Isolement rapide d’ovocytes de stade I chez un poisson-zèbre dépourvu de cellules de granulosa

Résumé

Ce protocole décrit une procédure modifiée pour isoler rapidement des ovocytes propres de stade I chez des poissons-zèbres dépourvus de cellules de granulosa, fournissant ainsi une méthode pratique pour la recherche spécifique aux ovocytes.

Résumé

L’étude du développement des ovocytes a des implications importantes en biologie du développement. Le poisson-zèbre (Danio rerio) a été largement utilisé comme organisme modèle pour étudier les processus de développement précoces de l’ovocyte à l’embryon. Chez le poisson-zèbre, les ovocytes sont entourés d’une seule couche de cellules somatiques de la granulosa. Cependant, la séparation des cellules de la granulosa des ovocytes pose un défi, car l’obtention d’ovocytes purs est cruciale pour une analyse précise. Bien que diverses méthodes aient été proposées pour isoler les ovocytes de poisson-zèbre à différents stades de développement, les techniques actuelles ne parviennent pas à éliminer complètement les cellules de la granulosa, ce qui limite la précision de l’analyse du génome axée uniquement sur les ovocytes. Dans cette étude, nous avons réussi à développer un processus rapide et efficace pour isoler les ovocytes purs de stade I chez le poisson zèbre tout en éliminant la contamination cellulaire de la granulosa. Cette technique facilite l’analyse biochimique et moléculaire, notamment dans l’exploration des aspects épigénétiques et de la structure du génome spécifiques aux ovocytes. Notamment, la méthode est conviviale, minimise les dommages aux ovocytes et fournit une solution pratique pour la recherche et l’analyse ultérieures.

Introduction

Le poisson-zèbre est l’un des systèmes modèles les plus importants en biologie du développement. Au cours des dernières années, de nombreuses études ont utilisé le poisson-zèbre comme modèle pour étudier des événements biologiques importants et des processus régulateurs de l’ovocyte à l’embryon. Ceux-ci englobent les processus complexes du développement et de la maturation des ovocytes¹, la fonctionnalité des gènes maternels², la régulation des transitions mères-zygotiques³ et des analyses omiques approfondies⁴.

Les cellules de la granulosa, les cellules somatiques qui enveloppent et nourrissent l’ovocyte en développement dans le follicule ovarien ^5,6, jouent un rôle central dans ce processus de développement. Au fur et à mesure que les cellules germinales primordiales (PGC) évoluent en oogonies, elles sont entourées d’une monocouche de cellules de la granulosa⁷. Avec les cellules thécales externes, l’ovocyte et les cellules de la granulosa qui l’entourent constituent un follicule mature⁸. Compte tenu de la distinction fondamentale entre les cellules germinales et les cellules somatiques, l’obtention d’un échantillon d’ovocytes purs est impérative, en particulier pour les analyses liées au génome.

Au sein de la structure folliculaire du poisson-zèbre, les cellules de la granulosa présentent généralement un diamètre de seulement quelques microns⁸, ce qui souligne l’interconnexion intime entre les cellules de la granulosa et les ovocytes⁹. Cette association étroite présente un défi pour obtenir une séparation complète en raison de la différence considérable entre le nombre et le volume des cellules de la granulosa et ceux des ovocytes (des centaines de cellules de la granulosa par rapport à un seul ovocyte)^10,11. Même une contamination minime avec une seule cellule de granulosa peut entraver les analyses en aval ciblant spécifiquement les ovocytes. Par conséquent, pour les études axées sur les caractéristiques génomiques et épigénétiques, l’élimination des cellules de la granulosa est essentielle.

Bénéficiant de critères morphologiques bien caractérisés, les ovocytes à chaque stade peuvent être distingués sur la base du diamètre¹¹. Le processus d’ovogenèse chez le poisson-zèbre est classé en cinq étapes selon la morphologie et le caryotype¹¹. Les ovocytes de stade I (7-140 μm de diamètre) englobent les ovocytes du début de la méiose au stade précoce de la méiose I. Surtout, ces ovocytes sont transparents, ce qui permet d’observer le noyau central à travers la lumière transmise (Figure 1Ai). Les ovocytes de stade II (140-340 μm de diamètre) deviennent progressivement mousseux et translucides. Avec l’élargissement des follicules et la prolifération des alvéoles corticales, les vésicules germinales au centre deviennent difficiles à distinguer¹² (Figure 1Aii). Les ovocytes de stade III (340-690 μm de diamètre) accumulent progressivement de la vitellogénine et les follicules frais deviennent de plus en plus opaques (Figure 1Aiii). La méiose se poursuit dans les ovocytes de stade IV (690-730 μm de diamètre) lorsque les chromosomes entrent au milieu de la méiose II, où ils stagnent (Figure 1Aiv). Les ovocytes de stade V (730-750 μm de diamètre) sont arrivés à maturité et sont prêts pour l’ovulation ^7,11 (Figure 1Av).

Sur la base des caractéristiques uniques de chacun des stades susmentionnés, une méthode a été proposée pour isoler les ovocytes des stades I à III en digérant les ovaires du poisson-zèbre à l’aide d’une solution digestive contenant de la collagénase I, de la collagénase II et de l’hyaluronidase, suivie d’une filtration à travers une passoire cellulaire de taille spécifique¹³. Cependant, bien que cette méthode permette d’obtenir des ovocytes à différents stades de développement, elle ne parvient pas à séparer complètement les ovocytes et les cellules de la granulosa. D’autres chercheurs ont également suggéré des méthodes pour séparer les cellules de la granulosa des ovocytes. Cependant, ces méthodes reposent principalement sur des approches mécaniques, qui peuvent causer des lésions aux ovocytes, prennent du temps et sont insuffisantes pour obtenir un nombre important d’ovocytes à analyser^14,15.

Compte tenu des limites des méthodes existantes et des exigences spécifiques de la recherche, cette étude vise à établir une procédure permettant de séparer complètement les ovocytes et les cellules de la granulosa et d’obtenir un nombre suffisant d’ovocytes propres de stade I pour l’analyse. En développant la méthode^{référencée 13}, nous utilisons un tampon de digestion amélioré (voir le tableau des matériaux) qui est plus doux et facilite la dispersion des ovocytes et la dissociation des cellules de la granulosa. Ensuite, les ovocytes sont passés à travers une passoire cellulaire, suivi d’un lavage et d’une sélection microscopique supplémentaire, permettant l’acquisition d’un grand nombre d’ovocytes propres de stade I.

Protocole

Tous les poissons-zèbres ont été manipulés conformément aux directives strictes en matière de soins aux animaux définies par les organismes nationaux et/ou locaux de protection des animaux concernés. L’entretien et la manipulation des poissons ont reçu l’approbation des autorités locales et du comité d’éthique animale de l’hôpital de Chine occidentale de l’Université du Sichuan (approbation n° 20220422003). Les ovaires du poisson-zèbre contiennent un mélange d’ovocytes à plusieurs stades, chaque stade de développement étant présent dans les ovaires adultes du poisson-zèbre. Cependant, des poissons-zèbres juvéniles ont été sélectionnés pour cette étude en raison de la dominance des ovocytes à un stade avancé (stades II-III) dans les ovaires des poissons adultes, qui sont grands et opaques. En revanche, les ovaires des juvéniles sont plats et allongés, principalement constitués d’ovocytes de stade I (figure 1B) (figure 1B). Des recherches antérieures ont démontré que les caractéristiques morphologiques de l’ovogenèse précoce chez les poissons-zèbres adultes et juvéniles sont très cohérentes, ce qui soutient la faisabilité de l’utilisation de poissons-zèbres juvéniles¹³. Les procédures décrites ci-dessous, décrites à la figure 2, fournissent une description détaillée du processus d’isolement, de la dissection à l’obtention d’ovocytes propres de stade I. À titre de référence, les réactifs, les tampons et l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Dissection ovarienne

1. Sélectionnez plusieurs poissons-zèbres femelles d’une longueur standard (SL) allant de 10 mm à 15 mm.
   REMARQUE : Le SL, mesuré du museau à la base de la queue en millimètres, sert de critère fiable pour sélectionner les poissons appropriés. Il est recommandé d’utiliser des poissons juvéniles entre 5 et 7 semaines après la fécondation (wpf) avec un SL allant de 10 mm à 15 mm pour cette procédure. Les ovaires des poissons-zèbres juvéniles sont principalement occupés par des ovocytes précoces, ce qui offre des conditions optimales pour obtenir facilement des ovocytes de stade I (Figure 1B).
2. Euthanasier les femelles juvéniles en les plaçant dans de l’eau glacée (0-4 °C).
   REMARQUE : Les procédures suivantes doivent être effectuées pour assurer l’euthanasie et minimiser la douleur ressentie par le poisson-zèbre lors de l’euthanasie : confirmer que la température de l’eau glacée se situe dans la plage de 0 à 4 °C à l’aide d’un thermomètre, transférer rapidement le poisson-zèbre dans l’eau glacée et le maintenir dans l’eau glacée pendant au moins 10 minutes après l’arrêt du mouvement operculaire^{16, 17 et 18}.
3. Séchez l’excès d’eau à la surface du poisson à l’aide d’un papier absorbant.
4. Disséquez le poisson-zèbre au stéréomicroscope en suivant ces étapes :
   1. Coupez la tête à l’aide de micro-ciseaux le long du bord postérieur du couvercle branchial ; Coupez la queue le long du cloaque. Transférez le tronc du milieu dans une boîte de 35 mm contenant 2 ml de milieu L-15 (avec L-glutamine).
   2. Disséquez le tronc moyen dans le milieu L-15. Coupez le long de l’axe central de l’abdomen et retirez les viscères et la vessie natatoire.
      REMARQUE : Les viscères du poisson-zèbre sont connectés. Par conséquent, pincez l’intestin postérieur près de la région anale et soulevez-le pour retirer facilement toute la masse viscérale.
   3. Détachez les ovaires bilatéraux de l’abdomen à l’aide d’une pince à épiler. Retirez le tissu adipeux, les écailles et les autres tissus corporels attachés à l’ovaire.
      REMARQUE : Les ovaires sont recouverts de tissu adipeux. Par conséquent, il est préférable de les retirer ensemble pour éviter d’endommager mécaniquement les ovocytes.
      ATTENTION : Manipulez la pince à épiler avec précaution pour éviter de vous blesser.

2. La digestion

1. Transférez les ovaires dans une plaque à 6 puits contenant 2 mL de solution de dissociation cellulaire de Kinger et incubez pendant 2 à 3 h à 28,5 °C. Secouez la plaque à 6 puits toutes les 30 minutes pour favoriser la dispersion.
   REMARQUE : Utilisez une pince à épiler pour séparer les ovaires en petits blocs de tissus afin d’améliorer l’efficacité de la digestion. Le temps de digestion est variable ; surveiller et terminer régulièrement le processus lorsqu’un nombre important d’ovocytes de stade I sont dispersés sous le stéréomicroscope. La solution de dissociation cellulaire de Kinger est la solution de travail et peut être utilisée directement. Il peut être stocké de manière stable à -20 °C après l’emballage et décongelé à basse température (4 °C) avant utilisation.
2. Ajouter le milieu L-15 préchauffé à 28,5 °C dans le tampon de digestion pour arrêter la digestion.

3. Filtration

1. Placez une crépine à cellules de 100 μm dans un autre puits de la plaque à 6 puits, ajoutez le milieu L-15 et assurez-vous que le niveau du fluide est supérieur à celui du filtre.
   REMARQUE : Le diamètre théorique des ovocytes de stade I est inférieur à 140 μm. Cependant, les ovocytes de plus grand diamètre peuvent toujours passer à travers la crépine cellulaire. Par conséquent, une crépine de cellule d’un diamètre inférieur à la cible a été sélectionnée à cette étape. Les mailles peuvent être ajustées en fonction des besoins expérimentaux spécifiques.
2. Aspirez le milieu digestif à travers la passoire cellulaire à l’aide d’une pipette. Attendez 1 à 2 minutes jusqu’à ce que tous les ovocytes de stade I soient passés à travers la passoire, puis retirez-le. Assurez-vous que les ovocytes restent dans le liquide tout au long du processus de transfert.
   REMARQUE : Le maintien des ovocytes dans le milieu aide à maintenir leur intégrité et leur état optimal. Si les ovocytes sont exposés à l’air pendant une période prolongée, ils pourraient se dessécher et être endommagés, ce qui affecterait l’efficacité de la séparation finale. Gardez la pipette sous la surface du liquide lorsque vous transférez les ovocytes à travers la crépine cellulaire plutôt que de les ajouter en suspension.

4. Lavage

1. Retirez l’excédent de fluide à l’aide d’une pipette. Ajouter 4 mL de milieu L-15 frais et remettre doucement les ovocytes en suspension. Attendez 1 à 2 min, puis retirez le surnageant.
   REMARQUE : Utilisez des instruments à faible adhérence pour éviter d’endommager les ovocytes.
2. Répétez l’étape 4.1 5 à 6 fois jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’autres impuretés.
   REMARQUE : Une manipulation en douceur pendant le processus de lavage est cruciale pour éviter d’endommager les ovocytes. Malgré l’obtention d’une abondance d’ovocytes de stade I (environ 200 à 400 ovocytes de stade I d’un poisson zèbre) après les étapes de lavage précédentes, les ovocytes peuvent toujours être mélangés avec des fragments de cellules, des ovocytes d’autres stades ou de petits granules formés par des ovocytes brisés à un stade avancé. De plus, certaines cellules de la granulosa peuvent encore adhérer à la surface de plusieurs ovocytes en raison d’une digestion enzymatique incomplète. Par conséquent, pour les applications exigeant un niveau de pureté plus élevé, telles que le séquençage du génome, des étapes supplémentaires sont nécessaires pour sélectionner des ovocytes complètement propres. Pour résoudre ce problème, passez aux étapes 5 et 6.

5. Sélection pour le contrôle de la qualité

1. Transférez les ovocytes lavés de stade I dans une boîte de 35 mm contenant du milieu L-15 frais.
2. Sous un microscope avec un grossissement égal ou supérieur à 10x, prélevez des fragments de cellules, des ovocytes d’autres stades et des ovocytes de stade I collés par des cellules de la granulosa à l’aide d’un outil qui peut être manipulé avec précision, comme une aiguille d’injection contondante.
   REMARQUE : Cette étape demande de la patience de la part de l’expérimentateur, mais elle assure l’isolement des ovocytes propres et intacts.
   ATTENTION : Manipulez les aiguilles d’injection avec précaution pour éviter de vous blesser.

6. Confirmation par coloration nucléaire

REMARQUE : Pour affiner davantage les ovocytes isolés, une coloration au Hoechst 33342 a été utilisée pour identifier et éliminer les ovocytes individuels collés avec des cellules de granulosa qui auraient pu être manqués à l’étape précédente.

1. Ajouter une concentration finale de 5 μg/mL Hoechst 33342 au milieu L-15 et incuber à température ambiante pendant 10 min.
2. Observez la fluorescence de Hoechst à travers un microscope à fluorescence sous excitation laser UV.
   REMARQUE : Hoechst est généralement excité dans la région ultraviolette, généralement à des longueurs d’onde comprises entre 310 et 360 nm. Il est recommandé d’utiliser un grossissement compris entre 80x et 100x pendant ce processus. Utilisez le mode d’exposition automatique. La longueur d’onde d’excitation et le temps d’exposition peuvent être ajustés en fonction du modèle de microscope spécifique et des exigences individuelles.
3. À l’aide d’une aiguille, prélevez soigneusement les ovocytes qui ne répondent pas aux critères souhaités.
   REMARQUE : Lors de la visualisation des cellules, une grande chromatine nucléaire est présente au centre de l’ovocyte. Si les cellules de la granulosa étaient collées à l’ovocyte, de petits noyaux brillants seraient visibles, accrochés au bord de l’ovocyte (Figure 3). Repérez-les au microscope.
4. Lavez soigneusement et à plusieurs reprises les ovocytes avec du L-15 pour éliminer l’excès de Hoechst.
5. Utilisez directement les ovocytes de stade I identifiés pour l’extraction ultérieure ou conservez-les à −80 °C après congélation instantanée dans de l’azote liquide.
   ATTENTION : Portez un masque facial de protection et des gants cryogéniques lors de la manipulation d’azote liquide et de congélateurs à ultra-basse température.

Résultats

La figure 1 illustre la morphologie ovarienne observée chez les poissons-zèbres adultes et juvéniles, mettant en valeur les ovocytes à différents stades de développement pour servir de référence. La figure 1A fournit une représentation graphique de la morphologie et de la taille des ovocytes à chaque stade de développement, en commençant par le stade de croissance primaire (stade I) et en terminant par l’ovule ovul...

Discussion

Dans cette étude, nous avons développé une méthode permettant d’isoler des ovocytes de stade I purs et propres, à l’exclusion des cellules de la granulosa, pour une analyse en aval (en particulier les analyses génomiques). En comparant cette méthode modifiée avec la méthode référencée¹³, les ovocytes de stade I obtenus à l’aide de cette méthode sont morphologiquement intacts, en nombre suffisant et exempts de contamination par d’autres cellul...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kinger's cell dissociation solution	PlantChemMed	PC-33689	Kinger's cell dissociation solution can be stored stably at -20 °C after packaging and can be used after thawing at low temperature (4 °C). It can be used directly for dissociating zebrafish ovaries. The optimal temperature is 28.5 °C, for approximately 2-3 hours. The duration can be adjusted according to the specific dissociation conditions, either shortened or extended (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689).
Cell strainers (100 μm )	Falcon	352360
Fluorescence microscope	Zeiss	Axio Zoom.V16
Forceps	Dumont	#5
Glass capillary needle	/	/	Blunted by burning with lighter
Hoechst	Yesen	40732ES03
Low adsorption pipette tips (10 μl )	Labsellect	T-0010-LR-R-S
Leibovitz’s L-15 medium medium (with L-glutamine)	Hyclone	SH30525.01
Ice bucket	/	/	Ice-cold water is used to euthanize zebrafish
Incubator	WIGGENS	WH-01
Juvenile fish	/	/	5–6 weeks post-fertilization, standard length [SL] of 10–15 mm
Plastic dish (35 mm )	SORFA	230101
Stereomicroscope	Motic	SMZ-161
Tissue Culture Plate (6-wells)	SORFA	0110006
Vannas spring scissors	Fine Science Toosl	#15000-00