과립 세포가 없는 제브라피시에서 Stage I 난모세포의 신속한 분리

요약

이 프로토콜은 과립세포 세포가 없는 제브라피시에서 깨끗한 I기 난모세포를 신속하게 분리하기 위한 수정된 절차를 설명하여 난모세포별 연구를 위한 편리한 방법을 제공합니다.

초록

난모세포 발달에 대한 연구는 발달 생물학에서 중요한 의미를 지닙니다. 제브라피시(Danio rerio)는 난모세포에서 배아까지의 초기 발달 과정을 조사하기 위한 모델 유기체로 광범위하게 사용되었습니다. 제브라피시에서 난모세포는 체세포 과립세포(somatic granulosa cell)의 단일 층으로 둘러싸여 있습니다. 그러나 정확한 분석을 위해서는 순수한 난모세포를 얻는 것이 중요하기 때문에 난모세포에서 과립세포를 분리하는 것은 어려운 일입니다. 다양한 발달 단계에서 제브라피시 난모세포를 분리하기 위한 다양한 방법이 제안되었지만, 현재의 기술로는 과립구 세포를 완전히 제거하기에는 부족하여 난모세포에만 초점을 맞춘 게놈 분석의 정확도가 제한됩니다. 이 연구에서 우리는 제브라피시에서 순수 I기 난모세포를 분리하는 동시에 과립 세포 오염을 제거하는 빠르고 효율적인 프로세스를 성공적으로 개발했습니다. 이 기술은 생화학 및 분자 분석을 용이하게 하며, 특히 난모세포에 특이적인 후성유전학 및 게놈 구조 측면을 탐구하는 데 도움이 됩니다. 특히, 이 방법은 사용자 친화적이고, 난모세포 손상을 최소화하며, 후속 연구 및 분석을 위한 실용적인 솔루션을 제공합니다.

서문

제브라피쉬는 발달 생물학에서 가장 중요한 모델 시스템 중 하나입니다. 최근 몇 년 동안 수많은 연구에서 난모세포에서 배아에 이르기까지 중요한 생물학적 사건과 조절 과정을 연구하기 위한 모델로 제브라피시를 활용했습니다. 여기에는 난모세포의 발달과 성숙의 복잡한 과정¹, 모계 유전자의 기능², 모체-접합 전이의 조절^{3, 광범위한} 오믹스 분석⁴이 포함된다.

난소 난포^5,6 내에서 발달 중인 난모세포를 둘러싸고 육성하는 체세포인 과립세포는 이러한 발달 과정에서 중추적인 역할을 합니다. 원시 생식세포(primordial germ cell, PGCs)가 난자(oogonia)로 진화함에 따라, 이들은 과립세포(granulosa cell)의 단층(monolayer)으로 둘러싸이게 된다⁷. 외부 thecal cell과 함께, oocyte 및 그 주변의 과립 세포는 성숙한 난포를 구성한다⁸. 생식 세포와 체세포 사이의 근본적인 차이점을 감안할 때, 특히 게놈 관련 분석의 경우 순수한 난모세포 샘플을 얻는 것이 필수적입니다.

제브라피쉬의 여포 구조 내에서, 과립세포 세포는 전형적으로 직경이 수 미^크론에 불과하며8 이는 과립세포와 난모세포 사이의 긴밀한 상호 연결을 강조한다⁹. 이러한 밀접한 연관성은 과립구 세포와 난모세포의 수와 부피가 모두 상당한 차이(단일 난모세포에 비해 수백 개의 과립세포)로 인해 완전한 분리를 달성하는 데 어려움을 초래합니다^10,11. 단일 과립 세포에 대한 최소한의 오염조차도 특히 난모세포를 표적으로 하는 다운스트림 분석을 방해할 수 있습니다. 따라서 게놈 및 후성유전학적 특성에 초점을 맞춘 연구에서는 과립종 세포를 제거하는 것이 필수적입니다.

잘 특성화된 형태학적 기준의 이점을 활용하여 각 단계의 난모세포는 직경¹¹을 기준으로 구별할 수 있습니다. 제브라피쉬의 난자형성 과정은 형태학과 핵형(^{karyotype) 11}에 따라 5단계로 분류된다. I기 난모세포(직경 7-140μm)는 감수분열 시작부터 감수분열 I의 초기 단계까지 난모세포를 포함하며, 결정적으로 이 난모세포는 투명하여 투과광을 통해 중심핵을 관찰할 수 있습니다(그림 1Ai). II기 난모세포(직경 140-340μm)는 점차 거품이 생기고 반투명해집니다. 난포가 커지고 대뇌 피질 폐포가 증식함에 따라 중앙의 생식 소포를 구별하기가 어려워집니다¹² (그림 1Aii). III기 난모세포(직경 340-690μm)는 점차 비텔로게닌을 축적하고 신선한 난포는 점점 불투명해집니다(그림 1Aiii). 감수분열은 IV기 난모세포(직경 690-730μm)에서 염색체가 II감수분열의 중앙으로 들어가 정체됨에 따라 계속됩니다(그림 1Aiv). V기 난모세포(직경 730-750μm)는 성숙하여 배란을 위한 준비가 되었습니다 ^7,11(그림 1Av).

앞서 언급한 각 단계의 고유한 특성을 바탕으로, 콜라겐분해효소 I, 콜라겐분해효소 II, 히알루로니다아제를 함유한 소화액을 사용하여 제브라피시 난소를 소화한 후 특정 크기의 세포 여과기를 통해 여과함으로써 난모세포를 I기에서 III기까지 분리하는 방법이 제안되었다(¹³). 그러나 이 방법을 사용하면 다양한 발달 단계에서 난모세포를 얻을 수 있지만 난모세포와 과립세포를 완전히 분리하지는 못합니다. 다른 연구자들은 또한 난모세포에서 과립세포를 분리하는 방법을 제안했습니다. 그러나 이러한 방법은 주로 기계적 접근법에 의존하는데, 이는 난모세포 손상을 유발할 수 있고, 시간이 많이 소요되며, 분석을 위해 상당한 수의 난모세포를 얻기에는 부적절하다^14,15.

기존 방법의 한계와 특정 연구 요구 사항을 감안할 때 이 연구는 난모세포와 과립세포를 철저히 분리하고 분석을 위한 충분한 수의 깨끗한 I 단계 난모세포를 얻는 절차를 확립하는 것을 목표로 합니다. 참조된 방법¹³을 확장하여, 우리는 더 부드럽고 난모세포의 분산과 과립구 세포의 해리를 촉진하는 개선된 소화 완충액( 재료 표 참조)을 사용합니다. 그 후, 난모세포는 세포 여과기를 통과한 후 세척 및 추가 현미경 선택을 거쳐 많은 수의 깨끗한 I기 난모세포를 얻을 수 있습니다.

프로토콜

모든 제브라피쉬는 관련 국가 및/또는 지역 동물 복지 기관에서 정한 엄격한 동물 관리 지침에 따라 처리되었습니다. 물고기의 유지 관리 및 처리는 지방 당국과 쓰촨 대학 서중국 병원 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호 20220422003). 제브라피시 난소에는 다단계 난모세포가 혼합되어 있으며, 각 발달 단계는 성인 제브라피시 난소에 존재합니다. 그러나 이 연구를 위해 어린 제브라피시를 선택한 이유는 성체 물고기의 난소에서 크고 불투명한 후기 단계 난모세포(II-III)가 우세하기 때문입니다. 대조적으로, 청소년은 주로 I기 난모세포로 구성된 편평하고 길쭉한 난소를 가지고 있습니다(그림 1B) (그림 1B). 이전 연구는 성체 및 어린 제브라피시에서 초기 난자형성의 형태학적 특징이 매우 일관됨을 보여주었으며, 이는 어린 제브라피시 활용의 타당성을 뒷받침한다¹³. 그림 2에 요약된 아래 설명된 절차는 절개에서 깨끗한 I기 난모세포를 얻는 것까지 분리 과정에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 추가 참조를 위해 연구에 사용된 시약, 완충액 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 난소 박리

1. 표준 길이(SL)가 10mm에서 15mm 사이인 암컷 제브라피시 여러 마리를 선택합니다.
   참고: 주둥이에서 꼬리 밑부분까지 밀리미터 단위로 측정된 SL은 적절한 물고기를 선택하기 위한 신뢰할 수 있는 기준 역할을 합니다. 이 절차를 위해 수정 후 5주에서 7주 사이(wpf)에 10mm에서 15mm 범위의 SL을 사용하는 것이 좋습니다. 어린 제브라피쉬의 난소는 주로 초기 난모세포가 차지하고 있어 I기 난모세포를 쉽게 얻을 수 있는 최적의 조건을 제공합니다(그림 1B).
2. 어린 암컷 물고기를 얼음처럼 차가운 물(0-4 °C)에 넣어 안락사시킵니다.
   참고: 안락사를 보장하고 안락사 중 제브라피쉬가 겪는 고통을 최소화하기 위해 다음 절차를 수행해야 합니다: 온도계를 사용하여 얼음-냉수의 온도가 0-4 °C 범위 내에 있는지 확인하고, 제브라피시를 얼음-냉수로 신속하게 옮기고, 수술 움직임이 멈춘 후 최소 10분 동안 얼음-냉수 속에 유지하십시오^{16, 17,18}.
3. 흡수성 종이를 사용하여 생선 표면의 과도한 물을 말리십시오.
4. 다음 단계에 따라 실체현미경으로 제브라피시를 해부합니다.
   1. 아가미 덮개의 뒤쪽 가장자리를 따라 마이크로 가위를 사용하여 머리를 자릅니다. 배설물을 따라 꼬리를 자릅니다. 중간 줄기를 2mL의 L-15 배지(L-글루타민 포함)가 들어 있는 35mm 접시에 옮깁니다.
   2. L-15 배지에서 중간 줄기를 절개합니다. 복부의 중심축을 따라 자르고 내장과 수영 방광을 제거합니다.
      참고: 제브라피쉬의 내장은 연결되어 있습니다. 따라서 항문 부위 근처의 뒷창자를 꼬집었다가 들어 올리면 내장 종괴 전체를 쉽게 제거할 수 있습니다.
   3. 핀셋을 사용하여 복부에서 양측 난소를 분리합니다. 난소에 부착된 지방 조직, 비늘 및 기타 신체 조직을 제거합니다.
      참고: 난소는 지방 조직으로 덮여 있습니다. 따라서 난모세포의 기계적 손상을 방지하기 위해 함께 제거하는 것이 가장 좋습니다.
      주의: 부상을 입지 않도록 핀셋을 주의해서 다루십시오.

2. 소화

1. 난소를 2mL의 Kinger's cell dissociation solution이 들어있는 6웰 플레이트로 옮기고 28.5°C에서 2-3시간 동안 배양합니다. 분산을 촉진하기 위해 6분마다 30웰 플레이트를 흔듭니다.
   참고: 소화 효능을 높이기 위해 핀셋을 사용하여 난소를 작은 조직 블록으로 분리하십시오. 소화 시간은 가변적입니다. 정기적으로 모니터링하고 상당한 수의 Stage I 난모세포가 실체현미경 아래에 흩어져 있을 때 과정을 종료합니다. Kinger의 세포 해리 용액은 작동하는 용액이며 직접 사용할 수 있습니다. 포장 후 -20 °C에서 안정적으로 보관할 수 있으며 사용 전에 저온(4 °C)에서 해동할 수 있습니다.
2. 28.5°C로 예열된 L-15 배지를 분해 완충액에 추가하여 분해를 중지합니다.

3. 여과

1. 100μm 셀 스트레이너를 6웰 플레이트의 다른 웰에 넣고 L-15 배지를 추가한 다음 배지 수준이 필터보다 높은지 확인합니다.
   참고: I기 난모세포의 이론적 직경은 140μm 미만입니다. 그러나 직경이 더 큰 난모세포는 여전히 세포 여과기를 통과할 수 있습니다. 따라서, 이 단계에서 타겟보다 작은 직경을 가진 cell strainer를 선택하였다. 메쉬 크기는 특정 실험 요구 사항에 따라 조정할 수 있습니다.
2. 피펫을 사용하여 세포 여과기를 통해 소화액을 끌어냅니다. 모든 단계 I 난모세포가 여과기를 통과할 때까지 1-2분 정도 기다렸다가 제거합니다. 전달 과정 전반에 걸쳐 난모세포가 액체에 남아 있는지 확인하십시오.
   참고: 난모세포를 배지에 유지하면 난모세포의 무결성과 최적의 상태를 유지하는 데 도움이 됩니다. 난모세포가 장기간 공기에 노출되면 건조되고 손상되어 최종 분리 효율에 영향을 미칠 수 있습니다. 세포 여과기를 통해 난모세포를 옮길 때 피펫을 부유 방식으로 추가하지 말고 액체 표면 아래에 유지하십시오.

4. 세탁

1. 피펫을 사용하여 과도한 매체를 제거합니다. 4mL의 신선한 L-15 배지를 넣고 난모세포를 부드럽게 부유시킵니다. 1-2분 정도 기다린 다음 상층액을 제거합니다.
   참고: 난모세포의 손상을 방지하기 위해 접착력이 낮은 기구를 사용하십시오.
2. 다른 불순물이 없을 때까지 4.1 단계를 5-6 번 반복합니다.
   알림: 세척 과정에서 부드럽게 다루는 것은 난모세포 손상을 방지하는 데 중요합니다. 이전 세척 단계를 따라 풍부한 I기 난모세포(제브라피시 한 마리에서 약 200-400개의 I기 난모세포)를 얻었음에도 불구하고 난모세포는 여전히 세포 조각, 다른 단계의 난모세포 또는 파괴된 말기 난모세포에 의해 형성된 작은 과립과 혼합될 수 있습니다. 또한 일부 과립 세포는 불완전한 효소 소화로 인해 여러 난모세포의 표면에 여전히 부착될 수 있습니다. 따라서 게놈 염기서열 분석과 같이 더 높은 수준의 순도를 요구하는 응용 분야의 경우 완전히 깨끗한 난모세포를 선택하기 위해 추가 단계가 필요합니다. 이 문제를 해결하려면 5단계와 6단계로 진행합니다.

5. 품질 관리를 위한 선택

1. 세척된 I 단계 난모세포를 신선한 L-15 배지가 들어 있는 35mm 접시에 옮깁니다.
2. 배율이 10배 이상인 현미경으로 뭉툭한 주사 바늘 등 정밀하게 조작할 수 있는 도구를 사용하여 과립 세포에 부착된 세포 조각, 다른 단계의 난모세포, I기 난모세포를 제거합니다.
   참고: 이 단계는 실험자의 인내심이 필요하지만 깨끗하고 손상되지 않은 난모세포의 분리를 보장합니다.
   주의: 주사 바늘은 부상을 입지 않도록 주의해서 다루십시오.

6. 핵 염색에 의한 확인

참고: 분리된 난모세포의 추가 정제를 위해 Hoechst 33342로 염색하여 이전 단계에서 놓쳤을 수 있는 과립구 세포에 부착된 개별 난모세포를 식별하고 제거했습니다.

1. 최종 농도 5μg/mL Hoechst 33342를 L-15 배지에 추가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다.
2. UV 레이저 여기 하에서 형광 현미경을 통해 Hoechst 형광을 관찰합니다.
   참고 : Hoechst는 일반적으로 310nm에서 360nm 사이의 파장에서 자외선 영역에서 여기됩니다. 이 과정에서 80배에서 100배 사이의 배율을 사용하는 것이 좋습니다. 자동 노출 모드를 사용합니다. 여기 파장과 노출 시간은 특정 현미경 모델 및 개별 요구 사항에 따라 조정할 수 있습니다.
3. 바늘을 사용하여 원하는 기준을 충족하지 않는 난모세포를 조심스럽게 골라냅니다.
   참고: 세포를 시각화할 때 큰 핵 염색질이 난모세포의 중앙에 존재합니다. 과립구 세포가 난모세포에 부착되어 있으면 작고 밝은 핵이 난모세포의 가장자리에 달라붙어 보일 수 있습니다(그림 3). 현미경으로 골라내십시오.
4. L-15로 난모세포를 철저하고 반복적으로 세척하여 과도한 Hoechst를 제거합니다.
5. 식별된 I기 난모세포를 후속 추출을 위해 직접 사용하거나 액체 질소에서 급속 동결 후 -80°C에서 보관합니다.
   주의: 액체 질소 및 초저온 냉동고를 취급할 때는 보호용 안면 마스크와 극저온 장갑을 착용하십시오.

결과

그림 1 은 성체 제브라피시와 어린 제브라피시에서 관찰된 난소 형태를 보여주며, 다양한 발달 단계의 난모세포를 보여주며 참고 자료로 사용할 수 있습니다. 그림 1A 는 1차 성장 단계(I단계)에서 시작하여 배란란자(V단계)까지 각 발달 단계에서 난모세포의 형태와 크기를 그래픽으로 표현한 것입니다. 그림 1Ai-v 는...

토론

이 연구에서는 다운스트림 분석(특히 게놈 분석)을 위해 과립세포를 제외한 순수하고 깨끗한 I기 난모세포를 분리하는 방법을 개발했습니다. 이 수정된 방법을 참조된 방법¹³과 비교하면, 이 방법을 사용하여 얻은 I기 난모세포는 형태학적으로 온전하고 수가 충분하며 다른 체세포와의 오염이 없어 다양한 후속 연구 및 분석에 적합합니다. 더욱이, 다른 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kinger's cell dissociation solution	PlantChemMed	PC-33689	Kinger's cell dissociation solution can be stored stably at -20 °C after packaging and can be used after thawing at low temperature (4 °C). It can be used directly for dissociating zebrafish ovaries. The optimal temperature is 28.5 °C, for approximately 2-3 hours. The duration can be adjusted according to the specific dissociation conditions, either shortened or extended (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689).
Cell strainers (100 μm )	Falcon	352360
Fluorescence microscope	Zeiss	Axio Zoom.V16
Forceps	Dumont	#5
Glass capillary needle	/	/	Blunted by burning with lighter
Hoechst	Yesen	40732ES03
Low adsorption pipette tips (10 μl )	Labsellect	T-0010-LR-R-S
Leibovitz’s L-15 medium medium (with L-glutamine)	Hyclone	SH30525.01
Ice bucket	/	/	Ice-cold water is used to euthanize zebrafish
Incubator	WIGGENS	WH-01
Juvenile fish	/	/	5–6 weeks post-fertilization, standard length [SL] of 10–15 mm
Plastic dish (35 mm )	SORFA	230101
Stereomicroscope	Motic	SMZ-161
Tissue Culture Plate (6-wells)	SORFA	0110006
Vannas spring scissors	Fine Science Toosl	#15000-00