Modello di roditore della perdita muscolare volumetrica del massetere per lo studio dei materiali di bioingegneria

Riepilogo

Qui, descriviamo un protocollo per la creazione chirurgica di una lesione da perdita muscolare volumetrica (VML) nel massetere di ratto, fornendo un modello riproducibile e accessibile per lo studio delle lesioni muscolari craniofacciali e il loro trattamento utilizzando biomateriali come il nuovo idrogel.

Abstract

Le lesioni da perdita muscolare volumetrica craniofacciale (VML) possono verificarsi a seguito di gravi traumi, escissione chirurgica, infiammazione e condizioni congenite o altre condizioni acquisite. Il trattamento della VML craniofacciale comporta il trasferimento muscolare chirurgico e funzionale. Tuttavia, queste procedure non sono in grado di ripristinare la normale funzione, sensazione o espressione e, più comunemente, queste condizioni non vengono trattate. Pochissime ricerche sono state condotte sulla rigenerazione del muscolo scheletrico in modelli animali di VML craniofacciale. Questo manoscritto descrive un modello di ratto per lo studio della lesione VML craniofacciale e un protocollo per la valutazione istologica dei biomateriali nel trattamento di queste lesioni. L'idrogel liquido e gli scaffold liofilizzati vengono applicati al momento della creazione chirurgica del VML e i masseteri vengono asportati in punti temporali terminali fino a 12 settimane con alti tassi di ritenzione e complicanze trascurabili. L'ematossilina e l'eosina (HE), il tricromo di Masson e l'analisi immunoistochimica vengono utilizzate per valutare i parametri di rigenerazione del muscolo scheletrico, nonché la biocompatibilità e l'immunomodulazione. Mentre dimostriamo lo studio di un idrogel a base di acido ialuronico, questo modello fornisce un mezzo per valutare le successive iterazioni dei materiali nelle lesioni VML.

Introduzione

Traumi gravi, escissione chirurgica, infiammazione e altre condizioni acquisite possono provocare un grado di perdita di tessuto che travolge i meccanismi di riparazione del muscolo scheletrico endogeno. La perdita di cellule e strutture residenti che promuovono il processo rigenerativo primario può provocare rimodellamento patologico e fibrosi tissutale, con conseguenti deficit a lungo termine di funzione e sensibilità e viene definita perdita muscolare volumetrica (VML)^1,2,3. La risposta infiammatoria alle lesioni da VML coinvolge un meccanismo complesso e ben documentato che coinvolge macrofagi, citochine e cellule miogeniche che presenta molti bersagli teorici nella medicina rigenerativa⁴. Mentre molti studi in vitro hanno utilizzato questi bersagli in modelli animali di trattamento VML alle estremità, c'è una mancanza di ricerca sulla rigenerazione del muscolo scheletrico in modelli animali di VML craniofacciale ^5,6,7.

La perdita di tessuto craniofacciale può derivare da condizioni come descritto in precedenza e un deficit di tessuto craniofacciale può verificarsi anche in condizioni congenite come la schisi, che in alcuni casi comporta una vera e propria carenza volumetrica di tessuto muscolare ^8,9. Poiché i muscoli della regione craniofacciale sono importanti per la funzione e l'aspetto estetico, gli effetti a lungo termine della VML possono avere un'afflizione psicologica significativa. Diversi aspetti del muscolo scheletrico craniofacciale sono diversi dal muscolo scheletrico derivato dal somite che si trova nelle estremità, comprese le variazioni nell'espressione genica, l'origine embrionale, il fenotipo delle cellule satelliti, la quantità di cellule satelliti, la composizione delle fibre e l'architettura 10,11,12,13. Queste variazioni possono causare lesioni VML che colpiscono il muscolo craniofacciale in modo diverso rispetto al muscolo derivato da somite^14,15. Ad oggi, gli approcci di ingegneria tissutale che hanno dimostrato di aumentare la rigenerazione nei modelli animali di VML degli arti non si sono tradotti in modo equivalente ai modelli animali di VML craniofacciale¹⁶. Ciò sottolinea la necessità di ottimizzare gli approcci in vivo ai modelli di VML craniofacciale animale.

Sebbene siano stati condotti diversi studi in vivo sulla VML craniofacciale, gli studi sono piccoli e la creazione di un robusto difetto del muscolo craniofacciale in modelli animali è impegnativa ^8,13. Kim et al. hanno riportato lo sviluppo di un modello VML di massetere di topo. Tuttavia, questo studio ha valutato l'istologia solo fino a 28 giorni dopo l'infortunio e ha avuto un potere poco chiaro per rilevare le differenze negli esiti istologici tra i punti temporali¹⁷. Rodriguez et al. hanno riportato lo sviluppo di un modello VML craniofacciale di pecora. Tuttavia, hanno riportato un'elevata variabilità all'interno dei gruppi sperimentali, suggerendo un'eterogeneità nella gravità della lesione chirurgica iniziale¹⁶. Qui, riportiamo il protocollo del nostro modello VML di massetere di ratto e dimostriamo la sua utilità nella valutazione di approcci di ingegneria tissutale.

Protocollo

Questo studio è stato condotto in conformità con tutte le normative applicabili, inclusa l'aderenza alle raccomandazioni delineate nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Il programma istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'UCSF ha approvato tutte le procedure per animali e le cure postoperatorie (protocollo IACUC #AN195944-01).

1. Chirurgia VML

1. Anestetizzare ratti maschi di Sprague-Dawley a 12 settimane di età del peso di 276-300 g in un contenitore sigillato utilizzando l'anestesia generale isofluorane a una velocità dell'1%-5% prima di essere trasferiti in un campo chirurgico sterile.
   1. Posizionare i roditori sul lato sinistro in modo che il collo sia esteso in posizione neutra e il naso inserito nell'ogiva anestetica, consentendo l'esposizione al lato destro del viso.
   2. Portata di isofluorano conica dall'induzione alla portata di mantenimento (circa il 2%).
2. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi dei roditori.
3. Svuotare la sede operatoria, delimitata da una linea tra l'angolo destro della bocca, la base dell'orecchio destro superiormente e l'angolo della mandibola inferiormente, dal pelo utilizzando la crema depilatoria.
   1. Disinfettare più volte il sito operatorio con movimenti circolari utilizzando sia lo scrub all'etanolo che quello alla betadina.
      NOTA: In questo protocollo non viene utilizzato un drappeggio sterile, date le dimensioni e la posizione di accesso. La procedura viene condotta utilizzando una tecnica asettica in conformità con le linee guida per la cura degli animali.
4. Creare un'incisione longitudinale di 3-4 cm di lunghezza che si estende dal cuscinetto inferiore destro dei baffi all'orecchio destro.
   1. Sollevare un lembo cutaneo, consentendo la visualizzazione del massetere destro e dei rami buccale e mandibolare del nervo facciale (Figura 1A).
   2. Liberare la pelle dalla fascia sottostante utilizzando una separazione smussata e mantenere i bordi della pelle in una posizione retratta utilizzando pinze chirurgiche per una visualizzazione ottimale del muscolo sottostante.
5. Praticare un'incisione trasversale di 1-2 cm di lunghezza nella fascia sovrastante la porzione anteriore del massetere. Utilizzare una separazione smussata per espandere lo spazio tra la fascia e il massetere con cura per mantenere l'integrità complessiva della fascia rimanente.
6. Utilizzando l'incisione fasciale come finestra sul massetere superficiale, creare una lesione circolare nel muscolo di 5 mm di diametro e 5 mm di profondità utilizzando una biopsia sterilizzata monouso. Assicurarsi che il difetto sia centrato tra i rami vestibolare e mandibolare del nervo facciale, con cura per evitare traumi ai nervi (Figura 1B).
7. Aggiungere il biomateriale alla lesione circolare del massetere (Figura 1C).
8. Una volta che l'agente è adeguatamente posizionato, suturare la finestra fasciale che investe i muscoli utilizzando una singola sutura monofilamento 5-0 per evitare la migrazione.
   NOTA: Gli agenti in forma solida vengono inseriti direttamente nella ferita e il tessuto può essere perturbato per favorire la saturazione con il sangue, mentre gli agenti liquidi vengono aggiunti e lasciati gelificare se necessario o immediatamente chiusi in posizione utilizzando la fascia per evitare movimenti indesiderati. Nell'esperimento qui dimostrato, viene somministrato un criogel a base di acido ialuronico acrilato.
9. Chiudere la pelle utilizzando una semplice tecnica sottocuticolare interrotta o in esecuzione con monofilamento 5-0.
   1. Applicare la colla per la pelle sulle suture per aiutare a prevenire la deiscenza dell'incisione postoperatoria.
10. Lasciare che i ratti si riprendano in una gabbia con una fonte di calore esterna (termoforo sotto la gabbia o scaldamani sterili nella gabbia) e osservare per 30 minuti dopo l'intervento.
11. Diluire l'antibiotico trimetoprim-sulfametossazolo (200 mg di trimetoprim e 40 mg di sulfametossazolo in 5 ml) in acqua potabile (5 ml/200 ml di acqua) e somministrarlo in acqua potabile per roditori per 7 giorni dopo l'intervento. Assicurarsi che l'analgesia perioperatoria sia condotta secondo i protocolli istituzionali.
    NOTA: In questo studio, lo 0,25% di bupivacaina SC è stato somministrato prima dell'incisione chirurgica, 0,05 mg/kg di buprenorfina SC è stato somministrato prima del recupero dall'anestesia e 2 mg/kg di meloxicam IP è stato somministrato prima del recupero dall'anestesia e di nuovo la mattina seguente.

2. Raccolta, congelamento e analisi dei masseteri

1. In momenti predeterminati, sacrificare i ratti inducendo un sovradosaggio di un agente chimico (ad es. CO₂ o anestetico) nella camera di induzione dell'anestetico.
2. Confermare il sacrificio del roditore eseguendo una toracotomia bilaterale utilizzando una singola incisione con bisturi attraverso la 4a^costola ventralmente per perforare i polmoni (toracotomia bilaterale).
3. Riaprire l'incisione chirurgica per consentire la visualizzazione del massetere e rimuovere la pelle sovrastante il massetere per facilitarne l'accesso.
4. Sezionare e rimuovere il massetere dalla mandibola, iniziando con la separazione all'angolo mandibolare. Assicurarsi che la dissezione avvenga lungo la superficie ossea per catturare l'intero spessore del massetere.
   1. Sezionare anteriormente lungo la mandibola, recidendo il punto di attacco del tendine. Quindi, sezionare posteriormente lungo l'arco zigomatico (Figura 1D). Infine, seziona l'attacco posteriore poiché c'è un aumento del rischio di sanguinamento.
5. Sciacquare il massetere asportato in 1x PBS a temperatura ambiente (RT) e rimuovere l'umidità in eccesso tamponando accuratamente il campione con un tovagliolo di carta.
6. Posizionare il muscolo in un criomold e immergerlo in un terreno di inclusione a temperatura di taglio ottimale (OCT), con l'estremità anteriore rivolta verso il basso e l'estremità posteriore rivolta verso l'alto.
7. Aggiungi l'isopentano in una tazza di metallo e raffreddalo immergendolo nell'azoto liquido con cura per evitare che l'azoto liquido vi penetri.
   1. Una volta che l'isopentano ha raggiunto la temperatura ottimale (da -140 a -149 °C) e si è leggermente addensato, tenere il criomold contenente OCT e il massetere parzialmente immersi nell'isopentano fino a quando l'OCT non si è congelato. Conservare il criomold congelato su ghiaccio secco fino a quando non viene trasferito in congelatore a -80 °C.
8. La criosezione congela i campioni di massetere con l'orientamento tale che il polo anteriore viene sezionato per primo, muovendosi posteriormente attraverso il campione. Impostare la temperatura del blocco di tessuto a -20 °C e la temperatura della lama di criosezione a -15 °C. Per ogni 200 μm, tagliare 4 vetrini (2 con sezioni da 10 μm, 2 con sezioni da 6 μm) prima di spostare ulteriormente di 200 μm, tagliando 4 vetrini aggiuntivi e ripetendo in tutto il campione.
9. Utilizzare le sezioni da 10 μm per l'analisi istologica (Tricromia di Masson, Ematossilina ed Eosina, Rosso Picrosirius, ecc.) e le sezioni da 6 μm per l'immunoistochimica.
   NOTA: Per l'istologia possono essere utilizzate anche sezioni da 6 μm.
10. Acquisisci immagini utilizzando la microscopia a luce o a fluorescenza.
11. Misura le aree della sezione trasversale di ~200 fibre muscolari del muscolo massetere utilizzando il software Image J.

3. Analisi immunoistochimica

1. Per l'analisi immunoistochimica della catena pesante della miosina embrionale, fissare i vetrini in PFA al 4% per 1 ora a RT.
2. Lavare i vetrini in PBS 3 volte a RT, lasciando riposare ogni lavaggio per 10 minuti.
3. Permeabilizzare il tessuto incubando i vetrini con Triton X-100 allo 0,5% a RT per 15 minuti.
4. Lavare i vetrini in PBS 3 volte a RT, lasciando riposare ogni lavaggio per 10 minuti.
5. Incubare con anticorpo monoclonale primario di topi ospiti (1:200) in siero di capra normale al 2% (NGS) a 4 °C per una notte.
6. Lavare i vetrini in PBS-Tween 3 volte a RT, lasciando riposare ogni lavaggio per 10 minuti.
7. Incubare con anticorpo secondario anti-topo marcato con fluoroforo dall'ospite di coniglio (1:500) in NGS al 2% a RT per 2 ore.
8. Lavare i vetrini in PBS-Tween 3 volte a RT, lasciando riposare ogni lavaggio per 10 minuti.
9. Montare i vetrini utilizzando 3 gocce di supporto fluorescente DAPI prima di posizionare un vetrino coprioggetti.

Risultati

I risultati per la valutazione della VML craniofacciale e della rigenerazione tissutale utilizzando biomateriali includono risultati sia quantitativi che qualitativi.

La Figura 2 illustra un esempio di valutazione qualitativa utilizzando il modello descritto in precedenza. L'osservazione della crescita de novo delle fibre muscolari all'interno del nostro idrogel è un risultato qualitativamente positivo (

Discussione

Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo in cui è necessaria un'attenzione particolare per ottenere un risultato ottimale. Il passaggio 1.4 descrive l'incisione iniziale e la separazione smussata della pelle dalla fascia massetere superficiale. La dissezione smussata deve essere eseguita direttamente lungo la pelle con le forbici rivolte lontano dal muscolo sottostante e dalla fascia per evitare di intaccarsi e creare involontariamente una finestra attraverso la fascia. L'aspetto...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
F1.652 Myosin heavy chain (embryonic) monoclonal antibody	DSHB	F1.652
Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21242
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
Integra Standard Biopsy Punches, Disposable Standard biopsy punch; 5 mm, Diameter: 0.19 in., 0.5 cm	Integra	12460411
Mounting Medium with DAPI - Aqueous, Fluoroshield	Abcam	ab104139
Rabbit Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) preadsorbed	Abcam	ab150127
Sulfamethoxazole/Trimethoprim Oral Suspension, Cherry Flavored, 473 mL	Med-Vet International	SKU: RXBAC-SUSP