العزل السريع للبويضات المرحلة الأولى في الزرد الخالية من الخلايا الحبيبية

Summary

يصف هذا البروتوكول إجراء معدلا لعزل بويضات المرحلة الأولى النظيفة بسرعة في الزرد الخالي من الخلايا الحبيبية ، وبالتالي توفير طريقة ملائمة للبحث الخاص بالبويضات.

Abstract

دراسة تطور البويضة لها آثار كبيرة في علم الأحياء التنموي. تم استخدام الزرد (Danio rerio) على نطاق واسع ككائن نموذجي للتحقيق في عمليات النمو المبكرة من البويضة إلى الجنين. في الزرد ، تحاط البويضات بطبقة واحدة من الخلايا الحبيبية الجسدية. ومع ذلك ، فإن فصل الخلايا الحبيبية عن البويضات يشكل تحديا ، حيث أن تحقيق البويضات النقية أمر بالغ الأهمية للتحليل الدقيق. على الرغم من اقتراح طرق مختلفة لعزل بويضات الزرد في مراحل نمو مختلفة ، إلا أن التقنيات الحالية تقصر في إزالة الخلايا الحبيبية تماما ، مما يحد من دقة تحليل الجينوم الذي يركز فقط على البويضات. في هذه الدراسة ، نجحنا في تطوير عملية سريعة وفعالة لعزل البويضات النقية في المرحلة الأولى في الزرد مع القضاء على تلوث الخلايا الحبيبية. تسهل هذه التقنية التحليل الكيميائي الحيوي والجزيئي ، لا سيما في استكشاف جوانب البنية اللاجينية والجينوم الخاصة بالبويضات. والجدير بالذكر أن الطريقة سهلة الاستخدام ، وتقلل من تلف البويضات ، وتوفر حلا عمليا للبحث والتحليل اللاحق.

Introduction

الزرد هو من بين أهم النظم النموذجية في علم الأحياء التنموي. في السنوات الأخيرة ، استخدمت العديد من الدراسات الزرد كنموذج لدراسة الأحداث البيولوجية الهامة والعمليات التنظيمية من البويضة إلى الجنين. وتشمل هذه العمليات المعقدة لتطور البويضة^{ونضجها 1} ، ووظائف جينات الأم² ، وتنظيم التحولات بين الأم والزيجوت³ ، وتحليلات omics الشاملة⁴.

تلعب الخلايا الحبيبية ، وهي الخلايا الجسدية التي تغلف وتغذي البويضة النامية داخل جريب المبيض ^5,6 ، دورا محوريا في هذه العملية ال....

Protocol

تم التعامل مع جميع أسماك الزرد باتباع إرشادات صارمة لرعاية حددتها هيئات رعاية الوطنية و / أو المحلية ذات الصلة. حصلت صيانة الأسماك ومناولتها على موافقة كل من السلطات المحلية ولجنة أخلاقيات في مستشفى غرب الصين بجامعة سيتشوان (الموافقة رقم 20220422003). تحتوي مبيض الزرد على خليط من البويضات متعددة المراحل ، مع وجود كل مرحلة من مراحل النمو في مبيض الزرد البالغ. ومع ذلك ، تم اختيار الزرد اليافع لهذه الدراسة بسبب هيمنة البويضات في المرحلة المتأخرة (المرحلة الثانية والثالثة) في مبيض الأسماك البالغة ، وهي كبيرة وغير شفافة. في المقابل ، لدى الأحداث مبايض مسطحة وممدودة تتكون بشكل أساسي من بويضات المرحلة الأولى (الشكل 1 ب

النتائج

يوضح الشكل 1 مورفولوجيا المبيض التي لوحظت في كل من أسماك الزرد البالغة واليافعة، ويعرض البويضات في مراحل النمو المختلفة لتكون بمثابة مرجع. يقدم الشكل 1 أ تمثيلا بيانيا لمورفولوجيا البويضة وحجمها في كل مرحلة من مراحل النمو ، بدءا من مرحلة ?.......

Discussion

في هذه الدراسة ، طورنا طريقة لعزل بويضات المرحلة الأولى النقية والنظيفة ، باستثناء الخلايا الحبيبية ، لتحليل المصب (خاصة التحليلات الجينومية). بمقارنة هذه الطريقة المعدلة مع الطريقة^{المشار إليها 13} ، فإن بويضات المرحلة الأولى التي تم الحصول عليها باستخدام ه?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kinger's cell dissociation solution	PlantChemMed	PC-33689	Kinger's cell dissociation solution can be stored stably at -20 °C after packaging and can be used after thawing at low temperature (4 °C). It can be used directly for dissociating zebrafish ovaries. The optimal temperature is 28.5 °C, for approximately 2-3 hours. The duration can be adjusted according to the specific dissociation conditions, either shortened or extended (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689).
Cell strainers (100 μm )	Falcon	352360
Fluorescence microscope	Zeiss	Axio Zoom.V16
Forceps	Dumont	#5
Glass capillary needle	/	/	Blunted by burning with lighter
Hoechst	Yesen	40732ES03
Low adsorption pipette tips (10 μl )	Labsellect	T-0010-LR-R-S
Leibovitz’s L-15 medium medium (with L-glutamine)	Hyclone	SH30525.01
Ice bucket	/	/	Ice-cold water is used to euthanize zebrafish
Incubator	WIGGENS	WH-01
Juvenile fish	/	/	5–6 weeks post-fertilization, standard length [SL] of 10–15 mm
Plastic dish (35 mm )	SORFA	230101
Stereomicroscope	Motic	SMZ-161
Tissue Culture Plate (6-wells)	SORFA	0110006
Vannas spring scissors	Fine Science Toosl	#15000-00