Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Granüloza hücrelerinden yoksun zebra balıklarında evre I oositlerin hızlı izolasyonu
Bu Makalede
Özet
Bu protokol, granüloza hücrelerinden yoksun zebra balıklarında temiz evre I oositlerin hızlı bir şekilde izole edilmesi için modifiye edilmiş bir prosedürü tanımlar ve böylece oosite özgü araştırmalar için uygun bir yöntem sağlar.
Özet
Oosit gelişiminin incelenmesi, gelişimsel biyolojide önemli etkilere sahiptir. Zebra balığı (Danio rerio), oositten embriyoya kadar erken gelişimsel süreçleri araştırmak için model bir organizma olarak yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Zebra balıklarında, oositler tek bir somatik granüloza hücresi tabakası ile çevrilidir. Bununla birlikte, granüloza hücrelerini oositlerden ayırmak bir zorluk teşkil eder, çünkü saf oositler elde etmek hassas analiz için çok önemlidir. Farklı gelişim aşamalarında zebra balığı oositlerini izole etmek için çeşitli yöntemler önerilmiş olsa da, mevcut teknikler granüloza hücrelerinin tamamen çıkarılmasında yetersiz kalmakta ve yalnızca oositlere odaklanan genom analizinin doğruluğunu sınırlamaktadır. Bu çalışmada, granüloza hücre kontaminasyonunu ortadan kaldırırken zebra balıklarında saf evre I oositleri izole etmek için hızlı ve verimli bir süreç geliştirdik. Bu teknik, özellikle oositlere özgü epigenetik ve genom yapısı yönlerinin araştırılmasında biyokimyasal ve moleküler analizleri kolaylaştırır. Özellikle, yöntem kullanıcı dostudur, oosit hasarını en aza indirir ve sonraki araştırma ve analizler için pratik bir çözüm sunar.
Giriş
Zebra balığı, gelişim biyolojisindeki en önemli model sistemler arasında yer alır. Son yıllarda, çok sayıda çalışma, zebra balığını, oositten embriyoya kadar önemli biyolojik olayları ve düzenleyici süreçleri incelemek için bir model olarak kullanmıştır. Bunlar, oosit gelişimi ve olgunlaşması1, maternal genlerinişlevselliği 2, maternal-zigotik geçişlerindüzenlenmesi 3 ve kapsamlı omik analizler4'ün karmaşık süreçlerini kapsar.
Yumurtalık folikülü5,6 içind....
Protokol
Tüm zebra balıkları, ilgili ulusal ve/veya yerel hayvan refahı kuruluşları tarafından belirtilen katı hayvan bakımı yönergelerine göre ele alındı. Balıkların bakımı ve işlenmesi hem yerel makamlardan hem de Sichuan Üniversitesi Batı Çin Hastanesi'nin hayvan etik komitesinden onay aldı (onay No. 20220422003). Zebra balığı yumurtalıkları, her gelişim aşaması yetişkin zebra balığı yumurtalıklarında bulunan çok aşamalı oositlerin bir karışımını içerir. Bununla birlikte, yetişkin balıkların yumurtalıklarında büyük ve opak olan geç evre oositlerin (evre II-III) baskınlığı nedeniyle bu çalışma için yavru zebra balığı seçilmiştir. Buna karşıl....
Temsili Sonuçlar
Şekil 1 , hem yetişkin hem de genç zebra balıklarında gözlemlenen yumurtalık morfolojisini göstermekte ve referans olarak hizmet etmek için farklı gelişim aşamalarındaki oositleri göstermektedir. Şekil 1A , birincil büyüme aşamasından (evre I) başlayarak ve yumurtlanmış yumurta (evre V) ile sona eren her gelişim aşamasında oosit morfolojisinin ve boyutunun grafiksel bir temsilini sağlar. Şekil .......
Tartışmalar
Bu çalışmada, granüloza hücreleri hariç saf ve temiz evre I oositlerin aşağı akış analizi (özellikle genomik analizler) için izole edilmesi için bir yöntem geliştirdik. Bu modifiye edilmiş yöntem ile referans alınan yöntem13 karşılaştırıldığında, bu yöntem kullanılarak elde edilen evre I oositler morfolojik olarak sağlamdır, sayıca yeterlidir ve diğer somatik hücrelerle kontaminasyondan arındırılmıştır, bu da onları sonrak.......
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32170813 ve 31871449) ve Sichuan Bilim ve Teknoloji Departmanı (2024NSFSC0651) ve mükemmellik disiplinleri için 1·3·5 projesi–Klinik Araştırma Fonu, Batı Çin Hastanesi, Sichuan Üniversitesi (2024HXFH035) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, bu çalışmayla ilgili zebra balığı yetiştiriciliği için Pediatrik Cerrahi Laboratuvarı'ndan Zhao Wang ve Yanqiu Gao'ya teşekkür eder. Yazarlar ayrıca, incelemeye katılan tüm hakemlere ve bu makalenin hazırlanması sırasında İngilizce redaksiyon hizmetleri sağlayan MJEditor'a (www.mjeditor.com) teşekkür eder.
....Malzemeler
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kinger's cell dissociation solution | PlantChemMed | PC-33689 | Kinger's cell dissociation solution can be stored stably at -20 °C after packaging and can be used after thawing at low temperature (4 °C). It can be used directly for dissociating zebrafish ovaries. The optimal temperature is 28.5 °C, for approximately 2-3 hours. The duration can be adjusted according to the specific dissociation conditions, either shortened or extended (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689). |
| Cell strainers (100 μm ) | Falcon | 352360 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
| Forceps | Dumont | #5 | |
| Glass capillary needle | / | / | Blunted by burning with lighter |
| Hoechst | Yesen | 40732ES03 | |
| Low adsorption pipette tips (10 μl ) | Labsellect | T-0010-LR-R-S | |
| Leibovitz’s L-15 medium medium (with L-glutamine) | Hyclone | SH30525.01 | |
| Ice bucket | / | / | Ice-cold water is used to euthanize zebrafish |
| Incubator | WIGGENS | WH-01 | |
| Juvenile fish | / | / | 5–6 weeks post-fertilization, standard length [SL] of 10–15 mm |
| Plastic dish (35 mm ) | SORFA | 230101 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-161 | |
| Tissue Culture Plate (6-wells) | SORFA | 0110006 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Toosl | #15000-00 |
Referanslar
- Qin, J. Y., et al. Unraveling the mechanism of long-term bisphenol S exposure disrupted ovarian lipids metabolism, oocytes maturation, and offspring development of zebrafish. Chemosphere. 277, 130304 (2021).
- Hau, H. T. A., et al.
Yeniden Basımlar ve İzinler
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır