顆粒膜細胞を欠損したゼブラフィッシュにおけるI期卵子の迅速な単離

要約

このプロトコルは、顆粒膜細胞を欠くゼブラフィッシュのクリーンなステージI卵子を迅速に単離するための修正手順を説明しており、それにより卵子特異的研究に便利な方法を提供します。

要約

卵子の発生の研究は、発生生物学において重要な意味を持っています。ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、卵母細胞から胚までの初期発生過程を調べるためのモデル生物として広く利用されてきました。ゼブラフィッシュでは、卵母細胞は体細胞顆粒膜細胞の単層に囲まれています。しかし、顆粒膜細胞を卵子から分離することは、純粋な卵子を得ることが正確な分析に不可欠であるため、課題を提起します。ゼブラフィッシュの卵子を異なる発生段階で単離するためには様々な方法が提案されていますが、現在の技術では顆粒膜細胞を完全に除去するには不十分であり、卵子のみに焦点を当てたゲノム解析の精度は限られています。本研究では、ゼブラフィッシュの純粋なステージIの卵子を迅速かつ効率的に単離し、顆粒膜細胞の汚染を排除するプロセスの開発に成功しました。この手法は、特に卵子に特有のエピジェネティックおよびゲノム構造の側面を探索する際に、生化学的および分子的分析を容易にします。特に、この方法はユーザーフレンドリーで、卵子の損傷を最小限に抑え、その後の研究と分析のための実用的なソリューションを提供します。

概要

ゼブラフィッシュは、発生生物学において最も重要なモデルシステムの1つです。近年、数多くの研究がゼブラフィッシュをモデルとして利用し、卵母細胞から胚までの重要な生物学的事象や調節過程を研究しています。これらには、卵子の発生と成熟¹、母体遺伝子の機能^性2、母体-接合子転換³の制御、および広範なオミクス解析⁴の複雑な過程が含まれます。

顆粒膜細胞は、卵巣卵胞^5,6内で発生中の卵子を包み育てる体細胞であり、この発生過程において極めて重要な役割を果たします。原始生殖細胞(PGC)が卵原細胞に進化すると、それらは顆粒膜細胞^の単層7に囲まれるようになる。外部髄膜細胞とともに、卵母細胞とその周囲の顆粒膜細胞は成熟した卵胞を構成する⁸。生殖細胞と体細胞の根本的な違いを考えると、特にゲノム関連の解析では、純粋な卵子サンプルを得ることが不可欠です。

ゼブラフィッシュの濾胞構造内では、顆粒膜細胞は通常、わずか数ミクロンの直径8^{を示し、顆}粒膜細胞と卵母細胞9との間の密接な相互接続を強調し^ている。この密接な関連は、顆粒膜細胞の数と体積の両方と卵子(単一の卵子と比較して数百の顆粒膜細胞)のかなりの違いのために、完全な分離を達成する上での課題を提示します^10,11。単一の顆粒膜細胞による最小限の汚染でさえ、特に卵子を標的とした下流の分析を妨げる可能性があります。したがって、ゲノムおよびエピジェネティックな特性に焦点を当てた研究では、顆粒膜細胞の排除が不可欠です。

十分に特徴付けられた形態学的基準の恩恵を受けて、各段階の卵子は直径¹¹に基づいて区別することができる。ゼブラフィッシュの卵形成過程は、形態学と核型¹¹によって5つの段階に分類されます。ステージIの卵子(直径7〜140μm)は、減数分裂の発症から減数分裂Iの初期段階までの卵子を包含しています。重要なことに、これらの卵子は透明であるため、透過光を通じて中心核を観察できます(図1Ai)。ステージIIの卵子(直径140-340μm)は、徐々に泡立ち、半透明になります。卵胞の肥大と皮質肺胞の増殖に伴い、中心の胚小胞を区別しにくくなる¹²(図1Aii)。ステージIIIの卵子(直径340〜690μm)は徐々にビテロゲニンを蓄積し、新鮮な卵胞はますます不透明になります(図1Aiii)。減数分裂は、染色体が減数分裂IIの中央に入り、そこで停滞するため、ステージIVの卵母細胞(直径690〜730μm)で継続します(図1Aiv)。ステージVの卵子(直径730〜750μm)は成熟し、排卵の準備ができています^7,11(図1Av)。

前述の各段階の特異な特性に基づいて、コラゲナーゼI、コラゲナーゼII、およびヒアルロニダーゼを含む消化液を用いてゼブラフィッシュの卵巣を消化し、続いて特定のサイズの細胞ス^{トレーナー13}で濾過することにより、I期からIII期の卵母細胞を分離する方法が提案されている。しかし、この方法では、異なる発生段階で卵子を得ることができる一方で、卵子と顆粒膜細胞を完全に分離することはできません。他の研究者も、卵母細胞から顆粒膜細胞を分離する方法を提案しています。しかし、これらの方法は主に機械的なアプローチに依存しており、卵子の損傷を引き起こす可能性があり、時間がかかり、分析のためのかなりの数の卵子を得るには不十分である^14,15。

既存の方法の限界と特定の研究要件を考慮して、この研究は、卵子と顆粒膜細胞を完全に分離し、分析に十分な数のきれいなステージIの卵子を得る手順を確立することを目的としています。参照された方法¹³を拡張して、より穏やかで卵母細胞の分散と顆粒膜細胞の解離を容易にする改良された消化バッファー( 材料の表を参照)を採用しています。その後、卵子を細胞ストレーナーに通し、洗浄してさらに顕微鏡で選択することで、多数のクリーンなステージIの卵子を獲得することができます。

プロトコル

すべてのゼブラフィッシュは、関連する国や地域の動物福祉団体が定めた厳格な動物管理ガイドラインに従って取り扱われました。魚の飼育と取り扱いは、地方自治体と四川大学華西病院の動物倫理委員会の両方から承認を受けています(承認番号20220422003)。ゼブラフィッシュの卵巣には多段階の卵子が混在しており、各発生段階は成体のゼブラフィッシュの卵巣に存在します。しかし、ゼブラフィッシュの稚魚は、大型で不透明な成魚の卵巣に後期卵子(II-III期)が優勢であることから、本研究にセブラフィッシュの稚魚を選抜しました。対照的に、幼若の卵巣は、主にステージIの卵子からなる平らで細長い卵巣を持っています(図1B)(図1B)。これまでの研究では、ゼブラフィッシュの成体と幼魚における初期の卵形成の形態学的特徴が非常に一貫していることが示されており、ゼブラフィッシュの稚魚を利用する可能性を裏付けています¹³。 図2に概説する以下に説明する手順は、解剖からきれいなステージIの卵子を得るまでの単離プロセスの詳細な説明を提供します。さらに参考までに、この研究で使用した試薬、バッファー、および機器は 、材料表に記載されています。

1.卵巣解離

1. 標準体長(SL)が10mmから15mmの範囲のメスのゼブラフィッシュを数匹選択します。
   注:SLは、鼻から尾の付け根までミリメートル単位で測定され、適切な魚を選択するための信頼できる基準として機能します。この手順では、受精後5〜7週間(wpf)の稚魚を使用し、SLは10mmから15mmの範囲で使用することをお勧めします。ゼブラフィッシュの稚魚の卵巣は、主に初期の卵子によって占められており、ステージIの卵子を容易に得るための最適な条件を提供しています(図1B)。
2. 稚魚の雌魚を氷冷水(0〜4°C)に入れて安楽死させます。
   注:安楽死を確実にし、ゼブラフィッシュが安楽死中に経験する痛みを最小限に抑えるために、次の手順を実行する必要があります:温度計を使用して氷冷水の温度が0〜4°Cの範囲内にあることを確認し、ゼブラフィッシュを氷冷水に迅速に移し、手術運動の停止後少なくとも10分間氷冷水に維持します^16。17、18。
3. 魚の表面の余分な水分を吸収紙で乾かします。
4. ゼブラフィッシュを実体顕微鏡で解剖するには、次の手順に従います。
   1. 鰓カバーの後縁に沿ってマイクロハサミを使用して頭を切り取ります。クロアカに沿って尾を切り落とします。中央の幹を、2 mLのL-15培地(L-グルタミンを含む)が入った35 mmの皿に移します。
   2. L-15ミディアムで中央の幹を解剖します。腹部の中心軸に沿って切り込み、内臓を取り除き、膀胱を泳ぎます。
      注:ゼブラフィッシュの内臓はつながっています。そのため、肛門部付近の後腸をつまんで持ち上げると、内臓の塊全体を簡単に取り除きます。
   3. ピンセットを使用して両側の卵巣を腹部から切り離します。卵巣に付着している脂肪組織、鱗屑、およびその他の体組織を取り除きます。
      注:卵巣は脂肪組織で覆われています。したがって、卵母細胞への機械的損傷を避けるために、それらを一緒に取り除くのが最善です。
      注意: ピンセットは怪我をしないように注意して取り扱ってください。

2.消化

1. 卵巣を2 mLのKinger細胞解離溶液を含む6ウェルプレートに移し、28.5°Cで2〜3時間インキュベートします。 6ウェルプレートを30分ごとに振とうし、分散を促進します。
   注:ピンセットを使用して卵巣を小さな組織ブロックに分離し、消化効率を高めます。消化時間は可変です。実体顕微鏡の下にかなりの数のステージIの卵子が散らばっているときに、プロセスを定期的に監視し、終了します。キンガーの細胞解離溶液は作業溶液であり、直接使用することができます。包装後は-20°Cで安定して保存でき、低温(4°C)で解凍してから使用できます。
2. 28.5°Cに予熱したL-15培地を消化バッファーに加え、消化を停止します。

3. ろ過

1. 100 μmのセルストレーナーを6ウェルプレートの別のウェルに入れ、L-15培地を加えて、培地レベルがフィルターよりも高いことを確認します。
   注:ステージIの卵子の理論直径は140μm未満です。ただし、直径の大きい卵子は、細胞ストレーナーを通過する可能性があります。そこで、この工程では、ターゲットよりも直径が小さいセルストレーナーを選択した。メッシュサイズは、特定の実験ニーズに応じて調整できます。
2. ピペットを使用して、セルストレーナーを通して消化培地を引き出します。すべてのステージIの卵子がストレーナーを通過するまで1〜2分待ってから、ストレーナーを取り除きます。移し替えプロセス全体を通して卵母細胞が液体に留まることを確認してください。
   注:卵子を培地に保持すると、卵子の完全性と最適な状態を維持するのに役立ちます。卵子が長時間空気にさらされると、卵子が乾燥して損傷を受け、最終的な分離効率に影響を与える可能性があります。卵子を細胞ストレーナーを介して移すときは、卵子を懸濁状態で追加するのではなく、ピペットを液面の下に置いてください。

4. 洗濯

1. ピペットを使用して余分な培地を取り除きます。新鮮なL-15培地4mLを加え、卵子を穏やかに再懸濁します。1〜2分待ってから、上清を取り除きます。
   注:卵子の損傷を防ぐために、接着特性の低い器具を使用してください。
2. 他の不純物がなくなるまで、手順4.1を5〜6回繰り返します。
   注:卵子の損傷を避けるためには、洗浄プロセス中の穏やかな取り扱いが重要です。前の洗浄ステップでステージIの卵子(1匹のゼブラフィッシュから約200〜400のステージIの卵子)が豊富に得られたにもかかわらず、卵子は細胞断片、他のステージの卵子、または壊れた後期卵子によって形成された小さな顆粒とまだ混合されている可能性があります。さらに、一部の顆粒膜細胞は、不完全な酵素消化のために、まだいくつかの卵子の表面に付着している可能性があります。そのため、ゲノムシーケンシングなど、より高い純度が求められるアプリケーションでは、完全にクリーンな卵子を選択するための追加ステップが必要です。これに対処するには、ステップ 5 と 6 に進みます。

5. 品質管理のための選択

1. 洗浄したステージIの卵子を、新鮮なL-15培地が入った35 mmディッシュに移します。
2. 倍率10倍以上の顕微鏡で、鈍い注射針などの精密に操作できるツールを使用して、顆粒膜細胞に付着した細胞断片、他のステージの卵子、およびステージIの卵子を取り除きます。
   注:このステップには実験者の忍耐が必要ですが、清潔で無傷の卵子を確実に分離します。
   注意: 注射針は怪我をしないように注意して取り扱ってください。

6. 核染色による確認

注:単離された卵子をさらに精製するために、Hoechst 33342による染色を使用して、前のステップで見逃された可能性のある顆粒膜細胞に付着した個々の卵子を同定し、除去しました。

1. 最終濃度5 μg/mLのHoechst 33342をL-15培地に加え、室温で10分間インキュベートします。
2. 蛍光顕微鏡でヘキスト蛍光をUVレーザー励起下で観察します。
   注:ヘキストは通常、紫外線領域、通常は310〜360nmの波長で励起されます。このプロセスでは、80倍から100倍の間の倍率を使用することをお勧めします。自動露出モードを採用します。励起波長と露光時間は、特定の顕微鏡モデルと個々の要件に基づいて調整できます。
3. 針を使用して、目的の基準を満たさない卵子を慎重に選びます。
   注:細胞を視覚化すると、卵子の中心に大きな核クロマチンが存在します。顆粒膜細胞を卵子に接着すると、小さくて明るい核が卵子の縁にしがみついているのが見えます(図3)。顕微鏡でそれらを選び出します。
4. 卵子をL-15で徹底的に繰り返し洗浄し、余分なHoechstを取り除きます。
5. 同定したステージIの卵子を直接使用してその後の抽出を行うか、液体窒素で瞬間凍結した後、-80°Cで保存してください。
   注意: 液体窒素および超低温冷凍庫を取り扱うときは、保護フェイスマスクと極低温手袋を着用してください。

結果

図1 は、ゼブラフィッシュの成体と幼魚の両方で観察された卵巣の形態を示しており、参照として役立つさまざまな発生段階の卵子を示しています。 図1A は、一次成長段階(I期)から始まり、排卵卵子(V期)まで、各発生段階における卵子の形態とサイズをグラフで表したものです。 図1Ai-vは 、卵子のI期からV期?...

ディスカッション

本研究では、顆粒膜細胞を除く純粋でクリーンなステージIの卵子を、ダウンストリーム解析(特にゲノム解析)のために単離する方法を開発しました。この修正された方法を参照^{された方法13}と比較すると、この方法を使用して得られたステージIの卵子は、形態学的に無傷で、十分な数であり、他の体細胞との汚染がないため、その後のさまざまな研...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kinger's cell dissociation solution	PlantChemMed	PC-33689	Kinger's cell dissociation solution can be stored stably at -20 °C after packaging and can be used after thawing at low temperature (4 °C). It can be used directly for dissociating zebrafish ovaries. The optimal temperature is 28.5 °C, for approximately 2-3 hours. The duration can be adjusted according to the specific dissociation conditions, either shortened or extended (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689).
Cell strainers (100 μm )	Falcon	352360
Fluorescence microscope	Zeiss	Axio Zoom.V16
Forceps	Dumont	#5
Glass capillary needle	/	/	Blunted by burning with lighter
Hoechst	Yesen	40732ES03
Low adsorption pipette tips (10 μl )	Labsellect	T-0010-LR-R-S
Leibovitz’s L-15 medium medium (with L-glutamine)	Hyclone	SH30525.01
Ice bucket	/	/	Ice-cold water is used to euthanize zebrafish
Incubator	WIGGENS	WH-01
Juvenile fish	/	/	5–6 weeks post-fertilization, standard length [SL] of 10–15 mm
Plastic dish (35 mm )	SORFA	230101
Stereomicroscope	Motic	SMZ-161
Tissue Culture Plate (6-wells)	SORFA	0110006
Vannas spring scissors	Fine Science Toosl	#15000-00