آلات نانوية قائمة على DNAzyme 10-23 للتعرف على الحمض النووي

Summary

يمكن استخدام الآلات النانوية القائمة على الحمض النووي للكشف الانتقائي والحساس للغاية عن الأحماض النووية. توضح هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لتصميم آلات النانو القائمة على الحمض النووي مع نواة 10-23 باستخدام البرامج المجانية وتطبيقها في الكشف عن جزء فيروس إبشتاين بار كمثال.

Abstract

الآلات النانوية القائمة على الحمض النووي (DNM) للكشف عن تسلسل الحمض النووي والحمض النووي الريبي (التحليلات) هي هياكل متعددة الوظائف مصنوعة من قليل النيوكليوتيدات. تشمل وظائفها الربط المحكم للتحليل ، والتعرف على التحليل الانتقائي للغاية ، وتضخيم إشارة الفلورسنت عن طريق انشقاقات تحفيزية متعددة لركيزة مراسل فلورية ، وجذب الركيزة الفلورية لزيادة استجابة المستشعر. يتم إرفاق الوحدات الوظيفية بسقالة الحمض النووي الشائعة لعملها التعاوني. تتميز DNMs التي تشق الحمض النووي الريبي 10-23 بحساسية محسنة مقارنة بمجسات التهجين غير التحفيزية. يتم توفير استقرار DNM وزيادة فرص التعرف على الركيزة من خلال جزء DNA مزدوج تقطعت بهم السبل ، بلاط. يمكن ل DNM التمييز بين تحليلين مع اختلاف نيوكليوتيد واحد في الحمض النووي الريبي المطوي والحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل واكتشاف التحليلات بتركيزات ~ 1000 مرة أقل من مجسات التهجين الأخرى الخالية من البروتين. تقدم هذه المقالة المفهوم الكامن وراء الإمكانات التشخيصية لنشاط آلة الحمض النووي النانوية وتلقي نظرة عامة على تصميم DNM وتجميعه وتطبيقه في فحوصات الكشف عن الحمض النووي.

Introduction

واحدة من أقدم الطرق للكشف عن الحمض النووي هي الارتباط التكميلي لقليل النيوكليوتيدات الانتقائية بتسلسل الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي الذي تم تحليله. تستخدم هذه الطريقة شظايا الحمض النووي (المجسات) التي يمكن أن تشكل أزواج قاعدة واتسون-كريك مع تحليل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي^{المستهدف 1}. ثم يتم تمييز المركب عن المادة المراد تحليلها والمسبار غير المنضم من خلال مجموعة متنوعة من التقنيات. تعتمد بعض الطرق ، مثل النشاف الشمالي ، أو التهجين في الموقع ، أو qPCR ، على ظاهرة الربط^{التكميلي 2}. تحتوي مجسات التهجين الأكثر شيوعا على عيبين مهمين: حساسية منخفضة (يمكن أن تصل إلى مستوي....

Protocol

1. تصميم DNM

1. حدد منطقة فريدة داخل الجينوم محل الاهتمام.
   ملاحظة: يستخدم هذا العمل منطقة من جينوم فيروس إبشتاين بار (EBV) في المواضع 13972-14154 (OR652423.1).
2. قم بإنشاء مجموعة تمهيدية لتضخيم الجزء المحدد ، على سبيل المثال ، عبر أداة Primer3 المضمنة في Ugene²⁶.
3. افتح أداة الويب^{UNAFold 27} (انظر جدول المواد) وأدخل المنطقة المحددة. قم بتغيير درجة حرارة الطي إلى 55 درجة مئوية ، والظروف الأيونية إلى 250 مللي متر من الأيونات أحادية التكافؤ ، و 200 مللي متر من المغنيسيوم²⁺.
   1. افتح البنية الثانوية الناتجة لجز....

النتائج

كان الهدف من التجربة الأولى هو توضيح تجميع DNM قبل الجزء الاصطناعي من المادة المراد تحليلها. أضيفت جميع خيوط DNM المكونة إلى المخزن المؤقت للتفاعل وتم تجميعها في الكأس الزجاجية. تم تقييم مركب DNM المجمع لحجمه الصحيح وتجانسه بواسطة PAGE الأصلي. تظهر الصفحة الأصلية DNM المجمع مع ا.......

Discussion

تصميم آلات الحمض النووي واضح ومباشر ولكنه يتطلب بعض الخبرة في تصميم مجسات التهجين أو الهياكل النانوية الوظيفية للحمض النووي. من المناسب إبقاء الجزء المراد تحليله قصيرا قدر الإمكان لتقليل عدد الهياكل الثانوية الممكنة وتبسيط غزو DNM إلى الهيكل الثانوي. يفضل أن يكون محتوى C.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tube	Biofil	CFT011015
100 bp+ DNA Ladder	Evrogen	NL002
100-1000 µL pipette	Kirgen	KG-Pro1000
10-100 µL pipette	Kirgen	KG-Pro100
1-10 µL pipette	Kirgen	KG-Pro10
20-200 µL pipette	Kirgen	KG-Pro200
2-20 µL pipette	Kirgen	KG-Pro20
4x Gel Loading Dye	Evrogen	PB020
Acrylamide 4K	AppliChem	A1090,0500
Ammonium persulfate	Carl Roth	2809447
Biorender	Biorender		https://www.biorender.com
Bisacrylamide	Molekula	22797959
Boric Acid	TechSnab	H-0202
ChemiDoc imaging system	BioRad	12003153
Costar 96-Well Black Polystyrene Plate	Corning	COS3915
DinaMelt	RNA Institute		http://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php
EDTA	Amresco	Am-O105
Ethidium bromide	BioLabMix	EtBr-10
HEPES	Amresco	Am-O485
Magnesium chloride	AppliChem	131396
Mini Protean Tetra Cell	BioRad	1658001EDU
pipette 10 µL tips	Kirgen	KG1111-L
pipette 1000 µL tips	Kirgen	KG1636
pipette 200 µL tips	Kirgen	KG1212-L
Pixelmator Pro	Pixelmator Team		https://www.pixelmator.com/pro/
Potassium chloride	Carl Roth	1782751
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050
RNAse/DNAse free water	Invitrogen	10977049
Sealing film for PCR plates	Sovtech	P-502
Sodium chloride	Vekton	HCh (0,1)
Spark multimode microplate reader	Tecan	Spark- 10M
T100 amplificator	BioRad	10014822
TEMED	Molekula	68604730
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Amresco	Am-O497
UNAFold	RNA Institute		http://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php
Water bath	LOIP	LB-140
Oligos used
Analyte:	Evrogen		direct order, standard desalting purification
GAGCACTTGGTCAGGCACACGG ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG CGGACTACGCCTTCGTTGC
Tile-Arm3:	Evrogen		direct order, standard desalting purification
CCG GGCTGCTGTGCCATTTT TTGCTGACTACTGTCACCTCT CTGCTAGTCT
Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC CGCTGACCACAACGAGAGGAA ACCTT	Evrogen		direct order, standard desalting purification
Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT GTCCGTGTGCCTGACCA	Evrogen		direct order, standard desalting purification
F-sub oligonucleotide: AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU CCCTGGGCA-BHQ1	DNA-Syntez		direct order, HPLC purification