Isolamento rápido de oócitos estágio I em peixe-zebra desprovido de células da granulosa

Resumo

Este protocolo descreve um procedimento modificado para isolar rapidamente oócitos limpos em estágio I em peixe-zebra desprovido de células da granulosa, fornecendo assim um método conveniente para pesquisa específica de oócitos.

Resumo

O estudo do desenvolvimento do oócito tem implicações significativas na biologia do desenvolvimento. O peixe-zebra (Danio rerio) tem sido amplamente utilizado como organismo modelo para investigar processos iniciais de desenvolvimento do oócito ao embrião. No peixe-zebra, os oócitos são circundados por uma única camada de células somáticas da granulosa. No entanto, separar as células da granulosa dos oócitos representa um desafio, pois obter oócitos puros é crucial para uma análise precisa. Embora vários métodos tenham sido propostos para isolar oócitos de peixe-zebra em diferentes estágios de desenvolvimento, as técnicas atuais são insuficientes na remoção completa das células da granulosa, limitando a precisão da análise do genoma focada apenas em oócitos. Neste estudo, desenvolvemos com sucesso um processo rápido e eficiente para isolar oócitos puros em estágio I em peixe-zebra, eliminando a contaminação das células da granulosa. Esta técnica facilita a análise bioquímica e molecular, particularmente na exploração de aspectos epigenéticos e de estrutura genômica específicos dos oócitos. Notavelmente, o método é fácil de usar, minimiza os danos aos oócitos e fornece uma solução prática para pesquisas e análises subsequentes.

Introdução

O peixe-zebra está entre os sistemas modelo mais importantes na biologia do desenvolvimento. Nos últimos anos, vários estudos utilizaram o peixe-zebra como modelo para estudar eventos biológicos importantes e processos regulatórios do oócito ao embrião. Estes abrangem os intrincados processos de desenvolvimento e maturação do oócito¹, a funcionalidade dos genes maternos², a regulação das transições materno-zigóticas³ e extensas análises ômicas⁴.

As células da granulosa, as células somáticas que envolvem e nutrem o oócito em desenvolvimento dentro do folículo ovariano ^5,6, desempenham um papel fundamental nesse processo de desenvolvimento. À medida que as células germinativas primordiais (PGCs) evoluem para oogônias, elas se tornam cercadas por uma monocamada de células da granulosa⁷. Juntamente com as células tecais externas, o oócito e as células da granulosa circundantes constituem um folículo maduro⁸. Dada a distinção fundamental entre células germinativas e células somáticas, a obtenção de uma amostra de oócito puro é imperativa, especialmente para análises relacionadas ao genoma.

Dentro da estrutura folicular do peixe-zebra, as células da granulosa normalmente exibem um diâmetro de apenas alguns mícrons⁸, enfatizando a interconexão íntima entre as células da granulosa e os oócitos⁹. Essa estreita associação representa um desafio para alcançar a separação completa devido à diferença considerável no número e volume de células da granulosa versus oócitos (centenas de células da granulosa em comparação com um único oócito)^10,11. Mesmo a contaminação mínima com uma única célula da granulosa pode impedir as análises a jusante direcionadas especificamente aos oócitos. Portanto, para estudos com foco em características genômicas e epigenéticas, a eliminação das células da granulosa é essencial.

Beneficiando-se de critérios morfológicos bem caracterizados, os oócitos em cada estágio podem ser distinguidos com base no diâmetro¹¹. O processo de oogênese no peixe-zebra é categorizado em cinco estágios de acordo com a morfologia e cariótipo¹¹. Os oócitos do estágio I (7-140 μm de diâmetro) abrangem oócitos desde o início da meiose até o estágio inicial da meiose I. Crucialmente, esses oócitos são transparentes, permitindo a observação do núcleo central através da luz transmitida (Figura 1Ai). Os oócitos do estágio II (140-340 μm de diâmetro) tornam-se gradualmente espumosos e translúcidos. Com o aumento dos folículos e a proliferação de alvéolos corticais, as vesículas germinativas no centro tornam-se difíceis de distinguir¹² (Figura 1Aii). Os oócitos em estágio III (340-690 μm de diâmetro) acumulam progressivamente vitelogenina e os folículos frescos tornam-se cada vez mais opacos (Figura 1Aiii). A meiose continua nos oócitos do estágio IV (690-730 μm de diâmetro) à medida que os cromossomos entram no meio da meiose II, onde estagnam (Figura 1Aiv). Os oócitos em estágio V (730-750 μm de diâmetro) amadureceram e estão prontos para a ovulação ^7,11 (Figura 1Av).

Com base nas características únicas de cada um dos estágios acima mencionados, foi proposto um método para isolar oócitos dos estágios I a III digerindo ovários de peixe-zebra usando uma solução digestiva contendo colagenase I, colagenase II e hialuronidase, seguida de filtração através de um filtro de células de tamanho específico¹³. No entanto, embora esse método permita a obtenção de oócitos em diferentes estágios de desenvolvimento, ele não consegue separar completamente os oócitos e as células da granulosa. Outros pesquisadores também sugeriram métodos para separar as células da granulosa dos oócitos. No entanto, esses métodos dependem principalmente de abordagens mecânicas, que podem causar danos aos oócitos, são demorados e inadequados para a obtenção de um número substancial de oócitos para análise^14,15.

Dadas as limitações dos métodos existentes e os requisitos específicos de pesquisa, este estudo tem como objetivo estabelecer um procedimento para separar completamente oócitos e células da granulosa e obter um número suficiente de oócitos limpos em estágio I para análise. Expandindo o método referenciado¹³, empregamos um tampão de digestão aprimorado (ver Tabela de Materiais) que é mais suave e facilita a dispersão de oócitos e a dissociação das células da granulosa. Posteriormente, os oócitos são passados por um filtro de células, seguido de lavagem e posterior seleção microscópica, permitindo a aquisição de um grande número de oócitos limpos em estágio I.

Protocolo

Todos os peixes-zebra foram manuseados seguindo diretrizes rigorosas de cuidados com os animais delineadas pelos órgãos nacionais e/ou locais de bem-estar animal relevantes. A manutenção e o manuseio de peixes receberam aprovação das autoridades locais e do comitê de ética animal do Hospital da China Ocidental da Universidade de Sichuan (aprovação nº 20220422003). Os ovários do peixe-zebra contêm uma mistura de oócitos de vários estágios, com cada estágio de desenvolvimento presente nos ovários adultos do peixe-zebra. No entanto, os peixes-zebra juvenis foram selecionados para este estudo devido à dominância de oócitos em estágio avançado (estágio II-III) nos ovários de peixes adultos, que são grandes e opacos. Em contraste, os juvenis têm ovários planos e alongados, consistindo principalmente de oócitos em estágio I (Figura 1B) (Figura 1B). Pesquisas anteriores demonstraram que as características morfológicas da oogênese precoce em peixes-zebra adultos e juvenis são altamente consistentes, apoiando a viabilidade da utilização de peixes-zebra juvenis¹³. Os procedimentos descritos abaixo, descritos na Figura 2, fornecem uma descrição detalhada do processo de isolamento, desde a dissecção até a obtenção de oócitos limpos em estágio I. Para referência adicional, os reagentes, tampões e equipamentos utilizados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Dissecção do ovário

1. Selecione várias fêmeas de peixe-zebra com um comprimento padrão (SL) variando de 10 mm a 15 mm.
   NOTA: O SL, medido do focinho até a base da cauda em milímetros, serve como um critério confiável para selecionar peixes apropriados. Recomenda-se o uso de peixes juvenis entre 5 e 7 semanas pós-fertilização (wpf) com um SL variando de 10 mm a 15 mm para este procedimento. Os ovários dos juvenis de peixe-zebra são predominantemente ocupados por oócitos precoces, proporcionando condições ideais para a obtenção fácil de oócitos em estágio I (Figura 1B).
2. Eutanasiar as fêmeas juvenis colocando-as em água gelada (0-4 °C).
   NOTA: Os seguintes procedimentos devem ser realizados para garantir a eutanásia e minimizar a dor sentida pelo peixe-zebra durante a eutanásia: confirmar se a temperatura da água gelada está dentro da faixa de 0-4 °C usando um termômetro, transferir rapidamente o peixe-zebra para a água gelada e mantê-lo na água gelada por pelo menos 10 minutos após a cessação do movimento opercular^{16, 17,18}.
3. Seque o excesso de água na superfície do peixe usando papel absorvente.
4. Disseque o peixe-zebra sob um estereomicroscópio seguindo estas etapas:
   1. Corte a cabeça com uma microtesoura ao longo da margem posterior da cobertura branquial; Corte a cauda ao longo da cloaca. Transfira o tronco médio para uma placa de 35 mm contendo 2 mL de meio L-15 (com L-glutamina).
   2. Dissecar o tronco médio no meio L-15. Corte ao longo do eixo central do abdômen e remova as vísceras e a bexiga natatória.
      NOTA: As vísceras do peixe-zebra estão conectadas. Portanto, aperte o intestino posterior próximo à região anal e levante-o para remover facilmente toda a massa visceral.
   3. Separe os ovários bilaterais do abdômen usando uma pinça. Remova o tecido adiposo, escamas e outros tecidos do corpo ligados ao ovário.
      NOTA: Os ovários são cobertos por tecido adiposo. Portanto, é melhor removê-los juntos para evitar danos mecânicos aos oócitos.
      CUIDADO: Manuseie as pinças com cuidado para evitar ferimentos.

2. Digestão

1. Transfira os ovários para uma placa de 6 poços contendo 2 mL de solução de dissociação de células de Kinger e incube por 2-3 h a 28,5 ° C. Agite a placa de 6 poços a cada 30 minutos para promover a dispersão.
   NOTA: Use uma pinça para separar os ovários em pequenos blocos de tecido para aumentar a eficácia da digestão. O tempo de digestão é variável; monitore regularmente e termine o processo quando um número significativo de oócitos do estágio I estiver espalhado sob o estereomicroscópio. A solução de dissociação de células de Kinger é a solução de trabalho e pode ser usada diretamente. Pode ser armazenado de forma estável a -20 °C após a embalagem e descongelado a baixa temperatura (4 °C) antes do uso.
2. Adicione o meio L-15 pré-aquecido a 28,5 °C ao tampão de digestão para interromper a digestão.

3. Filtração

1. Coloque um filtro de células de 100 μm em outro poço da placa de 6 poços, adicione meio L-15 e certifique-se de que o nível do meio seja maior que o filtro.
   NOTA: O diâmetro teórico dos oócitos em estádio I é inferior a 140 μm. No entanto, oócitos com diâmetros maiores ainda podem passar pelo filtro celular. Portanto, um filtro de células com um diâmetro menor que o alvo foi selecionado nesta etapa. As malhagens podem ser ajustadas dependendo das necessidades experimentais específicas.
2. Passe o meio digestivo pelo filtro de células usando uma pipeta. Aguarde 1-2 minutos até que todos os oócitos do estágio I tenham passado pelo filtro e, em seguida, remova-o. Certifique-se de que os oócitos permaneçam no líquido durante todo o processo de transferência.
   NOTA: Manter os oócitos no meio ajuda a manter sua integridade e condição ideal. Se os oócitos forem expostos ao ar por um longo período, eles podem secar e ser danificados, afetando a eficiência da separação final. Mantenha a pipeta abaixo da superfície do líquido ao transferir os oócitos através do filtro de células, em vez de adicioná-los de maneira suspensa.

4. Lavagem

1. Remova o excesso de meio usando uma pipeta. Adicione 4 mL de meio L-15 fresco e ressuspenda suavemente os oócitos. Aguarde 1-2 min e remova o sobrenadante.
   NOTA: Use instrumentos com propriedades de baixa adesão para evitar danos aos oócitos.
2. Repita a etapa 4.1 5-6 vezes até que nenhuma outra impureza esteja presente.
   NOTA: O manuseio cuidadoso durante o processo de lavagem é crucial para evitar danos aos oócitos. Apesar de obter uma abundância de oócitos em estágio I (aproximadamente 200-400 oócitos em estágio I de um peixe-zebra) após as etapas de lavagem anteriores, os oócitos ainda podem ser misturados com fragmentos de células, oócitos de outros estágios ou pequenos grânulos formados por oócitos quebrados em estágio avançado. Além disso, algumas células da granulosa ainda podem aderir à superfície de vários oócitos devido à digestão enzimática incompleta. Portanto, para aplicações que exigem um nível mais alto de pureza, como sequenciamento do genoma, etapas adicionais são necessárias para selecionar oócitos completamente limpos. Para resolver isso, prossiga para as etapas 5 e 6.

5. Seleção para controle de qualidade

1. Transferir os ovócitos lavados da fase I para uma cápsula de 35 mm contendo meio L-15 fresco.
2. Sob um microscópio com aumento igual ou superior a 10x, remova fragmentos de células, oócitos de outros estágios e oócitos de estágio I aderidos por células da granulosa usando uma ferramenta que pode ser manipulada com precisão, como uma agulha de injeção romba.
   NOTA: Esta etapa requer paciência do experimentador, mas garante o isolamento de oócitos limpos e intactos.
   CUIDADO: Manuseie as agulhas de injeção com cuidado para evitar ferimentos.

6. Confirmação por coloração nuclear

NOTA: Para posterior refinamento dos oócitos isolados, a coloração com Hoechst 33342 foi empregada para identificar e remover oócitos individuais aderidos com células da granulosa que podem ter sido perdidos na etapa anterior.

1. Adicionar uma concentração final de 5 μg/ml Hoechst 33342 ao meio L-15 e incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
2. Observe a fluorescência de Hoechst através de um microscópio de fluorescência sob excitação a laser UV.
   NOTA: Hoechst é tipicamente excitado na região ultravioleta, geralmente em comprimentos de onda entre 310 e 360 nm. Recomenda-se usar uma ampliação entre 80x e 100x durante este processo. Empregue o modo de exposição automática. O comprimento de onda de excitação e o tempo de exposição podem ser ajustados com base no modelo específico do microscópio e nos requisitos individuais.
3. Usando uma agulha, escolha cuidadosamente os oócitos que não atendem aos critérios desejados.
   NOTA: Ao visualizar as células, uma grande cromatina nuclear está presente no centro do oócito. Se as células da granulosa estivessem aderidas ao oócito, núcleos pequenos e brilhantes seriam visíveis, agarrados à borda do oócito (Figura 3). Escolha-os ao microscópio.
4. Lave completa e repetidamente os ovócitos com L-15 para remover o excesso de Hoechst.
5. Use os oócitos de estágio I identificados diretamente para extração subsequente ou armazene-os a -80 ° C após congelamento instantâneo em nitrogênio líquido.
   CUIDADO: Use uma máscara protetora e luvas criogênicas ao manusear nitrogênio líquido e freezers de temperatura ultrabaixa.

Resultados

A Figura 1 ilustra a morfologia ovariana observada em peixes-zebra adultos e juvenis, apresentando oócitos em diferentes estágios de desenvolvimento para servir de referência. A Figura 1A fornece uma representação gráfica da morfologia e tamanho do oócito em cada estágio de desenvolvimento, começando com o estágio primário de crescimento (estágio I) e terminando com o óvulo ovulado (estágio V). As Figuras 1...

Discussão

Neste estudo, desenvolvemos um método para isolar oócitos puros e limpos em estágio I, excluindo células da granulosa, para análise a jusante (particularmente análises genômicas). Comparando este método modificado com o método referenciado¹³, os oócitos do estádio I obtidos com este método estão morfologicamente intactos, em número suficiente e livres de contaminação com outras células somáticas, tornando-os adequados para vários estudos e anál...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kinger's cell dissociation solution	PlantChemMed	PC-33689	Kinger's cell dissociation solution can be stored stably at -20 °C after packaging and can be used after thawing at low temperature (4 °C). It can be used directly for dissociating zebrafish ovaries. The optimal temperature is 28.5 °C, for approximately 2-3 hours. The duration can be adjusted according to the specific dissociation conditions, either shortened or extended (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689).
Cell strainers (100 μm )	Falcon	352360
Fluorescence microscope	Zeiss	Axio Zoom.V16
Forceps	Dumont	#5
Glass capillary needle	/	/	Blunted by burning with lighter
Hoechst	Yesen	40732ES03
Low adsorption pipette tips (10 μl )	Labsellect	T-0010-LR-R-S
Leibovitz’s L-15 medium medium (with L-glutamine)	Hyclone	SH30525.01
Ice bucket	/	/	Ice-cold water is used to euthanize zebrafish
Incubator	WIGGENS	WH-01
Juvenile fish	/	/	5–6 weeks post-fertilization, standard length [SL] of 10–15 mm
Plastic dish (35 mm )	SORFA	230101
Stereomicroscope	Motic	SMZ-161
Tissue Culture Plate (6-wells)	SORFA	0110006
Vannas spring scissors	Fine Science Toosl	#15000-00