Быстрое выделение ооцитов I стадии у рыбок данио-рерио, лишенных гранулезных клеток

Резюме

Этот протокол описывает модифицированную процедуру быстрого выделения чистых ооцитов стадии I у рыбок данио, лишенных гранулезных клеток, тем самым обеспечивая удобный метод для исследования, специфичного для ооцитов.

Аннотация

Изучение развития ооцитов имеет важное значение для биологии развития. Данио рерио (Danio rerio) широко использовалась в качестве модельного организма для исследования ранних процессов развития от ооцита до эмбриона. У рыбок данио ооциты окружены одним слоем соматических гранулезных клеток. Тем не менее, отделение гранулезных клеток от ооцитов представляет собой сложную задачу, поскольку получение чистых ооцитов имеет решающее значение для точного анализа. Несмотря на то, что были предложены различные методы выделения ооцитов данио-рерио на разных стадиях развития, современные методы не позволяют полностью удалить гранулезные клетки, что ограничивает точность анализа генома, сосредоточенного исключительно на ооцитах. В этом исследовании мы успешно разработали быстрый и эффективный процесс выделения чистых ооцитов I стадии у рыбок данио-рерио с одновременным устранением загрязнения гранулезных клеток. Этот метод облегчает биохимический и молекулярный анализ, особенно при изучении эпигенетических аспектов и структуры генома, специфичных для ооцитов. Примечательно, что метод удобен в использовании, сводит к минимуму повреждение ооцитов и обеспечивает практическое решение для последующих исследований и анализов.

Введение

Рыбки данио рерио являются одной из наиболее важных модельных систем в биологии развития. В последние годы в многочисленных исследованиях рыбки данио использовались в качестве модели для изучения важных биологических событий и регуляторных процессов от ооцита до эмбриона. Они охватывают сложные процессы развития и^{созревания} ооцитов1, функциональность материнских^генов2, регуляцию материнско-зиготических^{переходов3}, а также обширный омиксный^{анализ4.}

Гранулезные клетки, соматические клетки, обволакивающие и питающие развивающийся ооцит в фолликуле яичника ^5,6, играют ключевую роль в этом процессе развития. По мере того, как первичные половые клетки (ПГК) эволюционируют в оогонию, они оказываются окружены монослоем гранулезных клеток⁷. Вместе с внешними текальными клетками ооцит и окружающие его гранулезные клетки образуют зрелый фолликул⁸. Учитывая фундаментальное различие между половыми клетками и соматическими клетками, получение чистого образца ооцитов является обязательным условием, особенно для анализов, связанных с геномом.

В фолликулярной структуре рыбок данио гранулеза обычно имеют диаметр всего в^{несколько микрон8}, что подчеркивает тесную взаимосвязь между гранулезными клетками и ооцитами9. Эта тесная связь представляет собой проблему для достижения полного разделения из-за значительной разницы как в количестве, так и в объеме гранулезных клеток по сравнению с ооцитами (сотни гранулезных клеток по сравнению с одним ооцитом)^10,11. Даже минимальное загрязнение одной гранулезной клеткой может препятствовать последующему анализу, специально нацеленному на ооциты. Поэтому для исследований, посвященных геномным и эпигенетическим характеристикам, элиминация гранулезных клеток имеет важное значение.

Благодаря хорошо охарактеризованным морфологическим критериям ооциты на каждой стадии могут быть различимы на основе диаметра¹¹. Процесс оогенеза у рыбок данио делится на пять стадий в соответствии с морфологией и кариотипом¹¹. Ооциты I стадии (диаметр 7-140 мкм) охватывают ооциты с начала мейоза до ранней стадии мейоза I. Важно отметить, что эти ооциты прозрачны, что позволяет наблюдать центральное ядро через проходящий свет (рис. 1Ai). Ооциты II стадии (диаметр 140-340 мкм) постепенно становятся пенистыми и полупрозрачными. При увеличении фолликулов и разрастании кортикальных альвеол зародышевые пузырьки в центре становится трудно различить¹² (рисунок 1Aii). Ооциты III стадии (диаметр 340-690 мкм) постепенно накапливают вителлогенин, и свежие фолликулы становятся все более непрозрачными (рисунок 1Aiii). Мейоз продолжается в ооцитах IV стадии (690-730 мкм в диаметре), поскольку хромосомы входят в середину мейоза II, где они застаиваются (Рисунок 1Aiv). Ооциты стадии V (диаметр 730-750 мкм) созрели и готовы к овуляции ^7,11 (рис. 1Av).

Основываясь на уникальных характеристиках каждой из вышеупомянутых стадий, был предложен способ выделения ооцитов от стадий I до III путем переваривания яичников данио рерио с использованием пищеварительного раствора, содержащего коллагеназу I, коллагеназу II и гиалуронидазу, с последующей фильтрацией через клеточное сетчатое фильтр определенного размера¹³. Однако, несмотря на то, что этот метод позволяет получить ооциты на разных стадиях развития, он не позволяет полностью разделить ооциты и гранулезные клетки. Другие исследователи также предложили методы отделения гранулезных клеток от ооцитов. Тем не менее, эти методы в первую очередь основаны на механических подходах, которые могут привести к повреждению ооцитов, требуют много времени и недостаточны для получения значительного количества ооцитов для анализа^14,15.

Учитывая ограничения существующих методов и специфические требования к исследованиям, данное исследование направлено на установление процедуры тщательного разделения ооцитов и гранулезных клеток и получение достаточного количества чистых ооцитов I стадии для анализа. Развивая упомянутый способ¹³, мы используем улучшенный буфер для пищеварения (см. Таблицу материалов), который является более щадящим и способствует диспергированию ооцитов и диссоциации гранулезных клеток. Затем ооциты пропускают через клеточное сетчатое фильтр, после чего проводят промывку и дальнейший микроскопический отбор, что позволяет получить большое количество чистых ооцитов I стадии.

протокол

Все рыбки данио содержались в соответствии со строгими рекомендациями по уходу за животными, изложенными соответствующими национальными и/или местными органами защиты животных. Содержание и обращение с рыбой получило одобрение как местных властей, так и комитета по этике животных Западно-Китайской больницы Сычуаньского университета (разрешение No 20220422003). Яичники данио-рерио содержат смесь многоступенчатых ооцитов, причем каждая стадия развития присутствует в яичниках взрослых данио-рерио. Тем не менее, молодые рыбки данио были отобраны для этого исследования из-за доминирования ооцитов поздней стадии (стадия II-III) в яичниках взрослых рыб, которые являются крупными и непрозрачными. Напротив, молодые особи имеют плоские и удлиненные яичники, состоящие в основном из ооцитов стадии I (Рисунок 1B) (Рисунок 1B). Предыдущие исследования показали, что морфологические особенности раннего оогенеза у взрослых и молодых рыбок данио очень последовательны, что подтверждает возможность использования молоди данио-рерио¹³. Описанные ниже процедуры, представленные на рисунке 2, содержат подробное описание процесса выделения, от вскрытия до получения чистых ооцитов I стадии. Для справки реагенты, буферы и оборудование, использованные в исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Диссекция яичников

1. Выберите несколько самок данио-рерио со стандартной длиной (SL) от 10 мм до 15 мм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: SL, измеряемый от рыла до основания хвоста в миллиметрах, служит надежным критерием для выбора подходящей рыбы. Для этой процедуры рекомендуется использовать молодь рыб в период от 5 до 7 недель после оплодотворения (wpf) с SL в диапазоне от 10 мм до 15 мм. Яичники молоди данио-рерио преимущественно заняты ранними ооцитами, что обеспечивает оптимальные условия для легкого получения ооцитов I стадии (рис. 1В).
2. Усыпьте молодых самок, поместив их в ледяную воду (0-4 °C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения эвтаназии и минимизации боли, испытываемой рыбками данио-рерио во время эвтаназии, необходимо выполнить следующие процедуры: подтвердить, что температура ледяной воды находится в пределах 0-4 °C с помощью термометра, быстро перевести рыбок данио в ледяную воду и поддерживать их в ледяной воде в течение как минимум 10 минут после прекращения оперкулярного движения^{. 17,18}.
3. Высушите лишнюю воду на поверхности рыбы с помощью впитывающей бумаги.
4. Препарируйте рыбок данио под стереомикроскопом, выполнив следующие действия:
   1. Отрежьте голову с помощью микроножниц по заднему краю жаберной крышки; Отрежьте хвост вдоль клоаки. Переложите средний ствол в чашку диаметром 35 мм, содержащую 2 мл среды L-15 (с L-глутамином).
   2. Рассекаем средний ствол у Л-15 средний. Разрежьте по центральной оси брюшной полости и удалите внутренности и плавательный пузырь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Внутренности рыбок данио соединены. Поэтому зажмите заднюю кишку возле анальной области и приподнимите ее, чтобы легко удалить всю висцеральную массу.
   3. Отделите двусторонние яичники от брюшной полости с помощью пинцета. Удалите жировую ткань, чешуйки и другие ткани организма, прикрепленные к яичнику.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Яичники покрыты жировой тканью. Поэтому лучше всего удалять их вместе, чтобы избежать механических повреждений ооцитов.
      ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с пинцетом осторожно, чтобы не получить травму.

2. Пищеварение

1. Перенесите яичники в 6-луночный планшет, содержащий 2 мл раствора для диссоциации клеток Кингера, и инкубируйте в течение 2-3 ч при 28,5 °C. Встряхивайте 6-луночный планшет каждые 30 минут, чтобы способствовать дисперсии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пинцет для разделения яичников на небольшие блоки тканей для повышения эффективности пищеварения. Время переваривания варьируется; регулярно контролировать и прекращать процесс при рассеивании под стереомикроскопом значительного количества ооцитов I стадии. Раствор для диссоциации клеток Кингера является рабочим раствором и может использоваться напрямую. Его можно стабильно хранить при температуре −20 °C после упаковки и размораживать при низкой температуре (4 °C) перед использованием.
2. Добавьте среду L-15, предварительно нагретую до 28,5 °C, в буфер для разложения, чтобы остановить разложение.

3. Фильтрация

1. Поместите сетчатый фильтр 100 μм в другую лунку 6-луночного планшета, добавьте среду L-15 и убедитесь, что уровень среды выше, чем в фильтре.
   Примечание: Теоретический диаметр ооцитов I стадии составляет менее 140 мкм. Тем не менее, ооциты с большим диаметром все еще могут проходить через клеточный фильтр. Поэтому на этом этапе был выбран клеточный фильтр с меньшим диаметром, чем мишень. Размеры ячеек могут быть скорректированы в зависимости от конкретных экспериментальных потребностей.
2. Пропустите пищеварительную среду через клеточный фильтр с помощью пипетки. Подождите 1-2 минуты, пока все яйцеклетки I стадии пройдут через ситечко, затем удалите его. Следите за тем, чтобы ооциты оставались в жидкости на протяжении всего процесса переноса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Удержание ооцитов в среде помогает поддерживать их целостность и оптимальное состояние. Если ооциты подвергаются воздействию воздуха в течение длительного периода времени, они могут высохнуть и повредиться, что повлияет на итоговую эффективность разделения. При переносе ооцитов через клеточный фильтр пипетку держите ниже поверхности жидкости, а не добавляйте их во взвешенном виде.

4. Стирка

1. Удалите лишнюю среду с помощью пипетки. Добавьте 4 мл свежей среды L-15 и аккуратно суспендируйте яйцеклетки. Подождите 1-2 минуты, затем удалите надосадочную жидкость.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте инструменты с низкими адгезионными свойствами для предотвращения повреждения ооцитов.
2. Повторите шаг 4.1 5-6 раз до тех пор, пока не исчезнут другие примеси.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Бережное обращение во время процесса промывки имеет решающее значение для предотвращения повреждения ооцитов. Несмотря на получение большого количества ооцитов стадии I (примерно 200-400 ооцитов стадии I от одной рыбки данио) после предыдущих этапов промывания, ооциты все еще могут быть смешаны с фрагментами клеток, ооцитами других стадий или небольшими гранулами, образованными сломанными ооцитами поздней стадии. Кроме того, некоторые гранулезные клетки могут все еще прилипать к поверхности нескольких ооцитов из-за неполного переваривания ферментов. Поэтому для задач, требующих более высокого уровня чистоты, таких как секвенирование генома, необходимы дополнительные шаги для выбора полностью чистых ооцитов. Чтобы решить эту проблему, перейдите к шагам 5 и 6.

5. Отбор для контроля качества

1. Переложите промытые яйцеклетки I стадии в чашку диаметром 35 мм, содержащую свежую среду L-15.
2. Под микроскопом с увеличением, равным или превышающим 10x, удалите фрагменты клеток, ооциты другой стадии и яйцеклетки I стадии, прикрепленные гранулезными клетками, с помощью инструмента, которым можно манипулировать с высокой точностью, например, тупой инъекционной иглы.
   Примечание: Этот шаг требует от экспериментатора терпения, но он обеспечивает выделение чистых и неповрежденных ооцитов.
   ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с инъекционными иглами осторожно, чтобы не получить травму.

6. Подтверждение ядерным окрашиванием

Примечание: Для дальнейшей доработки выделенных ооцитов было использовано окрашивание препаратом Hoechst 33342 для идентификации и удаления отдельных ооцитов, прикрепленных к гранулезным клеткам, которые могли быть пропущены на предыдущем этапе.

1. Добавьте конечную концентрацию 5 г/мл Hoechst 33342 в среду L-15 и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут.
2. Наблюдайте флуоресценцию Хёхста через флуоресцентный микроскоп под воздействием ультрафиолетового лазера.
   Примечание: Хёхст обычно возбуждается в ультрафиолетовой области, обычно на длинах волн от 310 до 360 нм. Во время этого процесса рекомендуется использовать увеличение от 80x до 100x. Используйте автоматический режим экспозиции. Длина волны возбуждения и время экспозиции могут быть отрегулированы в зависимости от конкретной модели микроскопа и индивидуальных требований.
3. С помощью иглы тщательно отбирают ооциты, которые не соответствуют нужным критериям.
   Примечание: При визуализации клеток в центре ооцита присутствует большой ядерный хроматин. Если бы гранулезные клетки были прикреплены к ооциту, были бы видны маленькие и яркие ядра, цепляющиеся за край ооцита (рис. 3). Рассмотрите их под микроскопом.
4. Тщательно и многократно промойте ооциты L-15, чтобы удалить избыток Хёхста.
5. Идентифицированные ооциты I стадии используют непосредственно для последующей экстракции или хранят их при температуре −80 °С после мгновенной заморозки в жидком азоте.
   ВНИМАНИЕ: Надевайте защитную маску для лица и криогенные перчатки при работе с жидким азотом и сверхнизкотемпературными морозильными камерами.

Результаты

На рисунке 1 показана морфология яичников, наблюдаемая как у взрослых, так и у молодых рыбок данио, демонстрируя ооциты на разных стадиях развития, которые служат в качестве ориентира. На рисунке 1А представлено графическое представлен?...

Обсуждение

В этом исследовании мы разработали метод выделения чистых и чистых ооцитов I стадии, за исключением гранулезных клеток, для последующего анализа (в частности, геномного анализа). Сравнивая этот модифицированный метод с упомянутым методом¹³, можно отметить...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kinger's cell dissociation solution	PlantChemMed	PC-33689	Kinger's cell dissociation solution can be stored stably at -20 °C after packaging and can be used after thawing at low temperature (4 °C). It can be used directly for dissociating zebrafish ovaries. The optimal temperature is 28.5 °C, for approximately 2-3 hours. The duration can be adjusted according to the specific dissociation conditions, either shortened or extended (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689).
Cell strainers (100 μm )	Falcon	352360
Fluorescence microscope	Zeiss	Axio Zoom.V16
Forceps	Dumont	#5
Glass capillary needle	/	/	Blunted by burning with lighter
Hoechst	Yesen	40732ES03
Low adsorption pipette tips (10 μl )	Labsellect	T-0010-LR-R-S
Leibovitz’s L-15 medium medium (with L-glutamine)	Hyclone	SH30525.01
Ice bucket	/	/	Ice-cold water is used to euthanize zebrafish
Incubator	WIGGENS	WH-01
Juvenile fish	/	/	5–6 weeks post-fertilization, standard length [SL] of 10–15 mm
Plastic dish (35 mm )	SORFA	230101
Stereomicroscope	Motic	SMZ-161
Tissue Culture Plate (6-wells)	SORFA	0110006
Vannas spring scissors	Fine Science Toosl	#15000-00