Modelo de roedores de perda muscular volumétrica masseter para estudo de materiais de bioengenharia

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo para a criação cirúrgica de uma lesão de perda muscular volumétrica (VML) no masseter de ratos, fornecendo um modelo reprodutível e acessível para o estudo de lesões musculares craniofaciais e seu tratamento usando biomateriais como o novo hidrogel.

Resumo

As lesões de perda muscular volumétrica craniofacial (VML) podem ocorrer como resultado de trauma grave, excisão cirúrgica, inflamação e condições congênitas ou outras condições adquiridas. O tratamento do VML craniofacial envolve transferência muscular cirúrgica e funcional. No entanto, esses procedimentos são incapazes de restaurar a função, sensação ou expressão normais e, mais comumente, essas condições não são tratadas. Muito pouca pesquisa foi realizada sobre a regeneração do músculo esquelético em modelos animais de VML craniofacial. Este manuscrito descreve um modelo de rato para o estudo da lesão craniofacial do VML e um protocolo para a avaliação histológica de biomateriais no tratamento dessas lesões. Hidrogel líquido e andaimes liofilizados são aplicados no momento da criação do VML cirúrgico, e os masseteres são excisados em pontos de tempo terminais até 12 semanas com altas taxas de retenção e complicações insignificantes. Hematoxilina e eosina (HE), tricrômico de Masson e análise imuno-histoquímica são usados para avaliar parâmetros de regeneração do músculo esquelético, bem como biocompatibilidade e imunomodulação. Embora demonstremos o estudo de um hidrogel à base de ácido hialurônico, este modelo fornece um meio para avaliar iterações subsequentes de materiais em lesões de VML.

Introdução

Trauma grave, excisão cirúrgica, inflamação e outras condições adquiridas podem resultar em um grau de perda de tecido que sobrecarrega os mecanismos endógenos de reparo do músculo esquelético. A perda de células e estruturas residentes que promovem o processo regenerativo primário pode resultar em remodelação patológica e fibrose tecidual, resultando em déficits de função e sensação a longo prazo e são chamadas de perda muscular volumétrica (VML)^1,2,3. A resposta inflamatória às lesões de VML envolve um mecanismo bem documentado e complexo envolvendo macrófagos, citocinas e células miogênicas que apresenta muitos alvos teóricos na medicina regenerativa⁴. Embora muitos estudos in vitro tenham utilizado esses alvos em modelos animais de tratamento de VML de extremidade, há uma falta de pesquisas sobre a regeneração do músculo esquelético em modelos animais de VML craniofacial ^5,6,7.

A perda de tecido craniofacial pode resultar de condições como as descritas anteriormente, e o tecido craniofacial deficiente também pode ocorrer em condições congênitas, como fissuras, que em alguns casos envolvem uma verdadeira deficiência volumétrica de tecido muscular ^8,9. Como os músculos da região craniofacial são importantes para a função e também para a aparência estética, os efeitos a longo prazo do VML podem ter aflição psicológica significativa. Vários aspectos do músculo esquelético craniofacial são diferentes do músculo esquelético derivado de somitos encontrado nas extremidades, incluindo variações na expressão gênica, origem embrionária, fenótipo de células satélites, quantidade de células satélites, composição de fibras e arquitetura 10,11,12,13. Essas variações podem resultar em lesões de VML afetando o músculo craniofacial de forma diferente do músculo derivado de somitos^14,15. Até o momento, as abordagens de engenharia de tecidos que demonstraram aumentar a regeneração em modelos animais de VML de extremidade não se traduziram de forma equivalente aos modelos animais de VML craniofacial¹⁶. Isso ressalta a necessidade de otimizar abordagens in vivo para modelos de VML craniofaciais em animais.

Embora vários estudos in vivo de VML craniofacial tenham sido realizados, os estudos são pequenos e a criação de um defeito muscular craniofacial robusto em modelos animais é^{desafiadora 8,13}. Kim et al. relataram o desenvolvimento de um modelo VML de masseter de camundongo. No entanto, este estudo avaliou a histologia apenas até 28 dias após a lesão e teve poder incerto para detectar diferenças nos resultados histológicos entre os momentos¹⁷. Rodriguez et al. relataram o desenvolvimento de um modelo de VML craniofacial de ovelhas. No entanto, eles relataram alta variabilidade dentro dos grupos experimentais, sugerindo heterogeneidade na gravidade da lesão cirúrgica inicial¹⁶. Aqui, relatamos o protocolo de nosso modelo VML masseter de rato e demonstramos sua utilidade na avaliação de abordagens de engenharia de tecidos.

Protocolo

Este estudo foi conduzido de acordo com todos os regulamentos aplicáveis, incluindo a adesão às recomendações descritas no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. O Programa Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UCSF aprovou todos os procedimentos e cuidados pós-operatórios com animais (protocolo IACUC #AN195944-01).

1. Cirurgia VML

1. Anestesiar ratos Sprague-Dawley machos com 12 semanas de idade, pesando 276-300 g em um recipiente lacrado, usando anestesia geral com isofluorano a uma taxa de 1% a 5%, antes de serem transferidos para um campo cirúrgico estéril.
   1. Posicione os roedores do lado esquerdo de forma que o pescoço fique estendido em posição neutra e o nariz encaixado no nariz anestésico, permitindo a exposição ao lado direito da face.
   2. Taxa de fluxo de isofluorano cônico da indução à taxa de fluxo de manutenção (aproximadamente 2%).
2. Aplique pomada oftálmica nos olhos dos roedores.
3. Limpe o local operatório, delimitado por uma linha entre o canto direito da boca, a base da orelha direita superiormente e o ângulo da mandíbula inferiormente, do pelo usando creme depilatório.
   1. Desinfete o local da operação várias vezes em movimentos circulares usando etanol e esfoliante betadina.
      NOTA: O drapeado estéril não é usado neste protocolo, dado o tamanho e o local de acesso. O procedimento é realizado por meio de uma técnica asséptica de acordo com as diretrizes de cuidados com os animais.
4. Crie uma incisão longitudinal de 3-4 cm de comprimento, abrangendo desde a almofada inferior direita até a orelha direita.
   1. Elevar um retalho cutâneo, permitindo a visualização do masseter direito, bem como dos ramos vestibular e mandibular do nervo facial (Figura 1A).
   2. Limpe a pele da fáscia subjacente usando separação romba e segure as bordas da pele em uma posição retraída usando pinças cirúrgicas para visualização ideal do músculo subjacente.
5. Faça uma incisão transversal de 1-2 cm de comprimento na fáscia que recobre a porção anterior do masseter. Use a separação sem corte para expandir o espaço entre a fáscia e o masseter com cuidado para manter a integridade geral da fáscia restante.
6. Usando a incisão fascial como uma janela para o masseter superficial, crie uma lesão circular no músculo medindo 5 mm de diâmetro e 5 mm de profundidade usando uma biópsia por punção descartável esterilizada. Certifique-se de que o defeito esteja centralizado entre os ramos vestibular e mandibular do nervo facial, com cuidado para evitar traumas nos nervos (Figura 1B).
7. Adicione o biomaterial à lesão do masseter circular (Figura 1C).
8. Uma vez que o agente esteja adequadamente no lugar, suture a janela fascial de investimento muscular usando uma única sutura de monofilamento 5-0 para evitar a migração.
   NOTA: Os agentes de forma sólida são colocados diretamente na ferida e o tecido pode ser perturbado para promover a saturação com sangue, enquanto os agentes líquidos são adicionados e gelificados, se necessário, ou imediatamente fechados no lugar usando a fáscia para evitar movimentos indesejados. No experimento demonstrado aqui, um criogel à base de ácido hialurônico acrilado é administrado.
9. Feche a pele usando uma técnica subcuticular simples interrompida ou em execução com monofilamento 5-0.
   1. Aplique cola de pele sobre as suturas para ajudar a prevenir a deiscência da incisão pós-operatória.
10. Deixe os ratos se recuperarem em uma gaiola com uma fonte de aquecimento externa (almofada de aquecimento embaixo da gaiola ou aquecedores de mãos estéreis na gaiola) e observe por 30 minutos no pós-operatório.
11. Diluir o antibiótico sulfametoxazol-trimetoprima (200 mg de trimetoprima e 40 mg de sulfametoxazol em 5mL) em água de beber (5 mL/200 mL de água) e administrá-lo em água de beber de roedores por 7 dias de pós-operatório. Certifique-se de que a analgesia perioperatória seja conduzida de acordo com os protocolos institucionais.
    NOTA: Neste estudo, a bupivacaína SC a 0,25% foi administrada antes da incisão cirúrgica, a buprenorfina SC 0,05 mg/kg foi administrada antes da recuperação da anestesia e a 2 mg/kg de meloxicam IP foi administrada antes da recuperação da anestesia e novamente na manhã seguinte.

2. Colheita, congelamento e análise do masseter

1. Em pontos de tempo predeterminados, sacrifique os ratos induzindo uma overdose de um agente químico (por exemplo, CO₂ ou anestésico) na câmara de indução anestésica.
2. Confirme o sacrifício do roedor realizando uma toracotomia bilateral usando uma única incisão de bisturi através da^4ª costela ventralmente para perfurar os pulmões (toracotomia bilateral).
3. Reabra a incisão cirúrgica para permitir a visualização do masseter e remova a pele que cobre o masseter para facilitar o acesso.
4. Dissecar e remover o masseter da mandíbula, começando com a separação no ângulo mandibular. Certifique-se de que a dissecção ocorra ao longo da superfície óssea para capturar toda a espessura do masseter.
   1. Dissecar anteriormente ao longo da mandíbula, cortando o ponto de fixação do tendão. Em seguida, dissecar ao longo do arco zigomático posteriormente (Figura 1D). Por fim, disseque a inserção posterior, pois há um risco aumentado de sangramento.
5. Enxágue o massagista excisado em 1x PBS à temperatura ambiente (RT) e remova a umidade excessiva enxugando completamente a amostra com uma toalha de papel.
6. Coloque o músculo em um criomoldor e mergulhe-o em um meio de incorporação de temperatura de corte ideal (OCT), com a extremidade anterior voltada para baixo e a extremidade posterior voltada para cima.
7. Adicione o isopentano a um copo de metal e resfrie-o submergindo-o em nitrogênio líquido com cuidado para evitar que o nitrogênio líquido entre nele.
   1. Quando o isopentano atingir a temperatura ideal (-140 a -149 °C) e engrossar ligeiramente, segurar o criomold contendo OCT e o masseter parcialmente submerso no isopentano até que o OCT tenha congelado. Manter o criomoldor congelado em gelo seco até ser transferido para um congelador a -80 °C.
8. Amostras de masseter congelado por criossecção com a orientação tal que o pólo anterior seja seccionado primeiro, movendo-se posteriormente através da amostra. Defina a temperatura do bloco de tecido para -20 °C e a temperatura da lâmina de criossecção para -15 °C. Para cada 200 μm, corte 4 lâminas (2 com seções de 10 μm, 2 com seções de 6 μm) antes de mover 200 μm mais, cortando 4 lâminas adicionais e repetindo em toda a amostra.
9. Use as seções de 10 μm para análise histológica (tricrômico de Masson, hematoxilina e eosina, vermelho de Picrosirius, etc.) e as seções de 6 μm para imuno-histoquímica.
   NOTA: Para histologia, seções de 6 μm também podem ser usadas.
10. Capture imagens usando microscopia de luz ou fluorescência.
11. Meça as áreas da seção transversal de ~ 200 fibras musculares do músculo masseter usando o software Image J.

3. Análise imuno-histoquímica

1. Para análise imuno-histoquímica da cadeia pesada da miosina embrionária, fixar lâminas em PFA a 4% por 1 h em RT.
2. Lave as lâminas em PBS 3 vezes em RT, deixando cada lavagem descansar por 10 min.
3. Permeabilize o tecido incubando as lâminas com 0,5% de Triton X-100 em RT por 15 min.
4. Lave as lâminas em PBS 3 vezes em RT, deixando cada lavagem descansar por 10 min.
5. Incubar com anticorpo monoclonal primário de camundongos hospedeiros (1:200) em soro de cabra normal (NGS) a 2% a 4 ° C durante a noite.
6. Lave as lâminas em PBS-Tween 3 vezes em RT, deixando cada lavagem descansar por 10 min.
7. Incubar com anticorpo secundário anti-camundongo marcado com fluoróforo do hospedeiro coelho (1:500) em 2% NGS em RT por 2 h.
8. Lave as lâminas em PBS-Tween 3 vezes em RT, deixando cada lavagem descansar por 10 min.
9. Monte as lâminas usando 3 gotas de montagem fluorescente DAPI antes de colocar uma lamínula.

Resultados

Os resultados para a avaliação do VML craniofacial e regeneração tecidual usando biomateriais incluem resultados quantitativos e qualitativos.

A Figura 2 mostra um exemplo de avaliação qualitativa usando o modelo descrito anteriormente. A observação do crescimento de fibras musculares de novo em nosso hidrogel é um resultado qualitativo positivo (Figura 2A) e sugere que um biomateria...

Discussão

Existem várias etapas críticas no protocolo em que é necessária atenção especial para alcançar um resultado ideal. A etapa 1.4 descreve a incisão inicial e a separação romba da pele da fáscia masseter superficial. A dissecção romba deve ser feita diretamente ao longo da pele com uma tesoura apontando para longe do músculo subjacente e da fáscia para evitar cortes e criar involuntariamente uma janela através da fáscia. O aspecto caudal do masseter superficial deve ser evi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
F1.652 Myosin heavy chain (embryonic) monoclonal antibody	DSHB	F1.652
Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21242
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
Integra Standard Biopsy Punches, Disposable Standard biopsy punch; 5 mm, Diameter: 0.19 in., 0.5 cm	Integra	12460411
Mounting Medium with DAPI - Aqueous, Fluoroshield	Abcam	ab104139
Rabbit Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) preadsorbed	Abcam	ab150127
Sulfamethoxazole/Trimethoprim Oral Suspension, Cherry Flavored, 473 mL	Med-Vet International	SKU: RXBAC-SUSP