العزل السريع للبويضات المرحلة الأولى في الزرد الخالية من الخلايا الحبيبية

Summary

يصف هذا البروتوكول إجراء معدلا لعزل بويضات المرحلة الأولى النظيفة بسرعة في الزرد الخالي من الخلايا الحبيبية ، وبالتالي توفير طريقة ملائمة للبحث الخاص بالبويضات.

Abstract

دراسة تطور البويضة لها آثار كبيرة في علم الأحياء التنموي. تم استخدام الزرد (Danio rerio) على نطاق واسع ككائن نموذجي للتحقيق في عمليات النمو المبكرة من البويضة إلى الجنين. في الزرد ، تحاط البويضات بطبقة واحدة من الخلايا الحبيبية الجسدية. ومع ذلك ، فإن فصل الخلايا الحبيبية عن البويضات يشكل تحديا ، حيث أن تحقيق البويضات النقية أمر بالغ الأهمية للتحليل الدقيق. على الرغم من اقتراح طرق مختلفة لعزل بويضات الزرد في مراحل نمو مختلفة ، إلا أن التقنيات الحالية تقصر في إزالة الخلايا الحبيبية تماما ، مما يحد من دقة تحليل الجينوم الذي يركز فقط على البويضات. في هذه الدراسة ، نجحنا في تطوير عملية سريعة وفعالة لعزل البويضات النقية في المرحلة الأولى في الزرد مع القضاء على تلوث الخلايا الحبيبية. تسهل هذه التقنية التحليل الكيميائي الحيوي والجزيئي ، لا سيما في استكشاف جوانب البنية اللاجينية والجينوم الخاصة بالبويضات. والجدير بالذكر أن الطريقة سهلة الاستخدام ، وتقلل من تلف البويضات ، وتوفر حلا عمليا للبحث والتحليل اللاحق.

Introduction

الزرد هو من بين أهم النظم النموذجية في علم الأحياء التنموي. في السنوات الأخيرة ، استخدمت العديد من الدراسات الزرد كنموذج لدراسة الأحداث البيولوجية الهامة والعمليات التنظيمية من البويضة إلى الجنين. وتشمل هذه العمليات المعقدة لتطور البويضة^{ونضجها 1} ، ووظائف جينات الأم² ، وتنظيم التحولات بين الأم والزيجوت³ ، وتحليلات omics الشاملة⁴.

تلعب الخلايا الحبيبية ، وهي الخلايا الجسدية التي تغلف وتغذي البويضة النامية داخل جريب المبيض ^5,6 ، دورا محوريا في هذه العملية التنموية. عندما تتطور الخلايا الجرثومية البدائية (PGCs) إلى oogonia ، فإنها تصبح محاطة بطبقة أحادية من الخلايا الحبيبية⁷. جنبا إلى جنب مع الخلايا thecal الخارجية ، تشكل البويضة والخلايا الحبيبية المحيطة بها جريبا ناضجا⁸. بالنظر إلى التمييز الأساسي بين الخلايا الجرثومية والخلايا الجسدية ، فإن الحصول على عينة بويضة نقية أمر حتمي ، خاصة بالنسبة للتحليلات المتعلقة بالجينوم.

داخل البنية الجرابية لسمك الزرد ، تظهر الخلايا الحبيبية عادة قطرا يبلغ بضعة ميكرونات فقط⁸ ، مما يؤكد على الترابط الحميم بين الخلايا الحبيبية والبويضات⁹. يمثل هذا الارتباط الوثيق تحديا في تحقيق الفصل الكامل بسبب الاختلاف الكبير في كل من عدد وحجم الخلايا الحبيبية مقابل البويضات (مئات الخلايا الحبيبية مقارنة بخلية بيضة واحدة)^10,11. حتى الحد الأدنى من التلوث بخلية حبيبية واحدة يمكن أن يعيق التحليلات النهائية التي تستهدف البويضات على وجه التحديد. لذلك ، بالنسبة للدراسات التي تركز على الخصائص الجينومية واللاجينية ، فإن القضاء على الخلايا الحبيبية أمر ضروري.

بالاستفادة من المعايير المورفولوجية المميزة جيدا ، يمكن تمييز البويضات في كل مرحلة بناء على القطر¹¹. يتم تصنيف عملية تكوين البويضة في الزرد إلى خمس مراحل وفقا للمورفولوجيا والنمط النووي¹¹. المرحلة الأولى من البويضات (قطرها 7-140 ميكرومتر) تشمل البويضات من بداية الانقسام الاختزالي إلى المرحلة المبكرة من الانقسام الاختزالي I. بشكل حاسم ، هذه البويضات شفافة ، مما يسمح بمراقبة النواة المركزية من خلال الضوء المرسل (الشكل 1Ai). المرحلة الثانية من البويضات (قطرها 140-340 ميكرومتر) تصبح تدريجيا رغوية وشفافة. مع تضخم البصيلات وانتشار الحويصلات القشرية ، يصبح من الصعب تمييز الحويصلات الجرثومية في المركز¹² (الشكل 1Aii). تتراكم البويضات في المرحلة الثالثة (قطرها 340-690 ميكرومتر) تدريجيا فيتلوجينين ، وتصبح البصيلات الطازجة معتمة بشكل متزايد (الشكل 1Aiii). يستمر الانقسام الاختزالي في المرحلة الرابعة من البويضات (قطرها 690-730 ميكرومتر) حيث تدخل الكروموسومات منتصف الانقسام الميوزي الثاني ، حيث تتجمد (الشكل 1Aiv). نضجت بويضات المرحلة الخامسة (قطرها 730-750 ميكرومتر) وجاهزة للإباضة ^7,11 (الشكل 1Av).

بناء على الخصائص الفريدة لكل مرحلة من المراحل المذكورة أعلاه ، تم اقتراح طريقة لعزل البويضات من المراحل الأولى إلى الثالثة عن طريق هضم مبيض الزرد باستخدام محلول هضمي يحتوي على كولاجيناز I وكولاجيناز II وهيالورونيداز ، يليه الترشيح من خلال مصفاة خلية محددة الحجم¹³. ومع ذلك ، في حين أن هذه الطريقة تسمح بالحصول على البويضات في مراحل النمو المختلفة ، إلا أنها تفشل في فصل البويضات والخلايا الحبيبية تماما. اقترح باحثون آخرون أيضا طرقا لفصل الخلايا الحبيبية عن البويضات. ومع ذلك ، تعتمد هذه الطرق في المقام الأول على الأساليب الميكانيكية ، والتي يمكن أن تسبب تلف البويضة ، وتستغرق وقتا طويلا ، وهي غير كافية للحصول على عدد كبير من البويضات للتحليل^14،15.

نظرا لقيود الأساليب الحالية ومتطلبات البحث المحددة ، تهدف هذه الدراسة إلى وضع إجراء لفصل البويضات والخلايا الحبيبية تماما والحصول على عدد كاف من بويضات المرحلة الأولى النظيفة للتحليل. بالتوسع في الطريقة^{المشار إليها 13} ، نستخدم عازلا محسنا للهضم (انظر جدول المواد) ألطف ويسهل تشتت البويضات وتفكك الخلايا الحبيبية. بعد ذلك ، يتم تمرير البويضات من خلال مصفاة الخلية ، تليها الغسيل والمزيد من الاختيار المجهري ، مما يتيح الحصول على عدد كبير من البويضات النظيفة في المرحلة الأولى.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم التعامل مع جميع أسماك الزرد باتباع إرشادات صارمة لرعاية حددتها هيئات رعاية الوطنية و / أو المحلية ذات الصلة. حصلت صيانة الأسماك ومناولتها على موافقة كل من السلطات المحلية ولجنة أخلاقيات في مستشفى غرب الصين بجامعة سيتشوان (الموافقة رقم 20220422003). تحتوي مبيض الزرد على خليط من البويضات متعددة المراحل ، مع وجود كل مرحلة من مراحل النمو في مبيض الزرد البالغ. ومع ذلك ، تم اختيار الزرد اليافع لهذه الدراسة بسبب هيمنة البويضات في المرحلة المتأخرة (المرحلة الثانية والثالثة) في مبيض الأسماك البالغة ، وهي كبيرة وغير شفافة. في المقابل ، لدى الأحداث مبايض مسطحة وممدودة تتكون بشكل أساسي من بويضات المرحلة الأولى (الشكل 1 ب) (الشكل 1 ب). أظهرت الأبحاث السابقة أن السمات المورفولوجية لتكوين البويضة المبكرة في أسماك الزرد البالغة واليافعة متسقة للغاية ، مما يدعم جدوى استخدام صغار الزرد¹³. توفر الإجراءات الموضحة أدناه ، الموضحة في الشكل 2 ، وصفا تفصيليا لعملية العزل ، من التشريح إلى الحصول على بويضات نظيفة من المرحلة الأولى. لمزيد من المراجع ، يتم سرد الكواشف والمخازن المؤقتة والمعدات المستخدمة في الدراسة في جدول المواد.

1. تشريح المبيض

1. حدد عدة إناث من أسماك الزرد بطول قياسي (SL) يتراوح من 10 مم إلى 15 مم.
   ملاحظة: يعمل SL ، المقاس من الخطم إلى قاعدة الذيل بالمليمترات ، كمعيار موثوق لاختيار الأسماك المناسبة. يوصى باستخدام الأسماك الصغيرة بين 5 و 7 أسابيع بعد الإخصاب (wpf) مع SL يتراوح من 10 مم إلى 15 مم لهذا الإجراء. تشغل البويضات المبكرة في الغالب مبيض الزرد اليافع ، مما يوفر الظروف المثلى للحصول بسهولة على بويضات المرحلة الأولى (الشكل 1 ب).
2. القتل الرحيم لإناث الأسماك اليافعة بوضعها في ماء مثلج (0-4 درجة مئوية).
   ملاحظة: يجب تنفيذ الإجراءات التالية لضمان القتل الرحيم وتقليل الألم الذي يعاني منه الزرد أثناء القتل الرحيم: تأكد من أن درجة حرارة الماء المثلج تقع في نطاق 0-4 درجة مئوية باستخدام مقياس حرارة ، نقل الزرد بسرعة إلى الماء المثلج ، والحفاظ عليها في الماء المثلج لمدة 10 دقائق على الأقل بعد توقف الحركة الدائرية^{16 ، 17,18}.
3. جفف الماء الزائد على سطح السمك باستخدام ورق ماص.
4. تشريح الزرد تحت المجهر المجسم باتباع الخطوات التالية:
   1. قطع الرأس باستخدام مقص صغير على طول الهامش الخلفي للغطاء الخيشومي ؛ قطع الذيل على طول عباءة. انقل الجذع الأوسط إلى طبق 35 مم يحتوي على 2 مل من وسط L-15 (مع L-glutamine).
   2. تشريح الجذع الأوسط في وسط L-15. قطع على طول المحور المركزي للبطن وإزالة الأحشاء والمثانة السباحة.
      ملاحظة: أحشاء الزرد متصلة. لذلك ، قرصة الأمعاء الخلفية بالقرب من منطقة الشرج ورفعها لإزالة الكتلة الحشوية بأكملها بسهولة.
   3. افصل المبايض الثنائية عن البطن باستخدام الملقط. قم بإزالة الأنسجة الدهنية والقشور وأنسجة الجسم الأخرى المرتبطة بالمبيض.
      ملاحظة: المبايض مغطاة بأنسجة دهنية. لذلك ، من الأفضل إزالتها معا لتجنب التلف الميكانيكي للبويضات.
      تنبيه: تعامل مع الملقط بعناية لتجنب الإصابة.

2. الهضم

1. انقلي المبايض إلى طبق من 6 آبار يحتوي على 2 مل من محلول تفكك خلايا كينجر واحتضانه لمدة 2-3 ساعات عند 28.5 درجة مئوية. رج الطبق المكون من 6 آبار كل 30 دقيقة لتعزيز التشتت.
   ملاحظة: استخدم الملقط لفصل المبيضين إلى كتل أنسجة صغيرة لتعزيز فعالية الهضم. وقت الهضم متغير. مراقبة العملية وإنهائها بانتظام عندما ينتشر عدد كبير من بويضات المرحلة الأولى تحت المجهر المجسم. حل تفكك الخلايا في Kinger هو الحل العملي ويمكن استخدامه مباشرة. يمكن تخزينه بثبات عند -20 درجة مئوية بعد التعبئة وإذابته عند درجة حرارة منخفضة (4 درجات مئوية) قبل الاستخدام.
2. يضاف L-15 متوسط محمى على حرارة 28.5 درجة مئوية إلى محلول الهضم لإيقاف الهضم.

3. الترشيح

1. ضع مصفاة خلية 100 ميكرومتر في بئر آخر من لوحة 6 آبار ، وأضف وسط L-15 ، وتأكد من أن المستوى المتوسط أعلى من الفلتر.
   ملاحظة: القطر النظري لبويضات المرحلة الأولى أقل من 140 ميكرومتر. ومع ذلك ، قد تستمر البويضات ذات الأقطار الأكبر في المرور عبر مصفاة الخلية. لذلك ، تم اختيار مصفاة خلية بقطر أصغر من الهدف في هذه الخطوة. يمكن تعديل أحجام الشبكات حسب الاحتياجات التجريبية المحددة.
2. ارسم الوسط الهضمي من خلال مصفاة الخلية باستخدام ماصة. انتظر 1-2 دقيقة حتى تمر جميع البويضات في المرحلة الأولى عبر المصفاة ، ثم قم بإزالتها. تأكد من بقاء البويضات في السائل طوال عملية النقل.
   ملاحظة: يساعد الحفاظ على البويضات في الوسط في الحفاظ على سلامتها وحالتها المثلى. إذا تعرضت البويضات للهواء لفترة طويلة ، فقد تجف وتتلف ، مما يؤثر على كفاءة الفصل النهائي. احتفظ بالماصة تحت سطح السائل عند نقل البويضات عبر مصفاة الخلية بدلا من إضافتها بطريقة معلقة.

4. الغسيل

1. إزالة الوسط الزائد باستخدام ماصة. أضف 4 مل من وسط L-15 الطازج وأعد تعليق البويضات برفق. انتظر 1-2 دقيقة ، ثم قم بإزالة المادة الطافية.
   ملاحظة: استخدم أدوات ذات خصائص التصاق منخفضة لمنع تلف البويضات.
2. كرر الخطوة 4.1 5-6 مرات حتى لا توجد شوائب أخرى.
   ملاحظة: التعامل اللطيف أثناء عملية الغسيل أمر بالغ الأهمية لتجنب تلف البويضة. على الرغم من الحصول على وفرة من بويضات المرحلة الأولى (حوالي 200-400 بويضة من المرحلة الأولى من سمكة زرد واحدة) بعد خطوات الغسيل السابقة ، قد لا يزال من الممكن خلط البويضات بشظايا الخلايا أو البويضات من مراحل أخرى أو حبيبات صغيرة تتكون من البويضات المكسورة في المرحلة المتأخرة. بالإضافة إلى ذلك ، قد تظل بعض الخلايا الحبيبية تلتصق بسطح العديد من البويضات بسبب الهضم غير الكامل للإنزيم. لذلك ، بالنسبة للتطبيقات التي تتطلب مستوى أعلى من النقاء ، مثل تسلسل الجينوم ، من الضروري اتخاذ خطوات إضافية لاختيار بويضات نظيفة تماما. لمعالجة هذا الأمر، انتقل إلى الخطوتين 5 و6.

5. اختيار لمراقبة الجودة

1. انقل بويضات المرحلة الأولى المغسولة إلى طبق 35 مم يحتوي على وسط L-15 طازج.
2. تحت المجهر بتكبير يساوي أو يتجاوز 10x ، قم بإزالة شظايا الخلايا والبويضات في المرحلة الأخرى وبويضات المرحلة الأولى التي تلتصق بها الخلايا الحبيبية باستخدام أداة يمكن التلاعب بها بدقة ، مثل إبرة الحقن غير الحادة.
   ملاحظة: تتطلب هذه الخطوة الصبر من المجرب ، ولكنها تضمن عزل البويضات النظيفة والسليمة.
   تنبيه: تعامل مع إبر الحقن بعناية لتجنب الإصابة.

6. التأكيد عن طريق تلطيخ نووي

ملاحظة: لمزيد من التحسين للبويضات المعزولة ، تم استخدام تلطيخ مع Hoechst 33342 لتحديد وإزالة البويضات الفردية الملتصقة بالخلايا الحبيبية التي ربما تم تفويتها في الخطوة السابقة.

1. أضف تركيزا نهائيا قدره 5 ميكروغرام / مل Hoechst 33342 إلى وسط L-15 واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
2. راقب مضان Hoechst من خلال مجهر مضان تحت إثارة الليزر بالأشعة فوق البنفسجية.
   ملاحظة: عادة ما يكون Hoechst متحمسا في منطقة الأشعة فوق البنفسجية ، عادة بأطوال موجية تتراوح بين 310 و 360 نانومتر. يوصى باستخدام تكبير بين 80x و 100x أثناء هذه العملية. استخدم وضع التعرض التلقائي. يمكن تعديل الطول الموجي للإثارة ووقت التعرض بناء على نموذج المجهر المحدد والمتطلبات الفردية.
3. باستخدام إبرة ، اختر بعناية البويضات التي لا تفي بالمعايير المطلوبة.
   ملاحظة: عند تصور الخلايا ، يوجد كروماتين نووي كبير في وسط البويضة. إذا تم التصاق الخلايا الحبيبية بالبويضة ، فستكون النوى الصغيرة والمشرقة مرئية ، وتتشبث بحافة البويضة (الشكل 3). التقطهم تحت المجهر.
4. غسل البويضات جيدا وبشكل متكرر مع L-15 لإزالة Hoechst الزائدة.
5. استخدم بويضات المرحلة الأولى المحددة مباشرة للاستخراج اللاحق أو قم بتخزينها عند -80 درجة مئوية بعد التجميد السريع في النيتروجين السائل.
   تنبيه: ارتد قناعا واقيا للوجه وقفازات مبردة عند التعامل مع النيتروجين السائل والمجمدات ذات درجة الحرارة المنخفضة للغاية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يوضح الشكل 1 مورفولوجيا المبيض التي لوحظت في كل من أسماك الزرد البالغة واليافعة، ويعرض البويضات في مراحل النمو المختلفة لتكون بمثابة مرجع. يقدم الشكل 1 أ تمثيلا بيانيا لمورفولوجيا البويضة وحجمها في كل مرحلة من مراحل النمو ، بدءا من مرحلة ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في هذه الدراسة ، طورنا طريقة لعزل بويضات المرحلة الأولى النقية والنظيفة ، باستثناء الخلايا الحبيبية ، لتحليل المصب (خاصة التحليلات الجينومية). بمقارنة هذه الطريقة المعدلة مع الطريقة^{المشار إليها 13} ، فإن بويضات المرحلة الأولى التي تم الحصول عليها باستخدام ه?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kinger's cell dissociation solution	PlantChemMed	PC-33689	Kinger's cell dissociation solution can be stored stably at -20 °C after packaging and can be used after thawing at low temperature (4 °C). It can be used directly for dissociating zebrafish ovaries. The optimal temperature is 28.5 °C, for approximately 2-3 hours. The duration can be adjusted according to the specific dissociation conditions, either shortened or extended (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689).
Cell strainers (100 μm )	Falcon	352360
Fluorescence microscope	Zeiss	Axio Zoom.V16
Forceps	Dumont	#5
Glass capillary needle	/	/	Blunted by burning with lighter
Hoechst	Yesen	40732ES03
Low adsorption pipette tips (10 μl )	Labsellect	T-0010-LR-R-S
Leibovitz’s L-15 medium medium (with L-glutamine)	Hyclone	SH30525.01
Ice bucket	/	/	Ice-cold water is used to euthanize zebrafish
Incubator	WIGGENS	WH-01
Juvenile fish	/	/	5–6 weeks post-fertilization, standard length [SL] of 10–15 mm
Plastic dish (35 mm )	SORFA	230101
Stereomicroscope	Motic	SMZ-161
Tissue Culture Plate (6-wells)	SORFA	0110006
Vannas spring scissors	Fine Science Toosl	#15000-00