Granüloza hücrelerinden yoksun zebra balıklarında evre I oositlerin hızlı izolasyonu

Özet

Bu protokol, granüloza hücrelerinden yoksun zebra balıklarında temiz evre I oositlerin hızlı bir şekilde izole edilmesi için modifiye edilmiş bir prosedürü tanımlar ve böylece oosite özgü araştırmalar için uygun bir yöntem sağlar.

Özet

Oosit gelişiminin incelenmesi, gelişimsel biyolojide önemli etkilere sahiptir. Zebra balığı (Danio rerio), oositten embriyoya kadar erken gelişimsel süreçleri araştırmak için model bir organizma olarak yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Zebra balıklarında, oositler tek bir somatik granüloza hücresi tabakası ile çevrilidir. Bununla birlikte, granüloza hücrelerini oositlerden ayırmak bir zorluk teşkil eder, çünkü saf oositler elde etmek hassas analiz için çok önemlidir. Farklı gelişim aşamalarında zebra balığı oositlerini izole etmek için çeşitli yöntemler önerilmiş olsa da, mevcut teknikler granüloza hücrelerinin tamamen çıkarılmasında yetersiz kalmakta ve yalnızca oositlere odaklanan genom analizinin doğruluğunu sınırlamaktadır. Bu çalışmada, granüloza hücre kontaminasyonunu ortadan kaldırırken zebra balıklarında saf evre I oositleri izole etmek için hızlı ve verimli bir süreç geliştirdik. Bu teknik, özellikle oositlere özgü epigenetik ve genom yapısı yönlerinin araştırılmasında biyokimyasal ve moleküler analizleri kolaylaştırır. Özellikle, yöntem kullanıcı dostudur, oosit hasarını en aza indirir ve sonraki araştırma ve analizler için pratik bir çözüm sunar.

Giriş

Zebra balığı, gelişim biyolojisindeki en önemli model sistemler arasında yer alır. Son yıllarda, çok sayıda çalışma, zebra balığını, oositten embriyoya kadar önemli biyolojik olayları ve düzenleyici süreçleri incelemek için bir model olarak kullanmıştır. Bunlar, oosit gelişimi ve olgunlaşması¹, maternal genlerin^{işlevselliği 2}, maternal-zigotik geçişlerin^{düzenlenmesi 3} ve kapsamlı omik analizler^4'ün karmaşık süreçlerini kapsar.

Yumurtalık folikülü^5,6 içinde gelişmekte olan oositi saran ve besleyen somatik hücreler olan granüloza hücreleri, bu gelişim sürecinde çok önemli bir rol oynar. İlkel germ hücreleri (PGC'ler) oogonyaya dönüştükçe, tek katmanlı bir granüloza hücresi ile çevrili hale gelirler⁷. Dış tekal hücrelerle birlikte, oosit ve çevresindeki granüloza hücreleri olgun bir folikül oluşturur⁸. Germ hücreleri ve somatik hücreler arasındaki temel ayrım göz önüne alındığında, özellikle genomla ilgili analizler için saf bir oosit örneği almak zorunludur.

Zebra balığının foliküler yapısı içinde, granüloza hücreleri tipik olarak sadece birkaç mikronluk bir çap sergiler⁸, bu da granüloza hücreleri ve oositler⁹ arasındaki yakın bağlantıyı vurgular. Bu yakın ilişki, granüloza hücrelerinin hem sayısı hem de hacmi ile oositler arasındaki önemli fark (tek bir oosite kıyasla yüzlerce granüloza hücresi) nedeniyle tam ayırmanın elde edilmesinde bir zorluk teşkil ^{etmektedir10,11}. Tek bir granüloza hücresi ile minimum kontaminasyon bile, özellikle oositleri hedef alan aşağı akış analizlerini engelleyebilir. Bu nedenle, genomik ve epigenetik özelliklere odaklanan çalışmalar için granüloza hücrelerinin eliminasyonu esastır.

İyi karakterize edilmiş morfolojik kriterlerden yararlanarak, her aşamadaki oositler çap^11'e göre ayırt edilebilir. Zebra balığında oogenez süreci, morfoloji ve karyotip^11'e göre beş aşamaya ayrılır. Evre I oositler (7-140 μm çapında), mayoz bölünmenin başlangıcından mayoz I'in erken aşamasına kadar oositleri kapsar. Evre II oositler (140-340 μm çapında) yavaş yavaş köpüklü ve yarı saydam hale gelir. Foliküllerin büyümesi ve kortikal alveollerin çoğalması ile merkezdeki germinal veziküllerin ayırt edilmesi zorlaşır¹² (Şekil 1Aii). Evre III oositler (340-690 μm çapında) giderek vitellogenin biriktirir ve taze foliküller giderek opak hale gelir (Şekil 1Aiii). Mayoz, evre IV oositlerde (690-730 μm çapında) devam ederken, kromozomlar mayoz II'nin ortasına girer ve burada durgunlaşırlar (Şekil 1Aiv). Evre V oositler (730-750 μm çapında) olgunlaşmıştır ve yumurtlama için hazırdır ^7,11 (Şekil 1Av).

Yukarıda belirtilen aşamaların her birinin benzersiz özelliklerine dayanarak, zebra balığı yumurtalıklarını kollajenaz I, kollajenaz II ve hyaluronidaz içeren bir sindirim çözeltisi kullanılarak sindirerek ve ardından belirli boyutlu bir hücre süzgecinden^{süzülerek oositleri} aşama I'den III'e kadar izole etmek için bir yöntem önerilmiştir 13. Bununla birlikte, bu yöntem farklı gelişim aşamalarında oosit elde edilmesine izin verirken, oositleri ve granüloza hücrelerini tamamen ayırmada başarısız olur. Diğer araştırmacılar da granüloza hücrelerini oositlerden ayırmak için yöntemler önermişlerdir. Bununla birlikte, bu yöntemler öncelikle oosit hasarına neden olabilecek, zaman alıcı ve analiz için önemli sayıda oosit elde etmek için yetersiz olan mekanik yaklaşımlara dayanmaktadır^14,15.

Mevcut yöntemlerin sınırlamaları ve özel araştırma gereksinimleri göz önüne alındığında, bu çalışma, oositleri ve granüloza hücrelerini tamamen ayırmak ve analiz için yeterli sayıda temiz evre I oosit elde etmek için bir prosedür oluşturmayı amaçlamaktadır. Atıfta bulunulan yöntem^13'ü genişleterek, daha nazik olan ve oositlerin dağılmasını ve granüloza hücrelerinin ayrışmasını kolaylaştıran gelişmiş bir sindirim tamponu (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanıyoruz. Daha sonra, oositler bir hücre süzgecinden geçirilir, ardından yıkama ve daha fazla mikroskobik seçim yapılır, bu da çok sayıda temiz evre I oositin elde edilmesini sağlar.

Protokol

Tüm zebra balıkları, ilgili ulusal ve/veya yerel hayvan refahı kuruluşları tarafından belirtilen katı hayvan bakımı yönergelerine göre ele alındı. Balıkların bakımı ve işlenmesi hem yerel makamlardan hem de Sichuan Üniversitesi Batı Çin Hastanesi'nin hayvan etik komitesinden onay aldı (onay No. 20220422003). Zebra balığı yumurtalıkları, her gelişim aşaması yetişkin zebra balığı yumurtalıklarında bulunan çok aşamalı oositlerin bir karışımını içerir. Bununla birlikte, yetişkin balıkların yumurtalıklarında büyük ve opak olan geç evre oositlerin (evre II-III) baskınlığı nedeniyle bu çalışma için yavru zebra balığı seçilmiştir. Buna karşılık, yavrular esas olarak evre I oositlerden oluşan düz ve uzun yumurtalıklara sahiptir (Şekil 1B) (Şekil 1B). Önceki araştırmalar, yetişkin ve genç zebra balıklarında erken oogenezin morfolojik özelliklerinin oldukça tutarlı olduğunu ve yavru zebra balığının kullanılmasının fizibilitesini desteklediğini göstermiştir¹³. Aşağıda açıklanan ve Şekil 2'de özetlenen prosedürler, diseksiyondan temiz evre I oositlerin elde edilmesine kadar izolasyon sürecinin ayrıntılı bir tanımını sağlar. Daha fazla referans için, çalışmada kullanılan reaktifler, tamponlar ve ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Yumurtalık diseksiyonu

1. Standart uzunluğu (SL) 10 mm ila 15 mm arasında değişen birkaç dişi zebra balığı seçin.
   NOT: Burundan kuyruk tabanına kadar milimetre cinsinden ölçülen SL, uygun balığın seçilmesi için güvenilir bir kriter görevi görür. Bu işlem için 10 mm ila 15 mm arasında değişen bir SL ile döllenmeden 5 ila 7 hafta sonra (wpf) yavru balıkların kullanılması önerilir. Yavru zebra balıklarının yumurtalıkları ağırlıklı olarak erken oositler tarafından işgal edilir ve evre I oositleri kolayca elde etmek için en uygun koşulları sağlar (Şekil 1B).
2. Yavru dişi balıkları buz gibi soğuk suya (0-4 °C) koyarak ötenazi yapın.
   NOT: Ötenaziyi sağlamak ve zebra balığının ötenazi sırasında yaşadığı acıyı en aza indirmek için aşağıdaki prosedürler uygulanmalıdır: buz gibi soğuk suyun sıcaklığının bir termometre kullanarak 0-4 °C aralığında olduğunu doğrulayın, zebra balığını hızlı bir şekilde buz gibi suya aktarın ve operküler hareketin kesilmesinden sonra en az 10 dakika buz gibi suda tutun^{16, 17,18}.
3. Emici kağıt kullanarak balığın yüzeyindeki fazla suyu kurutun.
4. Aşağıdaki adımları izleyerek zebra balığını stereomikroskop altında inceleyin:
   1. Solungaç kapağının arka kenarı boyunca mikro makas kullanarak kafayı kesin; Kloaka boyunca kuyruğu kesin. Orta gövdeyi 2 mL L-15 ortamı (L-glutamin ile) içeren 35 mm'lik bir tabağa aktarın.
   2. Orta gövdeyi L-15 ortamında inceleyin. Karnın merkezi ekseni boyunca kesin ve iç organları çıkarın ve mesaneyi yüzün.
      NOT: Zebra balığının iç organları birbirine bağlıdır. Bu nedenle, arka bağırsağı anal bölgenin yakınına sıkıştırın ve tüm viseral kütleyi kolayca çıkarmak için kaldırın.
   3. Cımbız kullanarak iki taraflı yumurtalıkları karından çıkarın. Yumurtalığa bağlı yağ dokusunu, pulları ve diğer vücut dokularını çıkarın.
      NOT: Yumurtalıklar yağ dokusu ile kaplıdır. Bu nedenle, oositlerin mekanik olarak zarar görmesini önlemek için bunları birlikte çıkarmak en iyisidir.
      DİKKAT: Yaralanmaları önlemek için cımbızları dikkatli kullanın.

2. Sindirim

1. Yumurtalıkları 2 mL Kinger hücre ayrışma çözeltisi içeren 6 oyuklu bir plakaya aktarın ve 28.5 ° C'de 2-3 saat inkübe edin. Dağılmayı teşvik etmek için 6 oyuklu plakayı her 30 dakikada bir çalkalayın.
   NOT: Sindirim etkinliğini artırmak için yumurtalıkları küçük doku bloklarına ayırmak için cımbız kullanın. Sindirim süresi değişkendir; stereomikroskop altında önemli sayıda evre I oosit dağıldığında işlemi düzenli olarak izleyin ve sonlandırın. Kinger'in hücre ayrışma çözeltisi çalışan çözeltidir ve doğrudan kullanılabilir. Ambalajlandıktan sonra -20 °C'de stabil bir şekilde saklanabilir ve kullanımdan önce düşük sıcaklıkta (4 °C) çözülebilir.
2. Sindirimi durdurmak için 28.5 ° C'de önceden ısıtılmış L-15 ortamını sindirim tamponuna ekleyin.

3. Filtreleme

1. 6 oyuklu plakanın başka bir kuyucuğuna 100 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin, L-15 ortamı ekleyin ve orta seviyenin filtreden daha yüksek olduğundan emin olun.
   NOT: Evre I oositlerin teorik çapı 140 μm'den azdır. Bununla birlikte, daha büyük çaplı oositler yine de hücre süzgecinden geçebilir. Bu nedenle, bu adımda hedeften daha küçük çaplı bir hücre süzgeci seçildi. Ağ boyutları, özel deneysel ihtiyaçlara bağlı olarak ayarlanabilir.
2. Sindirim ortamını bir pipet kullanarak hücre süzgecinden çekin. Tüm evre I oositleri süzgecten geçene kadar 1-2 dakika bekleyin, ardından çıkarın. Transfer işlemi boyunca oositlerin sıvı içinde kaldığından emin olun.
   NOT: Oositleri ortamda tutmak, bütünlüklerinin ve optimal durumlarının korunmasına yardımcı olur. Oositler uzun süre havaya maruz kalırsa kuruyabilir ve hasar görebilir, bu da nihai ayırma verimliliğini etkileyebilir. Oositleri askıda eklemek yerine hücre süzgecinden aktarırken pipeti sıvı yüzeyinin altında tutun.

4. Yıkama

1. Bir pipet kullanarak fazla ortamı çıkarın. 4 mL taze L-15 besiyeri ekleyin ve oositleri nazikçe yeniden süspanse edin. 1-2 dakika bekleyin, ardından süpernatanı çıkarın.
   NOT: Oositlerin zarar görmesini önlemek için düşük yapışma özelliğine sahip aletler kullanın.
2. Başka kirlilik kalmayana kadar adım 4.1'i 5-6 kez tekrarlayın.
   NOT: Yıkama işlemi sırasında nazik kullanım, oosit hasarını önlemek için çok önemlidir. Önceki yıkama adımlarını takiben bol miktarda evre I oosit (bir zebra balığından yaklaşık 200-400 evre I oosit) elde edilmesine rağmen, oositler hala hücre fragmanları, diğer aşamalardan oositler veya kırık geç evre oositlerin oluşturduğu küçük granüller ile karıştırılabilir. Ek olarak, bazı granüloza hücreleri, eksik enzim sindirimi nedeniyle birkaç oositin yüzeyine hala yapışabilir. Bu nedenle, genom dizilimi gibi daha yüksek bir saflık seviyesi gerektiren uygulamalar için, tamamen temiz oositleri seçmek için ek adımlar gereklidir. Bu sorunu çözmek için 5. ve 6. adımlara geçin.

5. Kalite kontrol için seçim

1. Yıkanmış aşama I oositlerini taze L-15 ortamı içeren 35 mm'lik bir tabağa aktarın.
2. 10x'e eşit veya daha fazla büyütme oranına sahip bir mikroskop altında, künt enjeksiyon iğnesi gibi hassas bir şekilde manipüle edilebilen bir alet kullanarak granüloza hücreleri tarafından yapıştırılan hücre parçalarını, diğer aşama oositleri ve evre I oositleri çıkarın.
   NOT: Bu adım, deneyi yapan kişiden sabır gerektirir, ancak temiz ve sağlam oositlerin izolasyonunu sağlar.
   DİKKAT: Yaralanmaları önlemek için enjeksiyon iğnelerini dikkatli kullanın.

6. Nükleer boyama ile onay

NOT: İzole edilen oositlerin daha da rafine edilmesi için, önceki adımda gözden kaçmış olabilecek granüloza hücrelerine yapışmış tek tek oositleri tanımlamak ve çıkarmak için Hoechst 33342 ile boyama yapıldı.

1. L-15 ortamına 5 μg/mL Hoechst 33342'lik bir son konsantrasyon ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
2. UV lazer uyarımı altında bir floresan mikroskobu ile Hoechst floresansını gözlemleyin.
   NOT: Hoechst tipik olarak ultraviyole bölgesinde, genellikle 310 ila 360 nm arasındaki dalga boylarında uyarılır. Bu işlem sırasında 80x ile 100x arasında bir büyütme kullanılması önerilir. Otomatik pozlama modunu kullanın. Uyarma dalga boyu ve maruz kalma süresi, özel mikroskop modeline ve bireysel gereksinimlere göre ayarlanabilir.
3. Bir iğne kullanarak, istenen kriterleri karşılamayan oositleri dikkatlice seçin.
   NOT: Hücreleri görselleştirirken, oositin merkezinde büyük bir nükleer kromatin bulunur. Granüloza hücreleri oosite yapışırsa, oositin kenarına yapışan küçük ve parlak çekirdekler görünür hale gelirdi (Şekil 3). Onları mikroskop altında seçin.
4. Fazla Hoechst'i çıkarmak için oositleri L-15 ile iyice ve tekrar tekrar yıkayın.
5. Tanımlanan aşama I oositlerini daha sonraki ekstraksiyon için doğrudan kullanın veya sıvı nitrojen içinde hızlı dondurmadan sonra -80 ° C'de saklayın.
   DİKKAT: Sıvı nitrojen ve ultra düşük sıcaklıklı dondurucuları tutarken koruyucu bir yüz maskesi ve kriyojenik eldiven kullanın.

Sonuçlar

Şekil 1 , hem yetişkin hem de genç zebra balıklarında gözlemlenen yumurtalık morfolojisini göstermekte ve referans olarak hizmet etmek için farklı gelişim aşamalarındaki oositleri göstermektedir. Şekil 1A , birincil büyüme aşamasından (evre I) başlayarak ve yumurtlanmış yumurta (evre V) ile sona eren her gelişim aşamasında oosit morfolojisinin ve boyutunun grafiksel bir temsilini sağlar. Şekil ...

Tartışmalar

Bu çalışmada, granüloza hücreleri hariç saf ve temiz evre I oositlerin aşağı akış analizi (özellikle genomik analizler) için izole edilmesi için bir yöntem geliştirdik. Bu modifiye edilmiş yöntem ile referans alınan yöntem¹³ karşılaştırıldığında, bu yöntem kullanılarak elde edilen evre I oositler morfolojik olarak sağlamdır, sayıca yeterlidir ve diğer somatik hücrelerle kontaminasyondan arındırılmıştır, bu da onları sonrak...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kinger's cell dissociation solution	PlantChemMed	PC-33689	Kinger's cell dissociation solution can be stored stably at -20 °C after packaging and can be used after thawing at low temperature (4 °C). It can be used directly for dissociating zebrafish ovaries. The optimal temperature is 28.5 °C, for approximately 2-3 hours. The duration can be adjusted according to the specific dissociation conditions, either shortened or extended (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689).
Cell strainers (100 μm )	Falcon	352360
Fluorescence microscope	Zeiss	Axio Zoom.V16
Forceps	Dumont	#5
Glass capillary needle	/	/	Blunted by burning with lighter
Hoechst	Yesen	40732ES03
Low adsorption pipette tips (10 μl )	Labsellect	T-0010-LR-R-S
Leibovitz’s L-15 medium medium (with L-glutamine)	Hyclone	SH30525.01
Ice bucket	/	/	Ice-cold water is used to euthanize zebrafish
Incubator	WIGGENS	WH-01
Juvenile fish	/	/	5–6 weeks post-fertilization, standard length [SL] of 10–15 mm
Plastic dish (35 mm )	SORFA	230101
Stereomicroscope	Motic	SMZ-161
Tissue Culture Plate (6-wells)	SORFA	0110006
Vannas spring scissors	Fine Science Toosl	#15000-00