Biyomühendislik Materyallerini İncelemek İçin Masseter Hacimsel Kas Kaybının Kemirgen Modeli

Özet

Burada, sıçan masseterinde hacimsel kas kaybı (VML) yaralanmasının cerrahi olarak oluşturulması için bir protokol açıklıyoruz ve kraniyofasiyal kas yaralanmalarının incelenmesi ve bunların yeni hidrojel gibi biyomateryaller kullanılarak tedavisi için tekrarlanabilir ve erişilebilir bir model sağlıyoruz.

Özet

Kraniyofasiyal hacimsel kas kaybı (VML) yaralanmaları, ciddi travma, cerrahi eksizyon, inflamasyon ve konjenital veya diğer edinsel durumların bir sonucu olarak ortaya çıkabilir. Kraniyofasiyal VML'nin tedavisi cerrahi, fonksiyonel kas transferini içerir. Bununla birlikte, bu prosedürler normal işlevi, hissi veya ifadeyi geri yükleyemez ve daha yaygın olarak, bu koşullar tedavi edilmez. Kraniyofasiyal VML'nin hayvan modellerinde iskelet kası rejenerasyonu üzerine çok az araştırma yapılmıştır. Bu el yazması, kraniyofasiyal VML yaralanmasının incelenmesi için bir sıçan modelini ve bu yaralanmaların tedavisinde biyomateryallerin histolojik değerlendirmesi için bir protokolü tanımlamaktadır. Cerrahi VML oluşturulması sırasında sıvı hidrojel ve dondurularak kurutulmuş iskeleler uygulanır ve masseterler, yüksek retansiyon oranları ve ihmal edilebilir komplikasyonlarla 12 haftaya kadar terminal zaman noktalarında eksize edilir. Hematoksilen ve eozin (HE), Masson Trikrom ve immünohistokimyasal analiz, iskelet kası rejenerasyonunun yanı sıra biyouyumluluk ve immünomodülasyon parametrelerini değerlendirmek için kullanılır. Hyaluronik asit bazlı bir hidrojelin çalışmasını gösterirken, bu model VML yaralanmalarında malzemelerin sonraki yinelemelerini değerlendirmek için bir araç sağlar.

Giriş

Şiddetli travma, cerrahi eksizyon, iltihaplanma ve diğer edinilmiş durumlar, endojen iskelet kası onarım mekanizmalarını zorlayan bir dereceye kadar doku kaybına neden olabilir. Birincil rejeneratif süreci destekleyen yerleşik hücrelerin ve yapıların kaybı, patolojik yeniden şekillenme ve doku fibrozu ile sonuçlanabilir, bu da uzun vadeli işlev ve duyu eksikliklerine neden olur ve hacimsel kas kaybı (VML) olarak adlandırılır1,2,3. VML yaralanmalarına inflamatuar yanıt, rejeneratif tıpta birçok teorik hedef sunan makrofajlar, sitokinler ve miyojenik hücreleri içeren iyi belgelenmiş ve karmaşık bir mekanizmayı içerir⁴. Birçok in vitro çalışmada bu hedefler ekstremite VML tedavisinin hayvan modellerinde kullanılmış olsa da, kraniyofasiyal VML ^5,6,7'nin hayvan modellerinde iskelet kası rejenerasyonu üzerine araştırma eksikliği vardır.

Kraniyofasiyal doku kaybı, daha önce tarif edildiği gibi durumlardan kaynaklanabilir ve yetersiz kraniyofasiyal doku, bazı durumlarda kas dokusunun gerçek bir hacimsel eksikliğini içeren yarık gibi doğuştan gelen durumlarda da ortaya çıkabilir ^8,9. Kraniyofasiyal bölge kasları estetik görünümün yanı sıra fonksiyon için de önemli olduğundan, VML'nin uzun vadeli etkileri önemli psikolojik rahatsızlıklara neden olabilir. Kraniyofasiyal iskelet kasının çeşitli yönleri, gen ekspresyonu, embriyonik köken, uydu hücre fenotipi, uydu hücre miktarı, lif bileşimi ve mimarideki varyasyonlar dahil olmak üzere ekstremitelerde bulunan somit türevli iskelet kasından farklıdır 10,11,12,13. Bu varyasyonlar, kraniyofasiyal kası somit kaynaklı kastan farklı şekilde etkileyen VML yaralanmalarına neden olabilir^14,15. Bugüne kadar, ekstremite VML'nin hayvan modellerinde rejenerasyonu arttırdığı gösterilen doku mühendisliği yaklaşımları, kraniyofasiyal VML hayvan modellerine eşdeğer olarak tercüme edilmemiştir¹⁶. Bu, hayvan kraniyofasiyal VML modellerine in vivo yaklaşımları optimize etme ihtiyacının altını çizmektedir.

Kraniyofasiyal VML ile ilgili birkaç in vivo çalışma yapılmış olsa da, çalışmalar küçüktür ve hayvan modellerinde sağlam bir kraniyofasiyal kas defektinin oluşturulması zordur ^8,13. Kim ve ark. bir fare masseter VML modelinin geliştirildiğini bildirdi. Bununla birlikte, bu çalışma sadece yaralanmayı takip eden 28 güne kadar histolojiyi değerlendirdi ve¹⁷ zaman noktaları arasındaki histolojik sonuçlardaki farklılıkları tespit etmek için belirsiz bir güce sahipti. Rodriguez ve ark. bir koyun kraniyofasiyal VML modelinin geliştirildiğini bildirmiştir. Bununla birlikte, deney grupları içinde yüksek değişkenlik bildirdiler, bu da ilk cerrahi yaralanmanın ciddiyetinde heterojenliği düşündürüyor¹⁶. Burada, sıçan masseter VML modelimizin protokolünü rapor ediyoruz ve doku mühendisliği yaklaşımlarını değerlendirmedeki faydasını gösteriyoruz.

Protokol

Bu çalışma, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nda belirtilen tavsiyelere uyulması da dahil olmak üzere geçerli tüm düzenlemelere uygun olarak yürütülmüştür. UCSF Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Programı, tüm hayvan prosedürlerini ve ameliyat sonrası bakımı onayladı (IACUC protokolü #AN195944-01).

1. VML cerrahisi

1. 12 haftalıkken, 276-300 g ağırlığındaki erkek Sprague-Dawley sıçanlarını, steril bir cerrahi alana transfer edilmeden önce% 1 -% 5 oranında izofloran genel anestezi kullanarak kapalı bir kapta uyuşturun.
   1. Kemirgenleri, boyun nötr bir pozisyonda uzatılacak ve burun anestezik burun konisine oturacak ve yüzün sağ tarafına maruz kalacak şekilde sol taraflarına yerleştirin.
   2. İndüksiyondan bakım akış hızına kadar konik izofloran akış hızı (yaklaşık% 2).
2. Kemirgenlerin gözlerine oftalmik merhem sürün.
3. Ağzın sağ köşesi, sağ kulağın tabanı üst kısım ve alt çene açısı arasında bir çizgi ile sınırlanan ameliyat bölgesini tüy dökücü krem kullanarak kürkten temizleyin.
   1. Hem etanol hem de betadin ovma kullanarak ameliyat bölgesini dairesel hareketlerle birkaç kez dezenfekte edin.
      NOT: Erişimin boyutu ve konumu göz önüne alındığında bu protokolde steril örtü kullanılmamaktadır. Prosedür, hayvan bakım yönergelerine uygun olarak aseptik bir teknik kullanılarak gerçekleştirilir.
4. Alt sağ bıyık yastığından sağ kulağa kadar uzanan 3-4 cm uzunluğunda uzunlamasına bir kesi oluşturun.
   1. Sağ masseterin yanı sıra fasiyal sinirin bukkal ve mandibular dallarının görüntülenmesine izin veren bir deri flebini yükseltin (Şekil 1A).
   2. Künt ayırma kullanarak cildi alttaki fasyadan temizleyin ve alttaki kasın en iyi şekilde görselleştirilmesi için cerrahi kelepçeler kullanarak cilt kenarlarını geri çekilmiş bir konumda tutun.
5. Masseterin ön kısmını kaplayan fasyada 1-2 cm uzunluğunda enine bir kesi yapın. Kalan fasyanın genel bütünlüğünü korumak için fasya ile masseter arasındaki boşluğu dikkatli bir şekilde genişletmek için künt ayırma kullanın.
6. Fasyal insizyonu yüzeysel massetere açılan bir pencere olarak kullanarak, sterilize edilmiş tek kullanımlık punch biyopsisi kullanarak kasta 5 mm çapında ve 5 mm derinliğinde dairesel bir yaralanma oluşturun. Sinirlere travma yaşamamak için defektin fasiyal sinirin bukkal ve mandibular dalları arasında merkezlendiğinden emin olun (Şekil 1B).
7. Biyomateryali dairesel masseter yaralanmasına ekleyin (Şekil 1C).
8. Ajan uygun şekilde yerleştirildikten sonra, migrasyonu önlemek için tek bir 5-0 monofilament sütür kullanarak kas yatırımı yapan fasyal pencereyi dikin.
   NOT: Katı formdaki ajanlar doğrudan yaraya yerleştirilir ve doku kanla doygunluğu arttırmak için bozulabilirken, sıvı ajanlar eklenir ve gerekirse jelleşmeye izin verilir veya istenmeyen hareketi önlemek için fasya kullanılarak hemen yerine kapatılır. Burada gösterilen deneyde, akrilatedilmiş hyaluronik asit bazlı bir kriyojel uygulanır.
9. 5-0 monofilament ile basit, kesintili veya çalışan bir subkutiküler teknik kullanarak cildi kapatın.
   1. Ameliyat sonrası insizyon ayrışmasını önlemeye yardımcı olmak için dikişlerin üzerine cilt yapıştırıcısı sürün.
10. Sıçanların harici bir ısıtma kaynağı (kafesin altındaki ısıtma yastığı veya kafesteki steril el ısıtıcıları) olan bir kafeste iyileşmesine izin verin ve ameliyat sonrası 30 dakika boyunca gözlemleyin.
11. Trimetoprim-sülfametoksazol antibiyotiği (5 mL / 200 mL su) içme suyunda (5 mL / 200 mL su) seyreltin ve ameliyat sonrası 7 gün boyunca kemirgen içme suyunda uygulayın. Perioperatif analjezinin kurumsal protokollere göre yapıldığından emin olun.
    NOT: Bu çalışmada cerrahi insizyon öncesi %0.25 SC bupivakain, anesteziden derlenmeden önce 0.05 mg/kg SC buprenorfin ve anesteziden derlenmeden önce ve ertesi sabah tekrar 2 mg/kg IP meloksikam uygulandı.

2. Masseter hasadı, dondurma ve analizi

1. Önceden belirlenmiş zaman noktalarında, anestezik indüksiyon odasında aşırı dozda bir kimyasal ajan (örneğin, CO₂ veya anestezik) indükleyerek sıçanları feda edin.
2. Akciğerleri delmek için 4^{. kaburga} ventralinden tek bir neşter kesisi kullanarak bilateral torakotomi yaparak kemirgen kurbanını onaylayın (bilateral torakotomi).
3. Masseterin görüntülenmesini sağlamak için cerrahi insizyonu yeniden açın ve erişim kolaylığı için masseterin üzerindeki cildi çıkarın.
4. Mandibular açıda ayrılma ile başlayarak masseteri mandibuladan disseke edin ve çıkarın. Masseter kalınlığının tamamını yakalamak için diseksiyonun kemik yüzeyi boyunca gerçekleştiğinden emin olun.
   1. Tendonun bağlanma noktasını keserek mandibula boyunca öne doğru diseksiyon yapın. Ardından, elmacık kemeri boyunca posterior olarak inceleyin (Şekil 1D). Sonunda, kanama riski arttığı için arka ataşmanı inceleyin.
5. Eksize edilen masseteri oda sıcaklığında (RT) 1x PBS'de durulayın ve numuneyi bir kağıt havluyla iyice kurulayarak aşırı nemi alın.
6. Kası bir kriyokalıba yerleştirin ve ön ucu aşağı ve arka ucu yukarı bakacak şekilde optimum kesme sıcaklığı (OCT) gömme ortamına daldırın.
7. Metal bir kaba izopentan ekleyin ve sıvı nitrojenin girmesini önlemek için dikkatli bir şekilde sıvı nitrojene batırarak soğutun.
   1. İzopentan optimum sıcaklığa (-140 ila -149 °C) ulaştığında ve hafifçe kalınlaştığında, OCT içeren kriyokalıbı ve masseteri OCT donana kadar kısmen izopentan içine batırılmış halde tutun. Dondurulmuş cryomold'u -80 °C'de bir dondurucuya aktarılana kadar kuru buz üzerinde tutun.
8. Kriyoseksiyon donmuş masseter numuneleri, ön kutup önce kesitlere ayrılacak ve numune boyunca arkaya doğru hareket edecek şekilde oryantasyona sahiptir. Doku bloğu sıcaklığını -20 °C'ye ve kriyoseksiyon bıçağı sıcaklığını -15 °C'ye ayarlayın. Her 200 μm için, 200 μm daha ileri gitmeden önce 4 slayt (2 μm kesitli, 2 μm 6 μm kesitli) kesin, 4 ek slayt kesin ve numune boyunca tekrarlayın.
9. Histoloji analizi için 10 μm'lik kesitleri (Masson's Trichrome, Hematoxylin ve Eosin, Picrosirius Red, vb.) ve immünohistokimya için 6 μm'lik kesitleri kullanın.
   NOT: Histoloji için 6 μm'lik kesitler de kullanılabilir.
10. Işık veya floresan mikroskobu kullanarak görüntü yakalayın.
11. Image J yazılımını kullanarak masseter kasının ~200 kas lifinin kesit alanlarını ölçün.

3. İmmünohistokimyasal analiz

1. Embriyonik miyozin ağır zincirinin immünohistokimyasal analizi için, slaytları RT'de 1 saat boyunca% 4 PFA'da sabitleyin.
2. Slaytları PBS'de RT'de 3 kez yıkayın ve her yıkamanın 10 dakika oturmasına izin verin.
3. Slaytları RT'de% 0.5 Triton X-100 ile 15 dakika inkübe ederek dokuyu geçirgen hale getirin.
4. Slaytları PBS'de RT'de 3 kez yıkayın ve her yıkamanın 10 dakika oturmasına izin verin.
5. Gece boyunca 4 ° C'de% 2 normal keçi serumunda (NGS) konakçı farelerden (1:200) alınan birincil monoklonal antikor ile inkübe edin.
6. Slaytları PBS-Tween'de RT'de 3 kez yıkayın ve her yıkamanın 10 dakika oturmasına izin verin.
7. Tavşan konakçısından (1:500) 2 saat boyunca RT'de% 2 NGS'de florofor etiketli anti-fare ikincil antikoru ile inkübe edin.
8. Slaytları PBS-Tween'de RT'de 3 kez yıkayın ve her yıkamanın 10 dakika oturmasına izin verin.
9. Bir lamel yerleştirmeden önce 3 damla DAPI floresan montajı kullanarak slaytları monte edin.

Sonuçlar

Biyomateryaller kullanılarak kraniyofasiyal VML ve doku rejenerasyonunun değerlendirilmesi için sonuçlar hem kantitatif hem de kalitatif sonuçları içerir.

Şekil 2 , daha önce açıklanan modeli kullanarak bir nitel değerlendirme örneğini göstermektedir. Hidrojelimizde de novo kas lifi büyümesinin gözlemlenmesi, kalitatif bir pozitif sonuçtur (Şekil 2A) ve bir biyomateryalin ...

Tartışmalar

Protokolde, en iyi sonucu elde etmek için özel dikkat gösterilmesi gereken birkaç kritik adım vardır. Adım 1.4, cildin yüzeysel masseter fasyasından ilk insizyonunu ve künt ayrılmasını tanımlar. Künt diseksiyon, çentiklenmeyi ve istemeden fasya boyunca bir pencere oluşturulmasını önlemek için alttaki kas ve fasyadan uzağa bakacak şekilde makasla doğrudan cilt boyunca yapılmalıdır. Submandibular ven veya dış karotis arterin kasıtsız yaralanmasını önlemek ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
F1.652 Myosin heavy chain (embryonic) monoclonal antibody	DSHB	F1.652
Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21242
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
Integra Standard Biopsy Punches, Disposable Standard biopsy punch; 5 mm, Diameter: 0.19 in., 0.5 cm	Integra	12460411
Mounting Medium with DAPI - Aqueous, Fluoroshield	Abcam	ab104139
Rabbit Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) preadsorbed	Abcam	ab150127
Sulfamethoxazole/Trimethoprim Oral Suspension, Cherry Flavored, 473 mL	Med-Vet International	SKU: RXBAC-SUSP