затем рассекайте вдоль скуловой дуги кзади (рисунок 1D). Наконец, рассеките заднее прикрепление, так как существует повышенный риск кровотечения.
5. Промойте исчерченную жевательную жидкость в 1x PBS при комнатной температуре (RT) и удалите излишнюю влагу, тщательно промокнув образец бумажным полотенцем.
6. Поместите мышцу в криомолд и погрузите ее в среду для встраивания с оптимальной температурой резки (OCT), при этом передний конец должен быть обращен вниз, а задний — вверх.
7. Добавьте изопентан в металлическую чашку и охладите ее, погрузив в жидкий азот с осторожностью, чтобы предотвратить попадание жидкого азота.
   1. После того как изопентан достигнет оптимальной температуры (от -140 до -149 °C) и слегка загустеет, подержите криомолд, содержащий ОКТ, и жевательную жидкость частично погруженными в изопентан до тех пор, пока ОКТ не замерзнет. Храните замороженный криомольд на сухом льду до тех пор, пока не переложите в морозильную камеру при температуре -80 °C.
8. Криосекция замораживает жевательные образцы с ориентацией таким образом, что передний полюс рассекается первым, двигаясь кзади через образец. Установите температуру тканевого блока на -20 °C, а температуру криосекционного лезвия на -15 °C. Для каждых 200 μм вырежьте 4 предметных стекла (2 с участками по 10 μм, 2 с участками 6 μм), прежде чем переместиться на 200 μм дальше, вырезав 4 дополнительных предметных стекла и повторив по всему образцу.
9. Используйте срезы 10 мкм для гистологического анализа (трихром Массона, гематоксилин и эозин, Пикрозириус Ред и т. д.) и срезы 6 мкм для иммуногистохимии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для гистологии также можно использовать срезы 6 мкм.
10. Захватывайте изображения с помощью световой или флуоресцентной микроскопии.
11. Измерьте площади поперечного сечения ~200 мышечных волокон жевательной мышцы с помощью программного обеспечения Image J.

3. Иммуногистохимический анализ

1. Для иммуногистохимического анализа тяжелой цепи эмбрионального миозина фиксируют предметные стекла в 4% ПФА в течение 1 ч в ЛТ.
2. Промойте предметные стекла в PBS 3 раза при температуре RT, давая каждой стирке постоять 10 минут.
3. Пермеабилизируйте ткань, инкубируя предметные стекла с 0,5% Triton X-100 при RT в течение 15 минут.
4. Промойте предметные стекла в PBS 3 раза при температуре RT, давая каждой стирке постоять 10 минут.
5. Инкубируйте с первичным моноклональным антителом мышей-хозяев (1:200) в 2% нормальной сыворотке крови коз (NGS) при 4 °C в течение ночи.
6. Промойте слайды в PBS-Tween 3 раза при температуре RT, давая каждой стирке постоять 10 минут.
7. Инкубировать с мечеными флуорофорами вторичными антителами против мышей из кролика-хозяина (1:500) в 2% NGS при ЛТ в течение 2 ч.
8. Промойте слайды в PBS-Tween 3 раза при температуре RT, давая каждой стирке постоять 10 минут.
9. Установите слайды с помощью 3 капель флуоресцентного крепления DAPI перед установкой покровного стекла.

Результаты

Исходы оценки черепно-лицевой ВМЛ и регенерации тканей с использованием биоматериалов включают как количественные, так и качественные исходы.

На рисунке 2 показан пример качественной оценки с использованием ранее описанной модели. Наб...

Обсуждение

В протоколе есть несколько критических этапов, на которые необходимо обратить особое внимание для достижения оптимального результата. В шаге 1.4 описывается первоначальный разрез и тупое отделение кожи от поверхностной жевательной фасции. Тупое рассечение должно бы?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
F1.652 Myosin heavy chain (embryonic) monoclonal antibody	DSHB	F1.652
Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21242
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
Integra Standard Biopsy Punches, Disposable Standard biopsy punch; 5 mm, Diameter: 0.19 in., 0.5 cm	Integra	12460411
Mounting Medium with DAPI - Aqueous, Fluoroshield	Abcam	ab104139
Rabbit Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) preadsorbed	Abcam	ab150127
Sulfamethoxazole/Trimethoprim Oral Suspension, Cherry Flavored, 473 mL	Med-Vet International	SKU: RXBAC-SUSP