顆粒膜細胞を欠損したゼブラフィッシュにおけるI期卵子の迅速な単離

要約

このプロトコルは、顆粒膜細胞を欠くゼブラフィッシュのクリーンなステージI卵子を迅速に単離するための修正手順を説明しており、それにより卵子特異的研究に便利な方法を提供します。

要約

卵子の発生の研究は、発生生物学において重要な意味を持っています。ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、卵母細胞から胚までの初期発生過程を調べるためのモデル生物として広く利用されてきました。ゼブラフィッシュでは、卵母細胞は体細胞顆粒膜細胞の単層に囲まれています。しかし、顆粒膜細胞を卵子から分離することは、純粋な卵子を得ることが正確な分析に不可欠であるため、課題を提起します。ゼブラフィッシュの卵子を異なる発生段階で単離するためには様々な方法が提案されていますが、現在の技術では顆粒膜細胞を完全に除去するには不十分であり、卵子のみに焦点を当てたゲノム解析の精度は限られています。本研究では、ゼブラフィッシュの純粋なステージIの卵子を迅速かつ効率的に単離し、顆粒膜細胞の汚染を排除するプロセスの開発に成功しました。この手法は、特に卵子に特有のエピジェネティックおよびゲノム構造の側面を探索する際に、生化学的および分子的分析を容易にします。特に、この方法はユーザーフレンドリーで、卵子の損傷を最小限に抑え、その後の研究と分析のための実用的なソリューションを提供します。

概要

ゼブラフィッシュは、発生生物学において最も重要なモデルシステムの1つです。近年、数多くの研究がゼブラフィッシュをモデルとして利用し、卵母細胞から胚までの重要な生物学的事象や調節過程を研究しています。これらには、卵子の発生と成熟¹、母体遺伝子の機能^性2、母体-接合子転換³の制御、および広範なオミクス解析⁴の複雑な過程が含まれます。

顆粒膜細胞は、卵巣卵胞^5,6内で発生中の卵子を包み育てる体細胞であり、この発生過程において極めて重要な役割を果たします。原始生殖細胞(PGC)が卵原細胞に進化すると、それらは顆粒膜細胞^の単層7に囲まれるようになる。外部髄膜細胞とともに、卵母細胞とその周囲の顆粒膜細胞は成熟した卵胞を構成する⁸。生殖細胞と体細胞の根本的な違いを考えると、特にゲノム関連の解析では、純粋な卵子サンプルを得ることが不可欠です。

ゼブラフィッシュの濾胞構造内....

プロトコル

すべてのゼブラフィッシュは、関連する国や地域の動物福祉団体が定めた厳格な動物管理ガイドラインに従って取り扱われました。魚の飼育と取り扱いは、地方自治体と四川大学華西病院の動物倫理委員会の両方から承認を受けています(承認番号20220422003)。ゼブラフィッシュの卵巣には多段階の卵子が混在しており、各発生段階は成体のゼブラフィッシュの卵巣に存在します。しかし、ゼブラフィッシュの稚魚は、大型で不透明な成魚の卵巣に後期卵子(II-III期)が優勢であることから、本研究にセブラフィッシュの稚魚を選抜しました。対照的に、幼若の卵巣は、主にステージIの卵子からなる平らで細長い卵巣を持っています(図1B)(図1B)。これまでの研究では、ゼブラフィッシュの成体と幼魚における初期の卵形成の形態学的特徴が非常に一貫していることが示されており、ゼブラフィッシュの稚魚を利用する可能性を裏付けています¹³。 図2に概説する以下に説明する手順は、解剖からきれいなステージIの卵子を得るまでの単離プロセスの詳細な説明を提供します。さらに参考までに、この研究で使用した試薬、バッファー、および機器は 、材料表に記載されています。

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ディスカッション

本研究では、顆粒膜細胞を除く純粋でクリーンなステージIの卵子を、ダウンストリーム解析(特にゲノム解析)のために単離する方法を開発しました。この修正された方法を参照^{された方法13}と比較すると、この方法を使用して得られたステージIの卵子は、形態学的に無傷で、十分な数であり、他の体細胞との汚染がないため、その後のさまざまな研.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kinger's cell dissociation solution	PlantChemMed	PC-33689	Kinger's cell dissociation solution can be stored stably at -20 °C after packaging and can be used after thawing at low temperature (4 °C). It can be used directly for dissociating zebrafish ovaries. The optimal temperature is 28.5 °C, for approximately 2-3 hours. The duration can be adjusted according to the specific dissociation conditions, either shortened or extended (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689).
Cell strainers (100 μm )	Falcon	352360
Fluorescence microscope	Zeiss	Axio Zoom.V16
Forceps	Dumont	#5
Glass capillary needle	/	/	Blunted by burning with lighter
Hoechst	Yesen	40732ES03
Low adsorption pipette tips (10 μl )	Labsellect	T-0010-LR-R-S
Leibovitz’s L-15 medium medium (with L-glutamine)	Hyclone	SH30525.01
Ice bucket	/	/	Ice-cold water is used to euthanize zebrafish
Incubator	WIGGENS	WH-01
Juvenile fish	/	/	5–6 weeks post-fertilization, standard length [SL] of 10–15 mm
Plastic dish (35 mm )	SORFA	230101
Stereomicroscope	Motic	SMZ-161
Tissue Culture Plate (6-wells)	SORFA	0110006
Vannas spring scissors	Fine Science Toosl	#15000-00