과립 세포가 없는 제브라피시에서 Stage I 난모세포의 신속한 분리

요약

이 프로토콜은 과립세포 세포가 없는 제브라피시에서 깨끗한 I기 난모세포를 신속하게 분리하기 위한 수정된 절차를 설명하여 난모세포별 연구를 위한 편리한 방법을 제공합니다.

초록

난모세포 발달에 대한 연구는 발달 생물학에서 중요한 의미를 지닙니다. 제브라피시(Danio rerio)는 난모세포에서 배아까지의 초기 발달 과정을 조사하기 위한 모델 유기체로 광범위하게 사용되었습니다. 제브라피시에서 난모세포는 체세포 과립세포(somatic granulosa cell)의 단일 층으로 둘러싸여 있습니다. 그러나 정확한 분석을 위해서는 순수한 난모세포를 얻는 것이 중요하기 때문에 난모세포에서 과립세포를 분리하는 것은 어려운 일입니다. 다양한 발달 단계에서 제브라피시 난모세포를 분리하기 위한 다양한 방법이 제안되었지만, 현재의 기술로는 과립구 세포를 완전히 제거하기에는 부족하여 난모세포에만 초점을 맞춘 게놈 분석의 정확도가 제한됩니다. 이 연구에서 우리는 제브라피시에서 순수 I기 난모세포를 분리하는 동시에 과립 세포 오염을 제거하는 빠르고 효율적인 프로세스를 성공적으로 개발했습니다. 이 기술은 생화학 및 분자 분석을 용이하게 하며, 특히 난모세포에 특이적인 후성유전학 및 게놈 구조 측면을 탐구하는 데 도움이 됩니다. 특히, 이 방법은 사용자 친화적이고, 난모세포 손상을 최소화하며, 후속 연구 및 분석을 위한 실용적인 솔루션을 제공합니다.

서문

제브라피쉬는 발달 생물학에서 가장 중요한 모델 시스템 중 하나입니다. 최근 몇 년 동안 수많은 연구에서 난모세포에서 배아에 이르기까지 중요한 생물학적 사건과 조절 과정을 연구하기 위한 모델로 제브라피시를 활용했습니다. 여기에는 난모세포의 발달과 성숙의 복잡한 과정¹, 모계 유전자의 기능², 모체-접합 전이의 조절^{3, 광범위한} 오믹스 분석⁴이 포함된다.

난소 난포^5,6 내에서 발달 중인 난모세포를 둘러싸고 육성하는 체세포인 과립세포는 이러한 발달 과정에서 중추적인 역할을 합니다. 원시 생식세포(primordial germ cell, PGCs)가 난자(oogonia)로 진화함에 따라, 이들은 과립세포(granulosa cell)의 단층(monolayer)으로 둘러싸이게 된다⁷. 외부 thecal cell과 함께, oocyte 및 그 주변의 과립 세포는 성숙한 난포를 구성한....

프로토콜

모든 제브라피쉬는 관련 국가 및/또는 지역 동물 복지 기관에서 정한 엄격한 동물 관리 지침에 따라 처리되었습니다. 물고기의 유지 관리 및 처리는 지방 당국과 쓰촨 대학 서중국 병원 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호 20220422003). 제브라피시 난소에는 다단계 난모세포가 혼합되어 있으며, 각 발달 단계는 성인 제브라피시 난소에 존재합니다. 그러나 이 연구를 위해 어린 제브라피시를 선택한 이유는 성체 물고기의 난소에서 크고 불투명한 후기 단계 난모세포(II-III)가 우세하기 때문입니다. 대조적으로, 청소년은 주로 I기 난모세포로 구성된 편평하고 길쭉한 난소를 가지고 있습니다(그림 1B) (그림 1B). 이전 연구는 성체 및 어린 제브라피시에서 초기 난자형성의 형태학적 특징이 매우 일관됨을 보여주었으며, 이는 어린 제브라피시 활용의 타당성을 뒷받침한다¹³. 그림 2에 요약된 아래 설명된 절차는 절개에서 깨끗한 I기 난모세포를 얻는 것까지 분리 과정에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 추가 참조를 위해 연구에 사용된 ....

토론

이 연구에서는 다운스트림 분석(특히 게놈 분석)을 위해 과립세포를 제외한 순수하고 깨끗한 I기 난모세포를 분리하는 방법을 개발했습니다. 이 수정된 방법을 참조된 방법¹³과 비교하면, 이 방법을 사용하여 얻은 I기 난모세포는 형태학적으로 온전하고 수가 충분하며 다른 체세포와의 오염이 없어 다양한 후속 연구 및 분석에 적합합니다. 더욱이, 다른 .......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kinger's cell dissociation solution	PlantChemMed	PC-33689	Kinger's cell dissociation solution can be stored stably at -20 °C after packaging and can be used after thawing at low temperature (4 °C). It can be used directly for dissociating zebrafish ovaries. The optimal temperature is 28.5 °C, for approximately 2-3 hours. The duration can be adjusted according to the specific dissociation conditions, either shortened or extended (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689).
Cell strainers (100 μm )	Falcon	352360
Fluorescence microscope	Zeiss	Axio Zoom.V16
Forceps	Dumont	#5
Glass capillary needle	/	/	Blunted by burning with lighter
Hoechst	Yesen	40732ES03
Low adsorption pipette tips (10 μl )	Labsellect	T-0010-LR-R-S
Leibovitz’s L-15 medium medium (with L-glutamine)	Hyclone	SH30525.01
Ice bucket	/	/	Ice-cold water is used to euthanize zebrafish
Incubator	WIGGENS	WH-01
Juvenile fish	/	/	5–6 weeks post-fertilization, standard length [SL] of 10–15 mm
Plastic dish (35 mm )	SORFA	230101
Stereomicroscope	Motic	SMZ-161
Tissue Culture Plate (6-wells)	SORFA	0110006
Vannas spring scissors	Fine Science Toosl	#15000-00