Schnelle Isolierung von Eizellen im Stadium I bei Zebrafischen ohne Granulosazellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein modifiziertes Verfahren zur schnellen Isolierung sauberer Eizellen im Stadium I in Zebrafischen ohne Granulosazellen und bietet damit eine geeignete Methode für die eizellspezifische Forschung.

Zusammenfassung

Die Erforschung der Eizellentwicklung hat erhebliche Auswirkungen auf die Entwicklungsbiologie. Der Zebrafisch (Danio rerio) wurde ausgiebig als Modellorganismus genutzt, um frühe Entwicklungsprozesse von der Eizelle bis zum Embryo zu untersuchen. Im Zebrafisch sind die Eizellen von einer einzigen Schicht somatischer Granulosazellen umgeben. Die Trennung von Granulosazellen von Eizellen stellt jedoch eine Herausforderung dar, da die Gewinnung reiner Eizellen für eine präzise Analyse entscheidend ist. Obwohl verschiedene Methoden zur Isolierung von Zebrafisch-Eizellen in verschiedenen Entwicklungsstadien vorgeschlagen wurden, reichen die derzeitigen Techniken nicht aus, um Granulosazellen vollständig zu entfernen, was die Genauigkeit der Genomanalyse, die sich ausschließlich auf Eizellen konzentriert, einschränkt. In dieser Studie haben wir erfolgreich ein schnelles und effizientes Verfahren entwickelt, um reine Eizellen im Stadium I im Zebrafisch zu isolieren und gleichzeitig die Kontamination von Granulosazellen zu eliminieren. Diese Technik erleichtert die biochemische und molekulare Analyse, insbesondere bei der Erforschung epigenetischer und genomstrukturspezifischer Aspekte von Eizellen. Insbesondere ist die Methode benutzerfreundlich, minimiert Eizellschäden und bietet eine praktische Lösung für die anschließende Forschung und Analyse.

Einleitung

Der Zebrafisch gehört zu den wichtigsten Modellsystemen der Entwicklungsbiologie. In den letzten Jahren wurde der Zebrafisch in zahlreichen Studien als Modell genutzt, um wichtige biologische Ereignisse und Regulationsprozesse von der Eizelle bis zum Embryo zu untersuchen. Diese umfassen die komplexen Prozesse der Entwicklung und Reifung von Eizellen¹, die Funktionalität mütterlicher Gene², die Regulation von mütterlich-zygotischen Übergängen³ und umfangreiche Omics-Analysen⁴.

Granulosazellen, die somatischen Zel....

Protokoll

Alle Zebrafische wurden nach strengen Tierhaltungsrichtlinien behandelt, die von den zuständigen nationalen und/oder lokalen Tierschutzbehörden festgelegt wurden. Die Haltung und der Umgang mit Fischen wurden sowohl von den lokalen Behörden als auch von der Tierethikkommission des Westchinesischen Krankenhauses der Sichuan Universität genehmigt (Zulassung Nr. 20220422003). Die Eierstöcke des Zebrafisches enthalten eine Mischung aus mehrstufigen Eizellen, wobei jedes Entwicklungsstadium in den Eierstöcken der adulten Zebrafische vorhanden ist. Für diese Studie wurden jedoch juvenile Zebrafische ausgewählt, da die Eizellen im Spätstadiu....

Diskussion

In dieser Studie haben wir eine Methode zur Isolierung reiner und sauberer Eizellen im Stadium I, ohne Granulosazellen, für die nachgelagerte Analyse (insbesondere genomische Analysen) entwickelt. Vergleicht man dieses modifizierte Verfahren mit dem referenzierten Verfahren¹³, so sind die mit diesem Verfahren gewonnenen Eizellen des Stadiums I morphologisch intakt, zahlenmäßig ausreichend und frei von Verunreinigungen mit anderen somatischen Zellen, so dass sie.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kinger's cell dissociation solution	PlantChemMed	PC-33689	Kinger's cell dissociation solution can be stored stably at -20 °C after packaging and can be used after thawing at low temperature (4 °C). It can be used directly for dissociating zebrafish ovaries. The optimal temperature is 28.5 °C, for approximately 2-3 hours. The duration can be adjusted according to the specific dissociation conditions, either shortened or extended (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689).
Cell strainers (100 μm )	Falcon	352360
Fluorescence microscope	Zeiss	Axio Zoom.V16
Forceps	Dumont	#5
Glass capillary needle	/	/	Blunted by burning with lighter
Hoechst	Yesen	40732ES03
Low adsorption pipette tips (10 μl )	Labsellect	T-0010-LR-R-S
Leibovitz’s L-15 medium medium (with L-glutamine)	Hyclone	SH30525.01
Ice bucket	/	/	Ice-cold water is used to euthanize zebrafish
Incubator	WIGGENS	WH-01
Juvenile fish	/	/	5–6 weeks post-fertilization, standard length [SL] of 10–15 mm
Plastic dish (35 mm )	SORFA	230101
Stereomicroscope	Motic	SMZ-161
Tissue Culture Plate (6-wells)	SORFA	0110006
Vannas spring scissors	Fine Science Toosl	#15000-00