在无颗粒细胞的斑马鱼中快速分离 I 期卵母细胞

摘要

该方案描述了一种改进的程序，用于在缺乏颗粒细胞的斑马鱼中快速分离干净的 I 期卵母细胞，从而为卵母细胞特异性研究提供了一种便捷的方法。

摘要

卵母细胞发育的研究在发育生物学中具有重要意义。斑马鱼 （Danio rerio） 已被广泛用作模式生物，以研究从卵母细胞到胚胎的早期发育过程。在斑马鱼中，卵母细胞被单层体细胞颗粒细胞包围。然而，将颗粒细胞与卵母细胞分离是一项挑战，因为获得纯卵母细胞对于精确分析至关重要。尽管已经提出了各种方法来分离不同发育阶段的斑马鱼卵母细胞，但目前的技术在完全去除颗粒细胞方面存在不足，限制了仅关注卵母细胞的基因组分析的准确性。在这项研究中，我们成功开发了一种快速有效的工艺，用于分离斑马鱼中的纯 I 期卵母细胞，同时消除颗粒细胞污染。该技术有助于生化和分子分析，特别是在探索卵母细胞特有的表观遗传和基因组结构方面。值得注意的是，该方法用户友好，最大限度地减少了卵母细胞损伤，并为后续研究和分析提供了实用的解决方案。

引言

斑马鱼是发育生物学中最重要的模型系统之一。近年来，许多研究以斑马鱼为模型来研究从卵母细胞到胚胎的重要生物学事件和调节过程。这些包括卵母细胞发育和成熟的复杂过程¹、母体基因的功能²（functional of motheral-genigotic transitions）、母体合子转换的调节³ （formation of motheral-zygotic transitions） 以及广泛的组学分析⁴ （omics analysis）。

颗粒细胞，即包裹和滋养卵巢卵泡内发育中的卵母细胞的体细胞 ^5,6，在这个发育过程中起着关键作用。当原始生殖细胞 （PGC） 进化成卵状细胞时，它们被单层颗粒细胞包围⁷。卵母细胞及其周围的颗粒细胞与外鞘细胞一起构成一个成熟的卵泡⁸。鉴于生殖细胞和体细胞之间的根本区别，获得纯卵母细胞样本势在必行，尤其是对于基因组相关分析。

在斑马鱼的卵泡结构中，颗粒细胞的直径通常只有几微米⁸，这强调了颗粒细胞和卵母细胞之间的密切联系⁹。由于颗粒细胞与卵母细胞的数量和体积存在相当大的差异（数百个颗粒细胞与单个卵母细胞相比）10,11，因此这种紧密结合为实现完全分离带来了挑战^10,11。即使是单个颗粒细胞的最小污染也会阻碍专门针对卵母细胞的下游分析。因此，对于专注于基因组和表观遗传特征的研究，消除颗粒细胞是必不可少的。

得益于充分表征的形态学标准，可以根据直径¹¹ 区分每个阶段的卵母细胞。斑马鱼的卵子发生过程根据形态学和核型¹¹ 分为五个阶段。I 期卵母细胞（直径 7-140 μm）包括从减数分裂开始到减数分裂 I 早期的卵母细胞。至关重要的是，这些卵母细胞是透明的，可以通过透射光观察中央核（图 1Ai）。II 期卵母细胞（直径 140-340 μm）逐渐变成泡沫状和半透明状。随着卵泡的增大和皮质肺泡的增殖，中心的生发囊泡变得难以区分¹²（图 1Aii）。III 期卵母细胞（直径 340-690 μm）逐渐积累卵黄素原蛋白，新鲜卵泡变得越来越不透明（图 1Aiii）。减数分裂在 IV 期卵母细胞（直径 690-730 μm）中继续进行，因为染色体进入减数分裂 II 的中间，在那里它们停滞不前（图 1Aiv）。V 期卵母细胞（直径 730-750 μm）已经成熟并准备好排卵 ^7,11（图 1Av）。

基于上述每个阶段的独特特性，已经提出了一种方法，通过使用含有胶原酶 I、胶原酶 II 和透明质酸酶的消化液消化斑马鱼卵巢，然后通过特定大小的细胞过滤器过滤来分离 I 至 III 阶段的卵母细胞¹³。然而，虽然这种方法允许获得不同发育阶段的卵母细胞，但它无法完全分离卵母细胞和颗粒细胞。其他研究人员也提出了将颗粒细胞与卵母细胞分离的方法。然而，这些方法主要依赖于机械方法，这可能导致卵母细胞损伤，耗时，并且不足以获得大量卵母细胞进行分析^14,15。

鉴于现有方法的局限性和特定的研究要求，本研究旨在建立一种彻底分离卵母细胞和颗粒细胞并获得足够数量的清洁 I 期卵母细胞进行分析的程序。在参考方法¹³ 的基础上，我们采用了一种改进的消化缓冲液（参见 材料表），它更温和，有利于卵母细胞的分散和颗粒细胞的解离。随后，卵母细胞通过细胞过滤器，然后进行洗涤和进一步的显微镜选择，从而能够获得大量干净的 I 期卵母细胞。

研究方案

所有斑马鱼均按照相关国家和/或地方动物福利机构制定的严格动物护理指南进行处理。鱼类的维护和处理得到了地方当局和四川大学华西医院动物伦理委员会的批准（批准号20220422003）。斑马鱼卵巢包含多阶段卵母细胞的混合物，每个发育阶段都存在于成年斑马鱼卵巢中。然而，由于成年鱼卵巢中的晚期卵母细胞（II-III 期）占主导地位，因此选择了幼年斑马鱼进行这项研究，这些卵母细胞大且不透明。相比之下，幼年具有扁平而细长的卵巢，主要由 I 期卵母细胞组成（图 1B）（图 1B）。先前的研究表明，成年斑马鱼和幼年斑马鱼早期卵子发生的形态特征高度一致，支持利用幼年斑马鱼^{的可行性 13}。 图 2 中概述的下面描述的程序提供了从解剖到获得干净的 I 期卵母细胞的分离过程的详细描述。为了进一步参考，材料 表中列出了研究中使用的试剂、缓冲液和设备。

1. 卵巢夹层

1. 选择几条标准长度 （SL） 从 10 毫米到 15 毫米不等的雌性斑马鱼。
   注意：从鼻子到尾部基部以毫米为单位测量的 SL 是选择合适鱼的可靠标准。建议在受精后 5 至 7 周 （wpf） 之间使用幼鱼，SL 范围为 10 毫米至 15 毫米。幼年斑马鱼的卵巢主要被早期卵母细胞占据，为容易获得 I 期卵母细胞提供了最佳条件（图 1B）。
2. 将幼年雌鱼放入冰冷的水中 （0-4 °C） 对它们实施安乐死。
   注意：必须执行以下程序以确保安乐死并尽量减少斑马鱼在安乐死期间所经历的痛苦：使用温度计确认冰冷水的温度在 0-4 °C 范围内，迅速将斑马鱼转移到冰冷的水中，并在鳃盖运动停止后将它们在冰冷的水中保持至少 10 分钟^16，17,18.
3. 使用吸水纸擦干鱼表面多余的水。
4. 按照以下步骤在立体显微镜下解剖斑马鱼：
   1. 用微剪刀沿着鳃盖的后缘切掉头部;沿着泄殖腔切掉尾巴。将中间树干转移到含有 2 mL L-15 培养基（含 L-谷氨酰胺）的 35 mm 培养皿中。
   2. 在 L-15 培养基中解剖中间树干。沿腹部中轴线切开，去除内脏和鱼鳔。
      注意：斑马鱼的内脏是相连的。因此，捏住肛门区域附近的后肠并将其抬起，以轻松去除整个内脏肿块。
   3. 用镊子将双侧卵巢从腹部分离。去除附着在卵巢上的脂肪组织、鳞屑和其他身体组织。
      注意：卵巢被脂肪组织覆盖。因此，最好将它们一起移除，以避免对卵母细胞造成机械损伤。
      注意： 小心处理镊子，以免受伤。

2. 消化

1. 将卵巢转移到含有 2 mL Kinger 细胞解离溶液的 6 孔板中，并在 28.5 °C 下孵育 2-3 小时。 每 30 分钟摇动一次 6 孔板以促进分散。
   注意：使用镊子将卵巢分离成小组织块，以增强消化效率。消化时间是可变的;定期监测并在立体显微镜下散布大量 I 期卵母细胞时终止该过程。Kinger 细胞解离溶液是工作溶液，可以直接使用。包装后可在 −20 °C 下稳定储存，使用前在低温 （4 °C） 下解冻。
2. 将预热于 28.5 °C 的 L-15 培养基添加到消化缓冲液中以停止消化。

3. 过滤

1. 将 100 μm 细胞过滤器放入 6 孔板的另一个孔中，加入 L-15 培养基，并确保培养基水平高于过滤器。
   注意：I 期卵母细胞的理论直径小于 140 μm。然而，直径较大的卵母细胞仍可能通过细胞过滤器。因此，在此步骤中选择了直径小于目标的细胞过滤器。网孔大小可根据具体的实验需求进行调整。
2. 使用移液管将消化培养基吸过细胞过滤器。等待 1-2 分钟，直到所有 I 期卵母细胞都通过过滤器，然后将其取出。确保卵母细胞在整个转移过程中保持在液体中。
   注：将卵母细胞保存在培养基中有助于保持其完整性和最佳状态。如果卵母细胞长时间暴露在空气中，它们可能会变干并损坏，从而影响最终的分离效率。通过细胞过滤器转移卵母细胞时，将移液管保持在液体表面以下，而不是以悬浮方式添加它们。

4. 洗涤

1. 使用移液管去除多余的培养基。加入 4 mL 新鲜的 L-15 培养基，轻轻重悬卵母细胞。等待 1-2 分钟，然后去除上清液。
   注意：使用粘附性能低的器械，以防止对卵母细胞造成损伤。
2. 重复步骤 4.1 5-6 次，直到不存在其他杂质。
   注意：洗涤过程中的轻柔处理对于避免卵母细胞损伤至关重要。尽管在前面的洗涤步骤之后获得了丰富的 I 期卵母细胞（一条斑马鱼大约有 200-400 个第 I 期卵母细胞），但卵母细胞仍可能与细胞碎片、来自其他阶段的卵母细胞或由破碎的晚期卵母细胞形成的小颗粒混合。此外，由于酶消化不完全，一些颗粒细胞可能仍会粘附在几个卵母细胞的表面。因此，对于需要更高纯度的应用，例如基因组测序，需要额外的步骤来选择完全干净的卵母细胞。要解决此问题，请继续执行步骤 5 和 6。

5. 质量控制的选择

1. 将洗涤后的 I 期卵母细胞转移到含有新鲜 L-15 培养基的 35 mm 培养皿中。
2. 在放大倍数等于或超过 10 倍的显微镜下，使用可以精确操作的工具（例如钝性注射针）去除细胞碎片、其他阶段的卵母细胞和粘附在颗粒细胞中的 I 期卵母细胞。
   注意：此步骤需要实验者的耐心，但它可以确保分离干净和完整的卵母细胞。
   注意： 小心处理注射针头，以免受伤。

6. 通过细胞核染色确认

注：为了进一步细化分离的卵母细胞，采用 Hoechst 33342 染色来识别和去除粘附在上一步中可能遗漏的颗粒细胞的单个卵母细胞。

1. 向 L-15 培养基中加入终浓度为 5 μg/mL 的 Hoechst 33342，并在室温下孵育 10 分钟。
2. 在紫外激光激发下通过荧光显微镜观察 Hoechst 荧光。
   注：Hoechst 通常在紫外区域激发，波长通常在 310 至 360 nm 之间。在此过程中，建议使用 80 倍到 100 倍之间的放大倍率。采用自动曝光模式。激发波长和曝光时间可以根据特定的显微镜型号和个体要求进行调整。
3. 使用针头，小心挑选出不符合所需标准的卵母细胞。
   注意：当观察细胞时，卵母细胞中心存在一个大的核染色质。如果颗粒细胞粘附在卵母细胞上，则可以看到小而亮的细胞核，附着在卵母细胞的边缘（图 3）。在显微镜下挑选它们。
4. 用 L-15 彻底反复洗涤卵母细胞以去除多余的 Hoechst。
5. 直接使用鉴定出的 I 期卵母细胞进行后续提取，或在液氮中快速冷冻后将其储存在 -80 °C 下。
   注意： 处理液氮和超低温冰箱时，请佩戴防护面罩和低温手套。

结果

图 1 说明了在成年和幼年斑马鱼中观察到的卵巢形态，展示了处于不同发育阶段的卵母细胞作为参考。 图 1A 提供了每个发育阶段卵母细胞形态和大小的图形表示，从初级生长阶段（I 期）开始，到排卵卵（V 期）结束。 图 1Ai-v 说明了对应于卵母细胞 I 至 V 阶段的直径。 图 1B （左图）显示了...

讨论

在这项研究中，我们开发了一种分离纯干净的 I 期卵母细胞（不包括颗粒细胞）用于下游分析（特别是基因组分析）的方法。将这种修改后的方法与参考方法¹³ 进行比较，使用该方法获得的 I 期卵母细胞形态完整，数量充足，并且不受其他体细胞的污染，使其适用于各种后续研究和分析。此外，与其他机械分离方法^14,15

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kinger's cell dissociation solution	PlantChemMed	PC-33689	Kinger's cell dissociation solution can be stored stably at -20 °C after packaging and can be used after thawing at low temperature (4 °C). It can be used directly for dissociating zebrafish ovaries. The optimal temperature is 28.5 °C, for approximately 2-3 hours. The duration can be adjusted according to the specific dissociation conditions, either shortened or extended (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689).
Cell strainers (100 μm )	Falcon	352360
Fluorescence microscope	Zeiss	Axio Zoom.V16
Forceps	Dumont	#5
Glass capillary needle	/	/	Blunted by burning with lighter
Hoechst	Yesen	40732ES03
Low adsorption pipette tips (10 μl )	Labsellect	T-0010-LR-R-S
Leibovitz’s L-15 medium medium (with L-glutamine)	Hyclone	SH30525.01
Ice bucket	/	/	Ice-cold water is used to euthanize zebrafish
Incubator	WIGGENS	WH-01
Juvenile fish	/	/	5–6 weeks post-fertilization, standard length [SL] of 10–15 mm
Plastic dish (35 mm )	SORFA	230101
Stereomicroscope	Motic	SMZ-161
Tissue Culture Plate (6-wells)	SORFA	0110006
Vannas spring scissors	Fine Science Toosl	#15000-00