Modelo de roedores de pérdida muscular volumétrica de masetero para el estudio de materiales de bioingeniería

Resumen

En este trabajo describimos un protocolo para la creación quirúrgica de una lesión por pérdida muscular volumétrica (VML) en el masetero de ratas, proporcionando un modelo reproducible y accesible para el estudio de las lesiones musculares craneofaciales y su tratamiento utilizando biomateriales como el novedoso hidrogel.

Resumen

Las lesiones por pérdida de músculo volumétrico craneofacial (VML, por sus siglas en inglés) pueden ocurrir como resultado de un traumatismo grave, escisión quirúrgica, inflamación y afecciones congénitas u otras condiciones adquiridas. El tratamiento de la LMV craneofacial implica la transferencia quirúrgica y funcional de músculo. Sin embargo, estos procedimientos no pueden restaurar la función, la sensibilidad o la expresión normales y, lo que es más común, estas afecciones no se tratan. Se han realizado muy pocas investigaciones sobre la regeneración del músculo esquelético en modelos animales de VML craneofacial. Este manuscrito describe un modelo de rata para el estudio de la lesión craneofacial de la VML y un protocolo para la evaluación histológica de biomateriales en el tratamiento de estas lesiones. El hidrogel líquido y los andamios liofilizados se aplican en el momento de la creación quirúrgica de la VML, y los maseteros se extirpan en puntos terminales de hasta 12 semanas con altas tasas de retención y complicaciones insignificantes. La hematoxilina y la eosina (HE), el tricrómico de Masson y el análisis inmunohistoquímico se utilizan para evaluar los parámetros de regeneración del músculo esquelético, así como la biocompatibilidad y la inmunomodulación. Si bien demostramos el estudio de un hidrogel a base de ácido hialurónico, este modelo proporciona un medio para evaluar iteraciones posteriores de materiales en lesiones por VML.

Introducción

Los traumatismos graves, la escisión quirúrgica, la inflamación y otras afecciones adquiridas pueden dar lugar a un grado de pérdida de tejido que abruma los mecanismos de reparación del músculo esquelético endógeno. La pérdida de células residentes y de estructuras que promueven el proceso regenerativo primario puede dar lugar a una remodelación patológica y fibrosis tisular, lo que resulta en déficits a largo plazo de la función y la sensibilidad, y se conoce como pérdida muscular volumétrica (VML)^1,2,3. La respuesta inflamatoria a las lesiones por VML implica un mecanismo complejo y bien documentado que involucra macrófagos, citocinas y células miogénicas que presenta muchos objetivos teóricos en medicina regenerativa⁴. Si bien muchos estudios in vitro han utilizado estos objetivos en modelos animales de tratamiento de VML en extremidades, existe una falta de investigación sobre la regeneración del músculo esquelético en modelos animales de VML craneofacial ^5,6,7.

La pérdida de tejido craneofacial puede ser el resultado de condiciones como las descritas anteriormente, y la deficiencia de tejido craneofacial también puede ocurrir en condiciones congénitas como la hendidura, que en algunos casos implica una verdadera deficiencia volumétrica de tejido muscular ^8,9. Debido a que los músculos de la región craneofacial son importantes para la función y la apariencia estética, los efectos a largo plazo de la VML pueden tener una aflicción psicológica significativa. Varios aspectos del músculo esquelético craneofacial son diferentes del músculo esquelético derivado de los somitas que se encuentra en las extremidades, incluidas las variaciones en la expresión génica, el origen embrionario, el fenotipo de las células satélite, la cantidad de células satélite, la composición de las fibras y la arquitectura 10,11,12,13. Estas variaciones pueden dar lugar a lesiones de la LMV que afectan al músculo craneofacial de forma diferente al músculo derivado del somita^14,15. Hasta la fecha, los enfoques de ingeniería de tejidos que han demostrado aumentar la regeneración en modelos animales de VML de extremidades no se han traducido de manera equivalente a los modelos animales de VML craneofacial¹⁶. Esto subraya la necesidad de optimizar los enfoques in vivo para los modelos VML craneofaciales de animales.

Si bien se han realizado varios estudios in vivo de VML craneofacial, los estudios son pequeños y la creación de un defecto muscular craneofacial robusto en modelos animales es un desafío ^8,13. Kim et al. informaron sobre el desarrollo de un modelo VML de masetero de ratón. Sin embargo, este estudio solo evaluó la histología hasta 28 días después de la lesión y tuvo un poder estadístico incierto para detectar diferencias en los resultados histológicos entre puntos temporales¹⁷. Rodríguez et al. reportaron el desarrollo de un modelo VML craneofacial de ovejas. Sin embargo, reportaron una alta variabilidad dentro de los grupos experimentales, sugiriendo heterogeneidad en la gravedad de la lesión quirúrgica inicial¹⁶. Aquí, reportamos el protocolo de nuestro modelo VML de masetero de ratas y demostramos su utilidad en la evaluación de enfoques de ingeniería de tejidos.

Protocolo

Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con todas las regulaciones aplicables, incluido el cumplimiento de las recomendaciones descritas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. El Programa Institucional de Cuidado y Uso de Animales de UCSF aprobó todos los procedimientos y cuidados postoperatorios con animales (protocolo #AN195944-01 de IACUC).

1. Cirugía VML

1. Anestesiar ratas macho Sprague-Dawley a las 12 semanas de edad con un peso de 276-300 g en un recipiente sellado con anestesia general de isofluorano a una tasa de 1%-5% antes de ser transferidas a un campo quirúrgico estéril.
   1. Coloque a los roedores sobre su lado izquierdo de manera que el cuello se extienda en una posición neutral y la nariz se ajuste al cono nasal anestésico, permitiendo la exposición al lado derecho de la cara.
   2. Caudal de isofluorano cónico desde la inducción hasta el caudal de mantenimiento (aproximadamente 2%).
2. Aplique ungüento oftálmico en los ojos de los roedores.
3. Limpie el sitio operatorio, bordeado por una línea entre la esquina derecha de la boca, la base de la oreja derecha superiormente y el ángulo de la mandíbula inferior, de pelo con crema depilatoria.
   1. Desinfecte el sitio operatorio varias veces con movimientos circulares utilizando etanol y exfoliante de betadine.
      NOTA: El paño estéril no se utiliza en este protocolo, dado el tamaño y la ubicación del acceso. El procedimiento se lleva a cabo utilizando una técnica aséptica de acuerdo con las pautas de cuidado animal.
4. Cree una incisión longitudinal de 3-4 cm de longitud que abarque desde la almohadilla inferior del bigote derecho hasta la oreja derecha.
   1. Elevar un colgajo de piel, permitiendo la visualización del masetero derecho, así como de las ramas bucal y mandibular del nervio facial (Figura 1A).
   2. Limpie la piel de la fascia subyacente mediante una separación roma y mantenga los bordes de la piel en una posición retraída mediante pinzas quirúrgicas para una visualización óptima del músculo subyacente.
5. Realice una incisión transversal de 1-2 cm de longitud en la fascia que recubre la porción anterior del masetero. Use una separación roma para expandir el espacio entre la fascia y el masetero con cuidado para mantener la integridad general de la fascia restante.
6. Utilizando la incisión fascial como ventana al masetero superficial, cree una lesión circular en el músculo de 5 mm de ancho y 5 mm de profundidad utilizando una biopsia con punción desechable esterilizada. Asegúrese de que el defecto esté centrado entre las ramas bucal y mandibular del nervio facial, con cuidado para evitar traumatismos en los nervios (Figura 1B).
7. Agregue el biomaterial a la lesión circular del masetero (Figura 1C).
8. Una vez que el agente esté adecuadamente colocado, sutura la ventana fascial que invierte el músculo con una sola sutura de monofilamento 5-0 para evitar la migración.
   NOTA: Los agentes de forma sólida se colocan directamente en la herida, y el tejido se puede perturbar para promover la saturación con sangre, mientras que los agentes líquidos se agregan y se dejan gelificar si es necesario o se cierran inmediatamente en su lugar usando fascia para evitar movimientos no deseados. En el experimento que se muestra aquí, se administra un criogue a base de ácido hialurónico acrilado.
9. Cierre la piel con una técnica subcuticular simple, interrumpida o en ejecución con monofilamento 5-0.
   1. Aplique pegamento para la piel sobre las suturas para ayudar a prevenir la dehiscencia de la incisión postoperatoria.
10. Permita que las ratas se recuperen en una jaula con una fuente de calor externa (almohadilla térmica debajo de la jaula o calentadores de manos estériles en la jaula) y observe durante 30 minutos después de la operación.
11. Diluir el antibiótico trimetoprim-sulfametoxazol (200 mg de trimetoprima y 40 mg de sulfametoxazol en 5 ml) en agua de bebida (5 mL/200 ml de agua) y administrarlo en agua de bebida de roedores durante 7 días después de la operación. Asegurar que la analgesia perioperatoria se realice de acuerdo con los protocolos institucionales.
    NOTA: En este estudio, se administró bupivacaína SC al 0,25% antes de la incisión quirúrgica, se administraron 0,05 mg/kg de buprenorfina SC antes de la recuperación de la anestesia y se administraron 2 mg/kg de meloxicam IP antes de la recuperación de la anestesia y nuevamente a la mañana siguiente.

2. Cosecha, congelación y análisis con masetero

1. En puntos de tiempo predeterminados, sacrifique las ratas induciendo una sobredosis de un agente químico (por ejemplo, CO₂ o anestésico) en la cámara de inducción anestésica.
2. Confirme el sacrificio de roedores mediante la realización de una toracotomía bilateral con una sola incisión de bisturí a través de la^4ª costilla ventral para perforar los pulmones (toracotomía bilateral).
3. Vuelva a abrir la incisión quirúrgica para permitir la visualización del masetero y retire la piel que recubre el masetero para facilitar el acceso.
4. Diseccionar y retirar el masetero de la mandíbula, comenzando con la separación en el ángulo mandibular. Asegúrese de que la disección se realice a lo largo de la superficie ósea para capturar la totalidad del grosor del masetero.
   1. Diseccionar anteriormente a lo largo de la mandíbula, cortando el punto de unión del tendón. A continuación, diseccionar a lo largo del arco cigomático posteriormente (Figura 1D). Por último, diseccione la inserción posterior, ya que existe un mayor riesgo de sangrado.
5. Enjuague el masetero extirpado en 1x PBS a temperatura ambiente (RT) y elimine el exceso de humedad secando bien la muestra con una toalla de papel.
6. Coloque el músculo en un crimolde y sumérjalo en un medio de inclusión a temperatura óptima de corte (OCT), con el extremo anterior hacia abajo y el extremo posterior hacia arriba.
7. Agregue isopentano a una taza de metal y enfríela sumergiéndola en nitrógeno líquido con cuidado para evitar que ingrese nitrógeno líquido.
   1. Una vez que el isopentano haya alcanzado la temperatura óptima (-140 a -149 °C) y se haya espesado ligeramente, mantenga el criomolde que contiene OCT y el masetero parcialmente sumergidos en el isopentano hasta que el OCT se haya congelado. Mantenga el criommould congelado en hielo seco hasta que se transfiera a un congelador a -80 °C.
8. Criosección de muestras de masetero congelado con una orientación tal que el polo anterior se secciona primero, moviéndose posteriormente a través de la muestra. Ajuste la temperatura del bloque de tejido a -20 °C y la temperatura de la cuchilla de criosección a -15 °C. Por cada 200 μm, corte 4 portaobjetos (2 con secciones de 10 μm, 2 con secciones de 6 μm) antes de avanzar 200 μm más, corte 4 portaobjetos adicionales y repita a lo largo de la muestra.
9. Utilice las secciones de 10 μm para el análisis histológico (tricrómico de Masson, hematoxilina y eosina, Picrosirius Red, etc.) y las secciones de 6 μm para inmunohistoquímica.
   NOTA: Para la histología, también se pueden utilizar secciones de 6 μm.
10. Captura de imágenes mediante microscopía óptica o de fluorescencia.
11. Mida las áreas de la sección transversal de ~ 200 fibras musculares del músculo masetero utilizando el software Image J.

3. Análisis inmunohistoquímico

1. Para el análisis inmunohistoquímico de la cadena pesada de miosina embrionaria, fije los portaobjetos en PFA al 4% durante 1 h en RT.
2. Lave los portaobjetos en PBS 3 veces en RT, dejando reposar cada lavado durante 10 minutos.
3. Permeabilizar el tejido incubando los portaobjetos con Triton X-100 al 0,5% a RT durante 15 min.
4. Lave los portaobjetos en PBS 3 veces en RT, dejando reposar cada lavado durante 10 minutos.
5. Incubar con anticuerpo monoclonal primario de ratones huéspedes (1:200) en suero de cabra normal (NGS) al 2% a 4 °C durante la noche.
6. Lave los portaobjetos en PBS-Tween 3 veces en RT, dejando reposar cada lavado durante 10 minutos.
7. Incubar con anticuerpo secundario anti-ratón marcado con fluoróforos del huésped conejo (1:500) en NGS al 2% en RT durante 2 h.
8. Lave los portaobjetos en PBS-Tween 3 veces en RT, dejando reposar cada lavado durante 10 minutos.
9. Monte los portaobjetos con 3 gotas de soporte fluorescente DAPI antes de colocar un cubreobjetos.

Resultados

Los resultados de la evaluación de la LMV craneofacial y la regeneración tisular mediante biomateriales incluyen resultados cuantitativos y cualitativos.

La Figura 2 muestra un ejemplo de evaluación cualitativa utilizando el modelo descrito anteriormente. La observación del crecimiento de novo de la fibra muscular dentro de nuestro hidrogel es un resultado cualitativo positivo (Figura 2A)...

Discusión

Hay varios pasos críticos en el protocolo en los que se necesita especial atención para lograr un resultado óptimo. El paso 1.4 describe la incisión inicial y la separación roma de la piel de la fascia masetera superficial. La disección roma debe realizarse directamente a lo largo de la piel con tijeras apuntando en dirección opuesta al músculo subyacente y la fascia para evitar cortes y crear involuntariamente una ventana a través de la fascia. Debe evitarse el aspecto caudal d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
F1.652 Myosin heavy chain (embryonic) monoclonal antibody	DSHB	F1.652
Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21242
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
Integra Standard Biopsy Punches, Disposable Standard biopsy punch; 5 mm, Diameter: 0.19 in., 0.5 cm	Integra	12460411
Mounting Medium with DAPI - Aqueous, Fluoroshield	Abcam	ab104139
Rabbit Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) preadsorbed	Abcam	ab150127
Sulfamethoxazole/Trimethoprim Oral Suspension, Cherry Flavored, 473 mL	Med-Vet International	SKU: RXBAC-SUSP