생명 공학 재료 연구를 위한 Masseter 체적 근육 손실의 설치류 모델

요약

여기에서는 쥐 교근에서 체적 근육 손실(VML) 손상을 외과적으로 생성하기 위한 프로토콜을 설명하며, 새로운 하이드로겔과 같은 생체 재료를 사용하여 두개안면 근육 손상 및 그 치료 연구를 위한 재현 가능하고 접근 가능한 모델을 제공합니다.

초록

두개안면 용적 근육 손실(VML) 손상은 심각한 외상, 외과적 절제, 염증 및 선천적 또는 기타 후천적 조건의 결과로 발생할 수 있습니다. 두개안면 VML의 치료에는 외과적 기능적 근육 이식이 포함됩니다. 그러나 이러한 절차는 정상적인 기능, 감각 또는 표현을 회복할 수 없으며 더 일반적으로 이러한 상태는 치료되지 않습니다. 두개안면 VML의 동물 모델에서 골격근 재생에 대한 연구는 거의 수행되지 않았습니다. 이 원고는 두개안면 VML 손상 연구를 위한 쥐 모델과 이러한 부상 치료에서 생체 재료의 조직학적 평가를 위한 프로토콜을 설명합니다. 액체 하이드로겔 및 동결 건조 골격은 외과적 VML 생성 시 적용되며, 교근은 잔류율이 높고 합병증이 무시할 수 있는 최대 12주까지 말기 시점에 절제됩니다. Hematoxylin 및 eosin(HE), Masson의 Trichrome 및 면역조직화학 분석은 골격근 재생, 생체 적합성 및 면역 조절의 매개변수를 평가하는 데 사용됩니다. 히알루론산 기반 하이드로겔에 대한 연구를 시연하는 동안, 이 모델은 VML 부상에서 물질의 후속 반복을 평가하기 위한 수단을 제공합니다.

서문

심각한 외상, 외과적 절제, 염증 및 기타 후천적 상태는 내인성 골격근 복구 메커니즘을 압도하는 정도의 조직 손실을 초래할 수 있습니다. 1차 재생 과정을 촉진하는 상주 세포 및 구조의 손실은 병리학적 리모델링 및 조직 섬유화를 초래할 수 있으며, 이로 인해 장기적으로 기능과 감각의 결핍이 발생할 수 있으며 이를 용적 근육 손실(VML)이라고 합니다^1,2,3. VML 손상에 대한 염증 반응은 대식세포, 사이토카인 및 근육 세포를 포함하는 잘 문서화되고 복잡한 메커니즘을 포함하며, 이는 재생 의학에서 많은 이론적 목표를 제시합니다⁴. 많은 시험관 내 연구가 사지 VML 치료의 동물 모델에서 이러한 표적을 활용했지만, 두개안면 VML ^5,6,7의 동물 모델에서 골격근 재생에 대한 연구는 부족합니다.

두개안면 조직 손실은 앞서 설명한 상태로 인해 발생할 수 있으며, 두개안면 조직 결핍은 구순구개열과 같은 선천적 상태에서도 발생할 수 있으며, 이는 경우에 따라 근육 조직의 진정한 체적 결핍을 수반합니다 ^8,9. 두개안면 부위의 근육은 미적 외모뿐만 아니라 기능에 중요하기 때문에 VML의 장기적인 영향은 상당한 심리적 고통을 초래할 수 있습니다. 두개안면 골격근의 여러 측면은 유전자 발현, 배아 기원, 위성 세포 표현형, 위성 세포 수량, 섬유 구성 및 구조 10,11,12,13의 변이를 포함하여 사지에서 발견되는 소마이트 유래 골격근과 다릅니다. 이러한 변화는 소마이트 유래 근육과 다르게 두개안면근에 영향을 미치는 VML 손상을 초래할 수 있습니다^14,15. 현재까지 사지 VML의 동물 모델에서 재생을 증가시키는 것으로 나타난 조직공학적 접근법은 두개안면 VML 동물 모델과 동등하게 변환되지 않았다¹⁶. 이는 동물 두개안면 VML 모델에 대한 생체 내 접근 방식을 최적화해야 할 필요성을 강조합니다.

두개안면 VML에 대한 여러 생체 내 연구가 수행되었지만, 연구는 소규모이며 동물 모델에서 강력한 두개안면 근육 결함을 생성하는 것은 어려운 일입니다 ^8,13. Kim 등은 마우스 교근 VML 모델의 개발을 보고했습니다. 그러나 이 연구는 손상 후 28일까지만 조직학을 평가했으며, 시점¹⁷ 간의 조직학적 결과의 차이를 감지할 수 있는 능력이 불분명했다. Rodriguez 등은 양 두개안면 VML 모델의 개발을 보고했습니다. 그러나 그들은 실험군 내에서 높은 변동성을 보고했는데, 이는 초기 수술 부상의 중증도에 이질성이 있음을 시사한다¹⁶. 여기에서는 랫드 교근 VML 모델의 프로토콜을 보고하고 조직 공학 접근 방식을 평가하는 데 유용성을 입증합니다.

프로토콜

이 연구는 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 가이드에 설명된 권장 사항 준수를 포함하여 모든 해당 규정에 따라 수행되었습니다. UCSF 기관 동물 관리 및 사용 프로그램은 모든 동물 절차 및 수술 후 관리를 승인했습니다(IACUC 프로토콜 #AN195944-01).

1. VML 수술

1. 생후 12주령에 체중이 276-300g인 수컷 Sprague-Dawley 쥐를 무균 수술 분야로 옮기기 전에 1%-5%의 비율로 이소플루오란 전신 마취를 사용하여 밀봉된 용기에 마취합니다.
   1. 설치류를 왼쪽에 위치시켜 목이 중립 위치로 확장되고 코가 마취제 노즈콘에 끼워져 얼굴의 오른쪽에 노출되도록 합니다.
   2. 인덕션에서 유지 유속까지 테이퍼 이소플루오란 유속(약 2%).
2. 설치류의 눈에 안과 연고를 바르십시오.
3. 제모 크림을 사용하여 입의 오른쪽 모서리, 오른쪽 귀 아래쪽의 아래쪽 하악 각도 사이에 선으로 둘러싸인 수술 부위를 청소합니다.
   1. 에탄올과 베타딘 스크럽을 사용하여 원을 그리며 수술 부위를 여러 번 소독합니다.
      참고: 이 프로토콜에서는 액세스 크기와 위치를 고려하여 멸균 드레이핑이 사용되지 않습니다. 이 절차는 동물 관리 지침에 따라 무균 기술을 사용하여 수행됩니다.
4. 아래쪽 오른쪽 수염 패드에서 오른쪽 귀까지 3-4cm 길이의 세로 절개를 만듭니다.
   1. 피부 피판을 들어 올려 오른쪽 교근과 안면 신경의 협측 및 하악 가지를 시각화할 수 있습니다(그림 1A).
   2. 무딘 분리를 사용하여 밑에 있는 근막에서 피부를 제거하고 아래 근육을 최적으로 시각화하기 위해 수술용 클램프를 사용하여 피부 가장자리를 수축된 위치로 유지합니다.
5. 교근의 앞쪽 부분 위에 있는 근막에서 1-2cm 길이의 가로 절개를 만듭니다. 무딘 분리를 사용하여 근막과 교근 사이의 공간을 확장하고 나머지 근막의 전반적인 무결성을 유지하기 위해 주의하십시오.
6. 근막 절개를 표재성 교근을 보는 창으로 사용하여 멸균된 일회용 펀치 생검을 사용하여 가로 5mm, 깊이 5mm의 근육에 원형 손상을 만듭니다. 결손이 안면 신경의 협측과 하악 가지 사이의 중앙에 있는지 확인하고 신경에 외상이 발생하지 않도록 주의합니다(그림 1B).
7. 원형 교근 손상에 생체 물질을 추가합니다(그림 1C).
8. 제제가 적절하게 자리를 잡으면 이동을 피하기 위해 단일 5-0 모노필라멘트 봉합사를 사용하여 근육 투자 근막 창을 봉합합니다.
   참고: 고형제는 상처에 직접 삽입하고 조직을 교란시켜 혈액으로 포화를 촉진할 수 있는 반면, 액체 제제는 첨가하여 필요한 경우 겔화시키거나 원치 않는 움직임을 피하기 위해 근막을 사용하여 즉시 제자리에서 닫을 수 있습니다. 여기에서 입증된 실험에서는 아크릴화 히알루론산 기반 cryogel을 투여합니다.
9. 5-0 모노필라멘트를 사용하여 간단한 중단 또는 실행 피하 기술을 사용하여 피부를 닫습니다.
   1. 수술 후 절개 박리를 방지하기 위해 봉합사 위에 피부 접착제를 바르십시오.
10. 쥐가 외부 열원(케이지 아래의 가열 패드 또는 케이지 내의 멸균 핸드 워머)이 있는 케이지에서 회복하도록 하고 수술 후 30분 동안 관찰합니다.
11. 트리메토프림-설파메톡사졸 항생제(트리메토프림 200mg, 설파메톡사졸 40mg)를 음용수(5mL/200mL)에 희석하여 수술 후 7일간 설치류 음용수에 투여한다. 수술 전후 진통제가 기관 프로토콜에 따라 수행되는지 확인합니다.
    참고: 본 연구에서는 외과적 절개 전에 0.25% SC 부피바카인을, 마취 회복 전에 0.05mg/kg SC 부프레노르핀을, 마취 회복 전과 다음날 아침에 다시 2mg/kg IP 멜록시캄을 투여했다.

2. Masseter 수확, 동결 및 분석

1. 미리 결정된 시점에서, 마취제 유도 챔버에서 화학 작용제(예: CO₂ 또는 마취제)의 과다 투여를 유도하여 쥐를 희생시킵니다.
2. 폐를 뚫기 위해 4^번째 갈비뼈를 복부로 한 번 메스로 절개하여 폐를 뚫는 양측 개흉술을 시행하여 설치류 희생을 확인합니다(양측 개흉술).
3. 교근을 시각화할 수 있도록 수술 절개 부위를 다시 열고 쉽게 접근할 수 있도록 교근 위의 피부를 제거합니다.
4. 하악 각도에서 분리하는 것부터 시작하여 하악골에서 교근을 절개하고 제거합니다. 교근 두께 전체를 캡처하기 위해 뼈 표면을 따라 박리가 발생하는지 확인합니다.
   1. 하악골을 따라 전방으로 절개하여 힘줄의 부착 지점을 절단합니다. 그런 다음 접합궁을 따라 후방으로 해부합니다(그림 1D). 마지막으로, 출혈의 위험이 증가하므로 후방 부착물을 절개하십시오.
5. 절제된 교근을 실온(RT)에서 1x PBS로 헹구고 종이 타월로 검체를 철저히 닦아 과도한 수분을 제거합니다.
6. 근육을 크라이오몰드에 넣고 앞쪽 끝이 아래를 향하고 뒤쪽 끝이 위쪽을 향하도록 하여 최적 절단 온도(OCT) 임베딩 매체에 담급니다.
7. 금속 컵에 이소펜탄을 넣고 액체 질소에 담그면 액체 질소가 들어가지 않도록 주의하여 냉각시킵니다.
   1. 이소펜탄이 최적 온도(-140 - -149 °C)에 도달하고 약간 두꺼워지면 OCT가 포함된 극저온 몰드와 교근을 OCT가 얼어붙을 때까지 이소펜탄에 부분적으로 담근 상태로 유지합니다. 얼어붙은 극저온 몰드를 -80 °C의 냉동고로 옮길 때까지 드라이아이스에 보관하십시오.
8. 극저온 절제는 전극이 먼저 절편화되고 샘플을 통해 후방으로 이동하는 방향으로 동결 교근 샘플을 동결합니다. 조직 차단 온도를 -20°C로 설정하고 극저온 절제 블레이드 온도를 -15°C로 설정합니다. 200μm마다 200μm를 더 이동하기 전에 4개의 슬라이드(10μm 절편이 있는 2개, 6μm 절편이 있는 2개)를 절단하고 4개의 슬라이드를 추가로 절단하고 샘플 전체에서 반복합니다.
9. 조직학 분석에는 10μm 절편(Masson's Trichrome, Hematoxylin 및 Eosin, Picrosirius Red 등)을 사용하고 면역조직화학에는 6μm 절편을 사용합니다.
   참고: 조직학의 경우 6μm 절편을 사용할 수도 있습니다.
10. 광 또는 형광 현미경을 사용하여 이미지를 캡처합니다.
11. Image J 소프트웨어를 사용하여 교근의 ~200개 근육 섬유의 단면적을 측정합니다.

3. 면역조직화학 분석

1. 배아 미오신 중쇄의 면역조직화학적 분석을 위해 RT에서 1시간 동안 4% PFA로 슬라이드를 고정합니다.
2. RT에서 PBS의 슬라이드를 3회 세척하고 각 세척이 10분 동안 그대로 두도록 합니다.
3. 15분 동안 RT에서 0.5% Triton X-100으로 슬라이드를 배양하여 조직을 투과시킵니다.
4. RT에서 PBS의 슬라이드를 3회 세척하고 각 세척이 10분 동안 그대로 두도록 합니다.
5. 숙주 마우스(1:200)의 1차 단클론 항체를 2% 정상 염소 혈청(NGS)에 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
6. PBS-Tween의 슬라이드를 RT에서 3회 세척하고 각 세척을 10분 동안 그대로 둡니다.
7. 토끼 숙주(1:500)의 형광단 표지 항마우스 2차 항체를 RT에서 2시간 동안 RT에서 2% NGS로 배양합니다.
8. PBS-Tween의 슬라이드를 RT에서 3회 세척하고 각 세척을 10분 동안 그대로 둡니다.
9. 커버슬립을 놓기 전에 DAPI 형광 마운트 3방울을 사용하여 슬라이드를 장착합니다.

결과

생체 재료를 사용한 두개안면 VML 및 조직 재생 평가에 대한 결과에는 양적 및 질적 결과가 모두 포함됩니다.

그림 2 는 앞서 설명한 모델을 사용한 정성적 평가의 예를 보여줍니다. 당사의 하이드로겔 내에서 새로운 근육 섬유 성장에 대한 관찰은 질적으로 긍정적인 결과이며(그림 2A) 생체 재료가 충...

토론

프로토콜에는 최적의 결과를 얻기 위해 특별한 주의가 필요한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 1.4단계는 표재성 교근막에서 피부의 초기 절개 및 둔탁한 분리를 설명합니다. 둔기 절제는 피부를 따라 직접 절단해야 하며, 가위로 밑에 있는 근육과 근막에서 멀어지는 곳을 가리켜 흠집이 나거나 의도치 않게 근막을 통해 창문이 생기는 것을 방지해야 합니다. 표재성 교근...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
F1.652 Myosin heavy chain (embryonic) monoclonal antibody	DSHB	F1.652
Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21242
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
Integra Standard Biopsy Punches, Disposable Standard biopsy punch; 5 mm, Diameter: 0.19 in., 0.5 cm	Integra	12460411
Mounting Medium with DAPI - Aqueous, Fluoroshield	Abcam	ab104139
Rabbit Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) preadsorbed	Abcam	ab150127
Sulfamethoxazole/Trimethoprim Oral Suspension, Cherry Flavored, 473 mL	Med-Vet International	SKU: RXBAC-SUSP