Aislamiento rápido de ovocitos en estadio I en pez cebra desprovistos de células granulosas

Resumen

Este protocolo describe un procedimiento modificado para aislar rápidamente ovocitos limpios en etapa I en pez cebra desprovistos de células de granulosa, proporcionando así un método conveniente para la investigación específica de ovocitos.

Resumen

El estudio del desarrollo de los ovocitos tiene implicaciones significativas en la biología del desarrollo. El pez cebra (Danio rerio) se ha utilizado ampliamente como organismo modelo para investigar los procesos tempranos de desarrollo desde el ovocito hasta el embrión. En el pez cebra, los ovocitos están rodeados por una sola capa de células somáticas de la granulosa. Sin embargo, separar las células de la granulosa de los ovocitos supone un reto, ya que conseguir ovocitos puros es crucial para un análisis preciso. Aunque se han propuesto varios métodos para aislar ovocitos de pez cebra en diferentes etapas de desarrollo, las técnicas actuales se quedan cortas para eliminar completamente las células de la granulosa, lo que limita la precisión del análisis del genoma centrado únicamente en los ovocitos. En este estudio, desarrollamos con éxito un proceso rápido y eficiente para aislar ovocitos puros en etapa I en pez cebra mientras eliminamos la contaminación de las células de la granulosa. Esta técnica facilita el análisis bioquímico y molecular, particularmente en la exploración de aspectos epigenéticos y de la estructura del genoma específicos de los ovocitos. En particular, el método es fácil de usar, minimiza el daño de los ovocitos y proporciona una solución práctica para la investigación y el análisis posteriores.

Introducción

El pez cebra es uno de los sistemas modelo más importantes en biología del desarrollo. En los últimos años, numerosos estudios han utilizado el pez cebra como modelo para estudiar importantes eventos biológicos y procesos reguladores desde el ovocito hasta el embrión. Estos abarcan los intrincados procesos de desarrollo y maduración de los ovocitos¹, la funcionalidad de los genes maternos², la regulación de las transiciones materno-cigóticas³ y extensos análisis ómicos⁴.

Las células de la granulosa, las células somáticas que envuelven y nutren al ovocito en desarrollo dentro del folículo ovárico ^5,6, desempeñan un papel fundamental en este proceso de desarrollo. A medida que las células germinales primordiales (PGC) evolucionan hacia la oogonía, quedan rodeadas por una monocapa de células de la granulosa⁷. Junto con las células tecales externas, el ovocito y las células de la granulosa circundantes constituyen un folículo maduro⁸. Dada la distinción fundamental entre células germinales y células somáticas, es imperativo obtener una muestra de ovocitos puros, especialmente para los análisis relacionados con el genoma.

Dentro de la estructura folicular del pez cebra, las células de la granulosa suelen exhibir un diámetro de solo unas pocas micras⁸, lo que enfatiza la íntima interconexión entre las células de la granulosa y los ovocitos⁹. Esta estrecha asociación presenta un desafío para lograr la separación completa debido a la considerable diferencia tanto en el número como en el volumen de células de la granulosa frente a los ovocitos (cientos de células de la granulosa en comparación con un solo ovocito)^10,11. Incluso una contaminación mínima con una sola célula de la granulosa puede impedir los análisis posteriores dirigidos específicamente a los ovocitos. Por lo tanto, para los estudios centrados en las características genómicas y epigenéticas, la eliminación de las células de la granulosa es esencial.

Beneficiándose de criterios morfológicos bien caracterizados, los ovocitos en cada estadio se pueden distinguir en función del diámetro¹¹. El proceso de ovogénesis en el pez cebra se categoriza en cinco etapas según la morfología y el cariotipo¹¹. Los ovocitos en estadio I (7-140 μm de diámetro) abarcan los ovocitos desde el inicio de la meiosis hasta la fase temprana de la meiosis I. Fundamentalmente, estos ovocitos son transparentes, lo que permite la observación del núcleo central a través de la luz transmitida (Figura 1Ai). Los ovocitos en estadio II (140-340 μm de diámetro) se vuelven gradualmente espumosos y translúcidos. Con el agrandamiento de los folículos y la proliferación de alvéolos corticales, las vesículas germinales en el centro se vuelven difíciles de distinguir¹² (Figura 1Aii). Los ovocitos en estadio III (340-690 μm de diámetro) acumulan progresivamente vitelogenina y los folículos frescos se vuelven cada vez más opacos (Figura 1Aiii). La meiosis continúa en los ovocitos en estadio IV (690-730 μm de diámetro) cuando los cromosomas entran en la mitad de la meiosis II, donde se estancan (Figura 1Aiv). Los ovocitos en estadio V (730-750 μm de diámetro) han madurado y están listos para la ovulación ^7,11 (Figura 1Av).

Con base en las características únicas de cada uno de los estadios antes mencionados, se ha propuesto un método para aislar ovocitos de los estadios I a III mediante la digestión de ovarios de pez cebra utilizando una solución digestiva que contiene colagenasa I, colagenasa II e hialuronidasa, seguida de filtración a través de un filtro celular de tamaño específico¹³. Sin embargo, aunque este método permite obtener ovocitos en diferentes etapas de desarrollo, no logra separar completamente los ovocitos y las células de la granulosa. Otros investigadores también han sugerido métodos para separar las células de la granulosa de los ovocitos. Sin embargo, estos métodos se basan principalmente en abordajes mecánicos, que pueden causar daño ovocitario, requieren mucho tiempo y son inadecuados para obtener un número sustancial de ovocitos para el análisis^14,15.

Dadas las limitaciones de los métodos existentes y los requisitos específicos de la investigación, este estudio tiene como objetivo establecer un procedimiento para separar completamente los ovocitos y las células de la granulosa y obtener un número suficiente de ovocitos limpios en estadio I para el análisis. Ampliando el método mencionado¹³, empleamos un tampón de digestión mejorado (ver Tabla de Materiales) que es más suave y facilita la dispersión de los ovocitos y la disociación de las células de la granulosa. Posteriormente, los ovocitos pasan a través de un filtro celular, seguido de un lavado y una posterior selección microscópica, lo que permite la adquisición de un gran número de ovocitos limpios en estadio I.

Protocolo

Todos los peces cebra se manipularon siguiendo estrictas pautas de cuidado animal descritas por los organismos nacionales y/o locales de bienestar animal pertinentes. El mantenimiento y la manipulación de los peces recibieron la aprobación tanto de las autoridades locales como del comité de ética animal del Hospital de China Occidental de la Universidad de Sichuan (aprobación Nº 20220422003). Los ovarios del pez cebra contienen una mezcla de ovocitos de múltiples etapas, y cada etapa de desarrollo está presente en los ovarios del pez cebra adultos. Sin embargo, se seleccionaron peces cebra juveniles para este estudio debido a la dominancia de ovocitos en etapa tardía (etapa II-III) en los ovarios de peces adultos, que son grandes y opacos. Por el contrario, los juveniles tienen ovarios planos y alargados que consisten principalmente en ovocitos en estadio I (Figura 1B) (Figura 1B). Investigaciones previas han demostrado que las características morfológicas de la ovogénesis temprana en el pez cebra adulto y juvenil son altamente consistentes, lo que respalda la factibilidad de utilizar peces cebra juveniles¹³. Los procedimientos que se describen a continuación, descritos en la Figura 2, proporcionan una descripción detallada del proceso de aislamiento, desde la disección hasta la obtención de ovocitos limpios en estadio I. Para mayor referencia, los reactivos, tampones y equipos utilizados en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Disección de ovarios

1. Seleccione varias hembras de pez cebra con una longitud estándar (SL) que oscile entre 10 mm y 15 mm.
   NOTA: El SL, medido desde el hocico hasta la base de la cola en milímetros, sirve como un criterio confiable para seleccionar los peces apropiados. Se recomienda utilizar peces juveniles entre 5 y 7 semanas después de la fertilización (wpf) con un SL que oscila entre 10 mm y 15 mm para este procedimiento. Los ovarios de los peces cebra juveniles están ocupados predominantemente por ovocitos tempranos, lo que proporciona condiciones óptimas para la obtención fácil de ovocitos en estadio I (Figura 1B).
2. Eutanasiar a las hembras juveniles colocándolas en agua helada (0-4 °C).
   NOTA: Se deben llevar a cabo los siguientes procedimientos para garantizar la eutanasia y minimizar el dolor experimentado por el pez cebra durante la eutanasia: confirmar que la temperatura del agua helada está dentro del rango de 0-4 °C con un termómetro, transferir rápidamente el pez cebra al agua helada y mantenerlo en el agua helada durante al menos 10 minutos después del cese del movimiento opercular^{16, Isaías 17,18}.
3. Seque el exceso de agua en la superficie del pez con papel absorbente.
4. Disecciona el pez cebra bajo un microscopio estereoscópico siguiendo estos pasos:
   1. Cortar la cabeza con microtijeras a lo largo del margen posterior de la cubierta branquial; Corta la cola a lo largo de la cloaca. Transfiera el tronco central a un plato de 35 mm que contenga 2 mL de medio L-15 (con L-glutamina).
   2. Disecciona el tronco medio en el medio L-15. Cortar a lo largo del eje central del abdomen y extraer las vísceras y la vejiga natatoria.
      NOTA: Las vísceras del pez cebra están conectadas. Por lo tanto, pellizque el intestino posterior cerca de la región anal y levántelo para eliminar fácilmente toda la masa visceral.
   3. Separe los ovarios bilaterales del abdomen con pinzas. Extraer el tejido adiposo, las escamas y otros tejidos corporales adheridos al ovario.
      NOTA: Los ovarios están cubiertos de tejido adiposo. Por lo tanto, lo mejor es eliminarlos juntos para evitar daños mecánicos en los ovocitos.
      PRECAUCIÓN: Manipule las pinzas con cuidado para evitar lesiones.

2. Digestión

1. Transfiera los ovarios a una placa de 6 pocillos que contenga 2 mL de solución de disociación celular de Kinger e incube durante 2-3 h a 28,5 °C. Agite la placa de 6 pocillos cada 30 minutos para promover la dispersión.
   NOTA: Use pinzas para separar los ovarios en pequeños bloques de tejido para mejorar la eficacia de la digestión. El tiempo de digestión es variable; Monitorizar y finalizar regularmente el proceso cuando un número significativo de ovocitos en estadio I se encuentran dispersos bajo el microscopio estereoscópico. La solución de disociación celular de Kinger es la solución de trabajo y se puede utilizar directamente. Puede almacenarse de forma estable a -20 °C después del envasado y descongelarse a baja temperatura (4 °C) antes de su uso.
2. Añadir medio L-15 precalentado a 28,5 °C al tampón de digestión para detener la digestión.

3. Filtración

1. Coloque un colador de células de 100 μm en otro pocillo de la placa de 6 pocillos, agregue medio L-15 y asegúrese de que el nivel del medio sea más alto que el filtro.
   NOTA: El diámetro teórico de los ovocitos en estadio I es inferior a 140 μm. Sin embargo, los ovocitos con diámetros más grandes aún pueden pasar a través del filtro celular. Por lo tanto, en este paso se seleccionó un filtro de células con un diámetro menor que el objetivo. Los tamaños de malla se pueden ajustar en función de las necesidades experimentales específicas.
2. Extrae el medio digestivo a través del colador de células con una pipeta. Espere 1-2 minutos hasta que todos los ovocitos de la etapa I hayan pasado a través del filtro, luego retírelo. Asegúrese de que los ovocitos permanezcan en el líquido durante todo el proceso de transferencia.
   NOTA: Mantener los ovocitos en el medio ayuda a mantener su integridad y condición óptima. Si los ovocitos se exponen al aire durante un período prolongado, podrían secarse y dañarse, afectando la eficiencia de la separación final. Mantenga la pipeta por debajo de la superficie líquida cuando transfiera los ovocitos a través del filtro celular en lugar de agregarlos de manera suspendida.

4. Lavado

1. Retire el exceso de medio con una pipeta. Añadir 4 mL de medio L-15 fresco y resuspender suavemente los ovocitos. Espere de 1 a 2 minutos, luego retire el sobrenadante.
   NOTA: Utilice instrumentos con propiedades de baja adherencia para evitar daños en los ovocitos.
2. Repita el paso 4.1 5-6 veces hasta que no haya otras impurezas presentes.
   NOTA: La manipulación suave durante el proceso de lavado es crucial para evitar daños en los ovocitos. A pesar de obtener una abundancia de ovocitos en estadio I (aproximadamente 200-400 ovocitos en estadio I de un pez cebra) después de los pasos de lavado anteriores, los ovocitos aún pueden mezclarse con fragmentos de células, ovocitos de otros estadios o pequeños gránulos formados por ovocitos rotos en etapa tardía. Además, algunas células de la granulosa aún pueden adherirse a la superficie de varios ovocitos debido a una digestión enzimática incompleta. Por lo tanto, para aplicaciones que exigen un mayor nivel de pureza, como la secuenciación del genoma, son necesarios pasos adicionales para seleccionar ovocitos completamente limpios. Para solucionar este problema, continúe con los pasos 5 y 6.

5. Selección para el control de calidad

1. Transfiera los ovocitos lavados en estadio I a una placa de 35 mm que contenga medio L-15 fresco.
2. Bajo un microscopio con un aumento igual o superior a 10x, extraiga fragmentos de células, ovocitos en otras etapas y ovocitos en etapa I adheridos por células de la granulosa utilizando una herramienta que se pueda manipular con precisión, como una aguja de inyección roma.
   NOTA: Este paso requiere paciencia por parte del experimentador, pero asegura el aislamiento de ovocitos limpios e intactos.
   PRECAUCIÓN: Manipule las agujas de inyección con cuidado para evitar lesiones.

6. Confirmación por tinción nuclear

NOTA: Para un mayor refinamiento de los ovocitos aislados, se empleó la tinción con Hoechst 33342 para identificar y eliminar ovocitos individuales adheridos con células de la granulosa que pueden haber pasado desapercibidos en el paso anterior.

1. Añadir una concentración final de 5 μg/mL de Hoechst 33342 al medio L-15 e incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
2. Observe la fluorescencia de Hoechst a través de un microscopio de fluorescencia bajo excitación láser UV.
   NOTA: Hoechst se excita típicamente en la región ultravioleta, generalmente en longitudes de onda entre 310 y 360 nm. Se recomienda utilizar un aumento entre 80x y 100x durante este proceso. Emplea el modo de exposición automática. La longitud de onda de excitación y el tiempo de exposición se pueden ajustar en función del modelo de microscopio específico y de los requisitos individuales.
3. Con una aguja, seleccione cuidadosamente los ovocitos que no cumplan con los criterios deseados.
   NOTA: Al visualizar las células, una gran cromatina nuclear está presente en el centro del ovocito. Si las células de la granulosa estuvieran adheridas al ovocito, se verían núcleos pequeños y brillantes, aferrados al borde del ovocito (Figura 3). Esquínalos bajo el microscopio.
4. Lavar a fondo y repetidamente los ovocitos con L-15 para eliminar el exceso de Hoechst.
5. Utilice los ovocitos identificados en estadio I directamente para su posterior extracción o almacénelos a -80 °C después de la congelación instantánea en nitrógeno líquido.
   PRECAUCIÓN: Use una mascarilla protectora y guantes criogénicos cuando manipule nitrógeno líquido y congeladores de temperatura ultrabaja.

Resultados

En la Figura 1 se ilustra la morfología ovárica observada tanto en el pez cebra adulto como en el juvenil, mostrando ovocitos en diferentes etapas de desarrollo para que sirvan de referencia. La figura 1A proporciona una representación gráfica de la morfología y el tamaño de los ovocitos en cada etapa del desarrollo, comenzando con la etapa de crecimiento primario (etapa I) y terminando con el óvulo ovulado (etapa V).

Discusión

En este estudio, desarrollamos un método para aislar ovocitos puros y limpios en estadio I, excluyendo las células de la granulosa, para su análisis posterior (en particular, análisis genómicos). Comparando este método modificado con el método referenciado¹³, los ovocitos en estadio I obtenidos mediante este método están morfológicamente intactos, en número suficiente y libres de contaminación con otras células somáticas, lo que los hace adecuados pa...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kinger's cell dissociation solution	PlantChemMed	PC-33689	Kinger's cell dissociation solution can be stored stably at -20 °C after packaging and can be used after thawing at low temperature (4 °C). It can be used directly for dissociating zebrafish ovaries. The optimal temperature is 28.5 °C, for approximately 2-3 hours. The duration can be adjusted according to the specific dissociation conditions, either shortened or extended (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689).
Cell strainers (100 μm )	Falcon	352360
Fluorescence microscope	Zeiss	Axio Zoom.V16
Forceps	Dumont	#5
Glass capillary needle	/	/	Blunted by burning with lighter
Hoechst	Yesen	40732ES03
Low adsorption pipette tips (10 μl )	Labsellect	T-0010-LR-R-S
Leibovitz’s L-15 medium medium (with L-glutamine)	Hyclone	SH30525.01
Ice bucket	/	/	Ice-cold water is used to euthanize zebrafish
Incubator	WIGGENS	WH-01
Juvenile fish	/	/	5–6 weeks post-fertilization, standard length [SL] of 10–15 mm
Plastic dish (35 mm )	SORFA	230101
Stereomicroscope	Motic	SMZ-161
Tissue Culture Plate (6-wells)	SORFA	0110006
Vannas spring scissors	Fine Science Toosl	#15000-00