在无颗粒细胞的斑马鱼中快速分离 I 期卵母细胞

摘要

该方案描述了一种改进的程序，用于在缺乏颗粒细胞的斑马鱼中快速分离干净的 I 期卵母细胞，从而为卵母细胞特异性研究提供了一种便捷的方法。

摘要

卵母细胞发育的研究在发育生物学中具有重要意义。斑马鱼 （Danio rerio） 已被广泛用作模式生物，以研究从卵母细胞到胚胎的早期发育过程。在斑马鱼中，卵母细胞被单层体细胞颗粒细胞包围。然而，将颗粒细胞与卵母细胞分离是一项挑战，因为获得纯卵母细胞对于精确分析至关重要。尽管已经提出了各种方法来分离不同发育阶段的斑马鱼卵母细胞，但目前的技术在完全去除颗粒细胞方面存在不足，限制了仅关注卵母细胞的基因组分析的准确性。在这项研究中，我们成功开发了一种快速有效的工艺，用于分离斑马鱼中的纯 I 期卵母细胞，同时消除颗粒细胞污染。该技术有助于生化和分子分析，特别是在探索卵母细胞特有的表观遗传和基因组结构方面。值得注意的是，该方法用户友好，最大限度地减少了卵母细胞损伤，并为后续研究和分析提供了实用的解决方案。

引言

斑马鱼是发育生物学中最重要的模型系统之一。近年来，许多研究以斑马鱼为模型来研究从卵母细胞到胚胎的重要生物学事件和调节过程。这些包括卵母细胞发育和成熟的复杂过程¹、母体基因的功能²（functional of motheral-genigotic transitions）、母体合子转换的调节³ （formation of motheral-zygotic transitions） 以及广泛的组学分析⁴ （omics analysis）。

颗粒细胞，即包裹和滋养卵巢卵泡内发育中的卵母细胞的体细胞 ^5,6，在这个发育过程中起着关键作用。当原始生殖细胞 （PGC） 进化成卵状细胞时，它们被单层颗粒细胞包围⁷。卵母细胞及其周围的颗粒细胞与外鞘细胞一起构成一个成熟的卵泡⁸。鉴于生殖细胞和体细胞之间的根本区别，获得纯卵母细胞样本势在必行，尤其是对于基因组相关分析。

在斑....

研究方案

所有斑马鱼均按照相关国家和/或地方动物福利机构制定的严格动物护理指南进行处理。鱼类的维护和处理得到了地方当局和四川大学华西医院动物伦理委员会的批准（批准号20220422003）。斑马鱼卵巢包含多阶段卵母细胞的混合物，每个发育阶段都存在于成年斑马鱼卵巢中。然而，由于成年鱼卵巢中的晚期卵母细胞（II-III 期）占主导地位，因此选择了幼年斑马鱼进行这项研究，这些卵母细胞大且不透明。相比之下，幼年具有扁平而细长的卵巢，主要由 I 期卵母细胞组成（图 1B）（图 1B）。先前的研究表明，成年斑马鱼和幼年斑马鱼早期卵子发生的形态特征高度一致，支持利用幼年斑马鱼^{的可行性 13}。 图 2 中概述的下面描述的程序提供了从解剖到获得干净的 I 期卵母细胞的分离过程的详细描述。为了进一步参考，材料 表中列出了研究中使用的试剂、缓冲液和设备。

1. 卵巢夹层

1. 选择几条标准长度 （SL） 从 10 毫米到 15 毫米不等的雌性斑马鱼。
   注意：从鼻子到尾部基部以毫米为单位测量的 SL 是选择合适鱼的可靠标准。建议在受....

讨论

在这项研究中，我们开发了一种分离纯干净的 I 期卵母细胞（不包括颗粒细胞）用于下游分析（特别是基因组分析）的方法。将这种修改后的方法与参考方法¹³ 进行比较，使用该方法获得的 I 期卵母细胞形态完整，数量充足，并且不受其他体细胞的污染，使其适用于各种后续研究和分析。此外，与其他机械分离方法^14,15

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kinger's cell dissociation solution	PlantChemMed	PC-33689	Kinger's cell dissociation solution can be stored stably at -20 °C after packaging and can be used after thawing at low temperature (4 °C). It can be used directly for dissociating zebrafish ovaries. The optimal temperature is 28.5 °C, for approximately 2-3 hours. The duration can be adjusted according to the specific dissociation conditions, either shortened or extended (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689).
Cell strainers (100 μm )	Falcon	352360
Fluorescence microscope	Zeiss	Axio Zoom.V16
Forceps	Dumont	#5
Glass capillary needle	/	/	Blunted by burning with lighter
Hoechst	Yesen	40732ES03
Low adsorption pipette tips (10 μl )	Labsellect	T-0010-LR-R-S
Leibovitz’s L-15 medium medium (with L-glutamine)	Hyclone	SH30525.01
Ice bucket	/	/	Ice-cold water is used to euthanize zebrafish
Incubator	WIGGENS	WH-01
Juvenile fish	/	/	5–6 weeks post-fertilization, standard length [SL] of 10–15 mm
Plastic dish (35 mm )	SORFA	230101
Stereomicroscope	Motic	SMZ-161
Tissue Culture Plate (6-wells)	SORFA	0110006
Vannas spring scissors	Fine Science Toosl	#15000-00