Schnelle Isolierung von Eizellen im Stadium I bei Zebrafischen ohne Granulosazellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein modifiziertes Verfahren zur schnellen Isolierung sauberer Eizellen im Stadium I in Zebrafischen ohne Granulosazellen und bietet damit eine geeignete Methode für die eizellspezifische Forschung.

Zusammenfassung

Die Erforschung der Eizellentwicklung hat erhebliche Auswirkungen auf die Entwicklungsbiologie. Der Zebrafisch (Danio rerio) wurde ausgiebig als Modellorganismus genutzt, um frühe Entwicklungsprozesse von der Eizelle bis zum Embryo zu untersuchen. Im Zebrafisch sind die Eizellen von einer einzigen Schicht somatischer Granulosazellen umgeben. Die Trennung von Granulosazellen von Eizellen stellt jedoch eine Herausforderung dar, da die Gewinnung reiner Eizellen für eine präzise Analyse entscheidend ist. Obwohl verschiedene Methoden zur Isolierung von Zebrafisch-Eizellen in verschiedenen Entwicklungsstadien vorgeschlagen wurden, reichen die derzeitigen Techniken nicht aus, um Granulosazellen vollständig zu entfernen, was die Genauigkeit der Genomanalyse, die sich ausschließlich auf Eizellen konzentriert, einschränkt. In dieser Studie haben wir erfolgreich ein schnelles und effizientes Verfahren entwickelt, um reine Eizellen im Stadium I im Zebrafisch zu isolieren und gleichzeitig die Kontamination von Granulosazellen zu eliminieren. Diese Technik erleichtert die biochemische und molekulare Analyse, insbesondere bei der Erforschung epigenetischer und genomstrukturspezifischer Aspekte von Eizellen. Insbesondere ist die Methode benutzerfreundlich, minimiert Eizellschäden und bietet eine praktische Lösung für die anschließende Forschung und Analyse.

Einleitung

Der Zebrafisch gehört zu den wichtigsten Modellsystemen der Entwicklungsbiologie. In den letzten Jahren wurde der Zebrafisch in zahlreichen Studien als Modell genutzt, um wichtige biologische Ereignisse und Regulationsprozesse von der Eizelle bis zum Embryo zu untersuchen. Diese umfassen die komplexen Prozesse der Entwicklung und Reifung von Eizellen¹, die Funktionalität mütterlicher Gene², die Regulation von mütterlich-zygotischen Übergängen³ und umfangreiche Omics-Analysen⁴.

Granulosazellen, die somatischen Zellen, die die sich entwickelnde Eizelle im Eierstockfollikel umhüllen und nähren ^5,6, spielen eine zentrale Rolle in diesem Entwicklungsprozess. Wenn sich primordiale Keimzellen (PGCs) zu Oogonien entwickeln, werden sie von einer Monoschicht aus Granulosazellen umgeben⁷. Zusammen mit den äußeren Thekalzellen bilden die Eizelle und die sie umgebenden Granulosazellen einen reifen Follikel⁸. Angesichts der grundlegenden Unterscheidung zwischen Keimzellen und Körperzellen ist die Gewinnung einer reinen Eizellprobe insbesondere für genombezogene Analysen zwingend erforderlich.

Innerhalb der Follikelstruktur des Zebrafisches weisen Granulosazellen typischerweise einen Durchmesser von nur wenigen Mikrometern^{auf 8}, was die enge Verbindung zwischen Granulosazellen und Eizellen unterstreicht⁹. Diese enge Assoziation stellt eine Herausforderung dar, um eine vollständige Trennung zu erreichen, da sich sowohl die Anzahl als auch das Volumen von Granulosazellen und Eizellen (Hunderte von Granulosazellen im Vergleich zu einer einzelnen Eizelle) erheblich ^{unterscheiden10,11}. Selbst eine minimale Kontamination mit einer einzigen Granulosazelle kann nachgelagerte Analysen, die speziell auf Eizellen abzielen, erschweren. Daher ist für Studien, die sich auf genomische und epigenetische Merkmale konzentrieren, die Eliminierung von Granulosazellen unerlässlich.

Ausgehend von gut charakterisierten morphologischen Kriterien können die Eizellen in jedem Stadium anhand des Durchmessers¹¹ unterschieden werden. Der Oogeneseprozess im Zebrafisch wird nach Morphologie und Karyotyp¹¹ in fünf Stadien eingeteilt. Eizellen im Stadium I (7-140 μm Durchmesser) umfassen Eizellen vom Beginn der Meiose bis zum frühen Stadium der Meiose I. Entscheidend ist, dass diese Eizellen transparent sind, was die Beobachtung des zentralen Kerns durch Durchlicht ermöglicht (Abbildung 1Ai). Eizellen im Stadium II (140-340 μm Durchmesser) werden allmählich schaumig und durchscheinend. Mit der Vergrößerung der Follikel und der Proliferation der kortikalen Alveolen werden die keimförmigen Vesikel in der Mitte schwer zu unterscheiden¹² (Abbildung 1Aii). Eizellen im Stadium III (340-690 μm Durchmesser) akkumulieren nach und nach Vitellogenin, und frische Follikel werden zunehmend undurchsichtig (Abbildung 1Aiii). Die Meiose setzt sich in Eizellen im Stadium IV (690-730 μm Durchmesser) fort, wenn die Chromosomen in die Mitte der Meiose II eintreten, wo sie stagnieren (Abbildung 1Aiv). Eizellen im Stadium V (730-750 μm Durchmesser) sind gereift und bereit für den Eisprung ^7,11 (Abbildung 1Av).

Basierend auf den einzigartigen Merkmalen jedes der oben genannten Stadien wurde ein Verfahren zur Isolierung von Eizellen der Stadien I bis III vorgeschlagen, indem die Eierstöcke des Zebrafisches unter Verwendung einer Verdauungslösung, die Kollagenase I, Kollagenase II und Hyaluronidase enthält, verdaut werden, gefolgt von einer Filtration durch ein Zellsieb bestimmter Größe¹³. Diese Methode ermöglicht zwar die Gewinnung von Eizellen in verschiedenen Entwicklungsstadien, aber es gelingt nicht, Eizellen und Granulosazellen vollständig zu trennen. Andere Forscher haben auch Methoden vorgeschlagen, um Granulosazellen von Eizellen zu trennen. Diese Methoden beruhen jedoch in erster Linie auf mechanischen Ansätzen, die zu Eizellschäden führen können, zeitaufwändig sind und nicht ausreichen, um eine beträchtliche Anzahl von Eizellen für die Analyse zu gewinnen ^14,15.

Angesichts der Einschränkungen bestehender Methoden und spezifischer Forschungsanforderungen zielt diese Studie darauf ab, ein Verfahren zu etablieren, um Eizellen und Granulosazellen gründlich zu trennen und eine ausreichende Anzahl sauberer Eizellen im Stadium I für die Analyse zu erhalten. In Erweiterung der referenzierten Methode¹³ verwenden wir einen verbesserten Verdauungspuffer (siehe Materialtabelle), der schonender ist und die Dispergierung von Eizellen und die Dissoziation von Granulosazellen erleichtert. Anschließend werden die Eizellen durch ein Zellsieb geleitet, gefolgt von einer Reinigung und weiteren mikroskopischen Selektion, die die Gewinnung einer großen Anzahl sauberer Eizellen im Stadium I ermöglicht.

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Protokoll

Alle Zebrafische wurden nach strengen Tierhaltungsrichtlinien behandelt, die von den zuständigen nationalen und/oder lokalen Tierschutzbehörden festgelegt wurden. Die Haltung und der Umgang mit Fischen wurden sowohl von den lokalen Behörden als auch von der Tierethikkommission des Westchinesischen Krankenhauses der Sichuan Universität genehmigt (Zulassung Nr. 20220422003). Die Eierstöcke des Zebrafisches enthalten eine Mischung aus mehrstufigen Eizellen, wobei jedes Entwicklungsstadium in den Eierstöcken der adulten Zebrafische vorhanden ist. Für diese Studie wurden jedoch juvenile Zebrafische ausgewählt, da die Eizellen im Spätstadium (Stadium II-III) in den Eierstöcken adulter Fische, die groß und undurchsichtig sind, dominieren. Im Gegensatz dazu haben Jungtiere flache und längliche Eierstöcke, die hauptsächlich aus Eizellen im Stadium I bestehen (Abbildung 1B) (Abbildung 1B). Frühere Forschungen haben gezeigt, dass die morphologischen Merkmale der frühen Oogenese bei adulten und juvenilen Zebrafischen sehr konsistent sind, was die Machbarkeit der Verwendung von juvenilen Zebrafischen^{unterstützt 13}. Die unten beschriebenen Verfahren, die in Abbildung 2 dargestellt sind, bieten eine detaillierte Beschreibung des Isolierungsprozesses, von der Dissektion bis zur Gewinnung sauberer Eizellen im Stadium I. Zur weiteren Information sind die in der Studie verwendeten Reagenzien, Puffer und Geräte in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Dissektion der Eierstöcke

1. Wählen Sie mehrere weibliche Zebrafische mit einer Standardlänge (SL) von 10 mm bis 15 mm aus.
   HINWEIS: Der SL, gemessen von der Schnauze bis zum Schwanzansatz in Millimetern, dient als zuverlässiges Kriterium für die Auswahl geeigneter Fische. Es wird empfohlen, zwischen 5 und 7 Wochen nach der Befruchtung (wpf) Jungfische mit einem SL von 10 mm bis 15 mm für dieses Verfahren zu verwenden. Die Eierstöcke von juvenilen Zebrafischen sind überwiegend von frühen Eizellen besetzt, was optimale Bedingungen für die einfache Gewinnung von Eizellen im Stadium I bietet (Abbildung 1B).
2. Euthanasieren Sie die jungen weiblichen Fische, indem Sie sie in eiskaltes Wasser (0-4 °C) legen.
   HINWEIS: Die folgenden Verfahren müssen durchgeführt werden, um die Euthanasie zu gewährleisten und die Schmerzen des Zebrafisches während der Euthanasie zu minimieren: Bestätigen Sie mit einem Thermometer, dass die Temperatur des eiskalten Wassers im Bereich von 0-4 °C liegt, bringen Sie den Zebrafisch schnell in das eiskalte Wasser und halten Sie ihn nach Beendigung der Operkelbewegung mindestens 10 Minuten lang im eiskalten Wasser^{16. 17,18}.
3. Trocknen Sie überschüssiges Wasser auf der Oberfläche des Fisches mit saugfähigem Papier.
4. Präparieren Sie den Zebrafisch unter einem Stereomikroskop, indem Sie die folgenden Schritte ausführen:
   1. Schneiden Sie den Kopf mit einer Mikroschere entlang des hinteren Randes der Kiemenabdeckung ab. Den Schwanz entlang der Kloake abschneiden. Den mittleren Rumpf in eine 35-mm-Schale mit 2 ml L-15-Medium (mit L-Glutamin) geben.
   2. Präparieren Sie den mittleren Rumpf in das L-15-Medium. Schneiden Sie entlang der Mittelachse des Bauches und entfernen Sie die Eingeweide und die Schwimmblase.
      HINWEIS: Die Eingeweide des Zebrafisches sind miteinander verbunden. Kneifen Sie daher den Hinterdarm in der Nähe der Analregion ein und heben Sie ihn an, um die gesamte viszerale Masse leicht zu entfernen.
   3. Löse die beidseitigen Eierstöcke mit einer Pinzette vom Bauch. Entferne das Fettgewebe, die Schuppen und anderes Körpergewebe, das am Eierstock befestigt ist.
      HINWEIS: Die Eierstöcke sind mit Fettgewebe bedeckt. Daher ist es am besten, sie zusammen zu entfernen, um eine mechanische Beschädigung der Eizellen zu vermeiden.
      ACHTUNG: Gehen Sie vorsichtig mit der Pinzette um, um Verletzungen zu vermeiden.

2. Verdauung

1. Übertragen Sie die Eierstöcke auf eine 6-Well-Platte mit 2 ml Kinger-Zelldissoziationslösung und inkubieren Sie sie 2-3 Stunden lang bei 28,5 °C. Schütteln Sie die 6-Well-Platte alle 30 Minuten, um die Dispersion zu fördern.
   HINWEIS: Verwenden Sie eine Pinzette, um die Eierstöcke in kleine Gewebeblöcke zu unterteilen, um die Wirksamkeit der Verdauung zu verbessern. Die Verdauungszeit ist variabel; Überwachen und beenden Sie den Prozess regelmäßig, wenn eine signifikante Anzahl von Eizellen im Stadium I unter dem Stereomikroskop verstreut wird. Die Kinger-Zelldissoziationslösung ist die Arbeitslösung und kann direkt verwendet werden. Es kann nach dem Verpacken bei -20 °C stabil gelagert und vor Gebrauch bei niedriger Temperatur (4 °C) aufgetaut werden.
2. L-15 auf 28,5 °C vorgewärmtes Medium in den Aufschlusspuffer geben, um die Verdauung zu stoppen.

3. Filterung

1. Setzen Sie ein 100-μm-Zellsieb in eine andere Vertiefung der 6-Well-Platte ein, fügen Sie L-15-Medium hinzu und stellen Sie sicher, dass der mittlere Füllstand höher als der Filter ist.
   HINWEIS: Der theoretische Durchmesser der Eizellen im Stadium I beträgt weniger als 140 μm. Eizellen mit größeren Durchmessern können jedoch immer noch das Zellsieb passieren. Daher wurde in diesem Schritt ein Zellsieb mit einem kleineren Durchmesser als das Ziel ausgewählt. Die Maschenweiten können je nach den spezifischen experimentellen Anforderungen angepasst werden.
2. Ziehen Sie das Verdauungsmedium mit einer Pipette durch das Zellsieb. Warten Sie 1-2 Minuten, bis alle Eizellen des Stadiums I das Sieb passiert haben, und entfernen Sie es dann. Stellen Sie sicher, dass die Eizellen während des gesamten Transfervorgangs in der Flüssigkeit bleiben.
   HINWEIS: Die Aufbewahrung der Eizellen im Medium trägt dazu bei, ihre Integrität und ihren optimalen Zustand zu erhalten. Wenn die Eizellen über einen längeren Zeitraum der Luft ausgesetzt werden, können sie austrocknen und beschädigt werden, was sich auf die endgültige Trennleistung auswirkt. Halten Sie die Pipette unter der Flüssigkeitsoberfläche, wenn Sie die Eizellen durch das Zellsieb übertragen, anstatt sie in der Schwebe hinzuzufügen.

4. Waschen

1. Entfernen Sie überschüssiges Medium mit einer Pipette. Fügen Sie 4 ml frisches L-15-Medium hinzu und resuspendieren Sie die Eizellen vorsichtig. Warten Sie 1-2 Minuten, dann entfernen Sie den Überstand.
   HINWEIS: Verwenden Sie Instrumente mit geringen Adhäsionseigenschaften, um eine Beschädigung der Eizellen zu vermeiden.
2. Wiederholen Sie Schritt 4.1 5-6 Mal, bis keine weiteren Verunreinigungen mehr vorhanden sind.
   HINWEIS: Eine schonende Handhabung während des Waschvorgangs ist entscheidend, um Eizellschäden zu vermeiden. Trotz einer Fülle von Eizellen im Stadium I (etwa 200-400 Eizellen im Stadium I von einem Zebrafisch) nach den vorangegangenen Waschschritten können die Eizellen immer noch mit Zellfragmenten, Eizellen aus anderen Stadien oder kleinen Körnchen gemischt werden, die von gebrochenen Eizellen im Spätstadium gebildet wurden. Darüber hinaus können einige Granulosazellen aufgrund einer unvollständigen Enzymverdauung noch an der Oberfläche mehrerer Eizellen haften. Daher sind für Anwendungen, die ein höheres Maß an Reinheit erfordern, wie z. B. die Genomsequenzierung, zusätzliche Schritte erforderlich, um vollständig saubere Eizellen auszuwählen. Um dieses Problem zu beheben, fahren Sie mit den Schritten 5 und 6 fort.

5. Auswahl für die Qualitätskontrolle

1. Übertragen Sie die gewaschenen Eizellen im Stadium I in eine 35-mm-Schale mit frischem L-15-Medium.
2. Entfernen Sie unter einem Mikroskop mit einer Vergrößerung von mindestens 10x Zellfragmenten, Eizellen anderer Stadien und Eizellen im Stadium I, die an Granulosazellen haften, mit einem Werkzeug, das präzise manipuliert werden kann, wie z. B. einer stumpfen Injektionsnadel.
   HINWEIS: Dieser Schritt erfordert Geduld vom Experimentator, gewährleistet jedoch die Isolierung sauberer und intakter Eizellen.
   ACHTUNG: Gehen Sie vorsichtig mit Injektionsnadeln um, um Verletzungen zu vermeiden.

6. Bestätigung durch Kernfärbung

HINWEIS: Zur weiteren Verfeinerung der isolierten Eizellen wurde eine Färbung mit Hoechst 33342 durchgeführt, um einzelne Eizellen zu identifizieren und zu entfernen, die an Granulosazellen hafteten und im vorherigen Schritt möglicherweise übersehen wurden.

1. Geben Sie eine Endkonzentration von 5 μg/mL Hoechst 33342 in das L-15-Medium und inkubieren Sie es 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
2. Beobachten Sie die Hoechst-Fluoreszenz durch ein Fluoreszenzmikroskop unter UV-Laseranregung.
   HINWEIS: Hoechst wird typischerweise im ultravioletten Bereich angeregt, normalerweise bei Wellenlängen zwischen 310 und 360 nm. Es wird empfohlen, während dieses Vorgangs eine Vergrößerung zwischen 80x und 100x zu verwenden. Verwenden Sie den automatischen Belichtungsmodus. Die Anregungswellenlänge und die Belichtungszeit können je nach Mikroskopmodell und individuellen Anforderungen angepasst werden.
3. Wählen Sie mit einer Nadel vorsichtig die Eizellen aus, die die gewünschten Kriterien nicht erfüllen.
   HINWEIS: Bei der Visualisierung der Zellen ist ein großes Kernchromatin in der Mitte der Eizelle vorhanden. Würden Granulosazellen an der Eizelle haften, wären kleine und helle Zellkerne sichtbar, die sich am Rand der Eizelle festsetzen (Abbildung 3). Wähle sie unter dem Mikroskop aus.
4. Waschen Sie die Eizellen gründlich und wiederholt mit L-15, um überschüssiges Hoechst zu entfernen.
5. Verwenden Sie die identifizierten Eizellen des Stadiums I direkt für die anschließende Extraktion oder lagern Sie sie nach dem Schockfrosten bei -80 °C in flüssigem Stickstoff.
   ACHTUNG: Tragen Sie eine Gesichtsschutzmaske und kryogene Handschuhe, wenn Sie mit flüssigem Stickstoff und Ultratiefkühlschränken umgehen.

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Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt die Morphologie der Eierstöcke, die sowohl bei adulten als auch bei juvenilen Zebrafischen beobachtet wurde, und zeigt Eizellen in verschiedenen Entwicklungsstadien, die als Referenz dienen. Abbildung 1A zeigt eine grafische Darstellung der Morphologie und Größe der Eizelle in jedem Entwicklungsstadium, beginnend mit dem primären Wachstumsstadium (Stadium I) und endend mit der ovulierten Eizelle (Stadium V)...

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Diskussion

In dieser Studie haben wir eine Methode zur Isolierung reiner und sauberer Eizellen im Stadium I, ohne Granulosazellen, für die nachgelagerte Analyse (insbesondere genomische Analysen) entwickelt. Vergleicht man dieses modifizierte Verfahren mit dem referenzierten Verfahren¹³, so sind die mit diesem Verfahren gewonnenen Eizellen des Stadiums I morphologisch intakt, zahlenmäßig ausreichend und frei von Verunreinigungen mit anderen somatischen Zellen, so dass sie...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kinger's cell dissociation solution	PlantChemMed	PC-33689	Kinger's cell dissociation solution can be stored stably at -20 °C after packaging and can be used after thawing at low temperature (4 °C). It can be used directly for dissociating zebrafish ovaries. The optimal temperature is 28.5 °C, for approximately 2-3 hours. The duration can be adjusted according to the specific dissociation conditions, either shortened or extended (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689).
Cell strainers (100 μm )	Falcon	352360
Fluorescence microscope	Zeiss	Axio Zoom.V16
Forceps	Dumont	#5
Glass capillary needle	/	/	Blunted by burning with lighter
Hoechst	Yesen	40732ES03
Low adsorption pipette tips (10 μl )	Labsellect	T-0010-LR-R-S
Leibovitz’s L-15 medium medium (with L-glutamine)	Hyclone	SH30525.01
Ice bucket	/	/	Ice-cold water is used to euthanize zebrafish
Incubator	WIGGENS	WH-01
Juvenile fish	/	/	5–6 weeks post-fertilization, standard length [SL] of 10–15 mm
Plastic dish (35 mm )	SORFA	230101
Stereomicroscope	Motic	SMZ-161
Tissue Culture Plate (6-wells)	SORFA	0110006
Vannas spring scissors	Fine Science Toosl	#15000-00