JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يمكن استخدام الآلات النانوية القائمة على الحمض النووي للكشف الانتقائي والحساس للغاية عن الأحماض النووية. توضح هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لتصميم آلات النانو القائمة على الحمض النووي مع نواة 10-23 باستخدام البرامج المجانية وتطبيقها في الكشف عن جزء فيروس إبشتاين بار كمثال.

Abstract

الآلات النانوية القائمة على الحمض النووي (DNM) للكشف عن تسلسل الحمض النووي والحمض النووي الريبي (التحليلات) هي هياكل متعددة الوظائف مصنوعة من قليل النيوكليوتيدات. تشمل وظائفها الربط المحكم للتحليل ، والتعرف على التحليل الانتقائي للغاية ، وتضخيم إشارة الفلورسنت عن طريق انشقاقات تحفيزية متعددة لركيزة مراسل فلورية ، وجذب الركيزة الفلورية لزيادة استجابة المستشعر. يتم إرفاق الوحدات الوظيفية بسقالة الحمض النووي الشائعة لعملها التعاوني. تتميز DNMs التي تشق الحمض النووي الريبي 10-23 بحساسية محسنة مقارنة بمجسات التهجين غير التحفيزية. يتم توفير استقرار DNM وزيادة فرص التعرف على الركيزة من خلال جزء DNA مزدوج تقطعت بهم السبل ، بلاط. يمكن ل DNM التمييز بين تحليلين مع اختلاف نيوكليوتيد واحد في الحمض النووي الريبي المطوي والحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل واكتشاف التحليلات بتركيزات ~ 1000 مرة أقل من مجسات التهجين الأخرى الخالية من البروتين. تقدم هذه المقالة المفهوم الكامن وراء الإمكانات التشخيصية لنشاط آلة الحمض النووي النانوية وتلقي نظرة عامة على تصميم DNM وتجميعه وتطبيقه في فحوصات الكشف عن الحمض النووي.

Introduction

واحدة من أقدم الطرق للكشف عن الحمض النووي هي الارتباط التكميلي لقليل النيوكليوتيدات الانتقائية بتسلسل الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي الذي تم تحليله. تستخدم هذه الطريقة شظايا الحمض النووي (المجسات) التي يمكن أن تشكل أزواج قاعدة واتسون-كريك مع تحليل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبيالمستهدف 1. ثم يتم تمييز المركب عن المادة المراد تحليلها والمسبار غير المنضم من خلال مجموعة متنوعة من التقنيات. تعتمد بعض الطرق ، مثل النشاف الشمالي ، أو التهجين في الموقع ، أو qPCR ، على ظاهرة الربطالتكميلي 2. تحتوي مجسات التهجين الأكثر شيوعا على عيبين مهمين: حساسية منخفضة (يمكن أن تصل إلى مستويات ميكرومولار إلى نانومولية) بالإضافة إلى انتقائية منخفضة لاختلافات النوكليوتيدات المفردة (SNV) ، بما في ذلك الطفرات النقطية. تتطلب القضية نهجا متطورا لأن حلول هذه العيوب تتعارض مع بعضها البعض3. لتوفير أفضل انتقائية ، يجب أن يظل قليل النوكليوتيد المكتشف قصيرا بما يكفي لتشكيل هجين غير مستقر مع تحليلات غير متطابقة. هذه oligonucleotides القصيرة غير قادرة على ربط الأحماض النووية المستهدفة بإحكام وفك هياكلها الثانوية ، وبالتالي غالبا ما تفشل في توفير إشارة يمكن اكتشافها. من الصعب بشكل خاص اكتشاف الشظايا الغنية ب CG في الحمض النووي الريبي البيولوجي ، أو الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل (dsDNA). من ناحية أخرى ، فإن المجسات الطويلة غير حساسة ل SNV3. لكسر الجمود ، تم تطوير مفهوم المسبار الثنائي4.

تقوم المستشعرات الثنائية بتقسيم مسبار الكشف الواحد إلى قطعتين وتخصيص شظاياه ، مع إبقاء إحداهما طويلة لفك دبابيس الشعر أو غزو dsDNA. يبقى جزء المسبار الثنائي الثاني قصيرا ليكون حساسا لقاعدة غير متطابقة ، وبالتالي يوفر وسيلة للكشف عن SNV. سيتم إنتاج الإشارة إذا تم ربط جزأي المستشعر الثنائي معا4. يمكن تصور المجمع الكامل عبر FRET5 ، أو مسبار المنارة الجزيئي 6,7 ، أو G-quadruplexes مع نشاط يشبه البيروكسيديز 8,9,10 ، أو شق الحمض النووي الريبي 11,12,13 DNAzyme. تم وصف المستشعرات الثنائية ذات النواة 10-23 DNAzyme بإسهاب. لقد تم تكييفها للكشف عن شظايا الحمض النووي التي تقطعت بها السبل والتي تم إنشاؤها صناعيا11 ، أو منتجات التضخيم أحادية الشريط14,15. من الممكن أيضا الكشف بدون تضخيم ، على سبيل المثال ، في حالة 16S rRNA المستخرجة من ثقافة الخلية ، لأن هذا الجزيء وفير في الخلايا12,16. يمكن أيضا تكييف المستشعرات الثنائية ذات النواة 10-23 DNAzyme للكشف عن الحمض النووي غير النووي ، مثل أيونات الرصاص17. ومع ذلك ، لا تزال الحساسية المنخفضة تعتبر أحد العيوب الرئيسية لأجهزة استشعار الحمض النووي الثنائية 10-23 ، وقد تم تطوير نهج مختلفة ، بما في ذلك Cascades18 أو طرق بديلة لتعزيز الإشارة19 ، لمعالجة هذه المشكلة. لسوء الحظ ، فإن التقنيات المذكورة أعلاه تزيد بشكل كبير من تكلفة وعدم استقرار مكونات المستشعر ، وبالتالي لم تدخل حيز التنفيذ.

تستخدم التجربة الموصوفة في هذا العمل 10-23 مستشعرا نانويا للحمض النووي قائما على الحمض النووي يشار إليه باسم آلات الحمض النووي النانوية (DNM)20,21. تتضمن هذه الهياكل مستشعرات ثنائية وأيضا (1) ميسري الحمض النووي الذين يحيطون بالمسبار الثنائي ، ويفككون المناطق المهيكلة ويغزون الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل ، و (2) بلاط الحمض النووي الذي يربط جميع أجزاء DNM معا على مقربة ويزيد من فرص تكوين الإشارة (الشكل 1). إجمالا ، تقلل DNMs القائمة على 10-23 DNAzyme من حد الكشف (LOD) وصولا إلى النطاق البيكومولار21 ؛ يمكن استخدامها للكشف عن 16rRNA في الخليةالمحللة 22 أو الإبلاغ عن وجود الحمض النووي الريبي الفيروسي دون تضخيم23,24. في الوقت نفسه ، تظل DNMs حساسة ل SNV ويمكن حتى استخدامها في النمط الجيني للأليلات في الكائنات غير المتجانسة25. يمكن استخدام طريقة DNM كتقنية تكميلية لأي نوع تضخيم لتصور المنتج أو تحديد المنتج في خليط معقد بانتقائية عالية. لا تتطلب DNMs ، على عكس TaqMan التقليدية ومجسات المنارة ، تسخين العينة وبالتالي يمكن استخدامها في بروتوكولات الكشف عن نقطة النهاية ، مما يجعل الكشف الإجمالي فعالا من حيث التكلفة.

توضح هذه المقالة تطوير السيليكو ل DNM وتوضح إجراءات التجميع والتوصيف الوظيفي ل DNM. تم تنفيذ العمل باستخدام جزء اصطناعي من فيروس إبشتاين بار (EBV) المقابل للمواضع 13972-14154 من الحمض النووي الفيروسي (OR652423.1) (انظر جدول المواد).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. تصميم DNM

  1. حدد منطقة فريدة داخل الجينوم محل الاهتمام.
    ملاحظة: يستخدم هذا العمل منطقة من جينوم فيروس إبشتاين بار (EBV) في المواضع 13972-14154 (OR652423.1).
  2. قم بإنشاء مجموعة تمهيدية لتضخيم الجزء المحدد ، على سبيل المثال ، عبر أداة Primer3 المضمنة في Ugene26.
  3. افتح أداة الويبUNAFold 27 (انظر جدول المواد) وأدخل المنطقة المحددة. قم بتغيير درجة حرارة الطي إلى 55 درجة مئوية ، والظروف الأيونية إلى 250 مللي متر من الأيونات أحادية التكافؤ ، و 200 مللي متر من المغنيسيوم2+.
    1. افتح البنية الثانوية الناتجة لجزء ssDNA وحدد دبوس شعر ثابت. حدد موقع ارتباط آلات الحمض النووي النانوية في المناطق غير المهيكلة أو ، بدلا من ذلك ، على حلقات هياكل دبوس الشعر لتحقيق ارتباط أقوى للهدف.
  4. إذا كان موقع التحليل المستهدف مطويا في بنية حلقة جذعية ، فضع الذراع 1 و 2 على النحو التالي: تأكد من أن الذراع 2 يربط جانبا واحدا من الجذع والحلقة و 3-5 nt من جانب الجذع الثاني ؛ الذراع 1 يربط جزءا من الجانب الجذعي الثاني.
  5. افتح أداة DinaMelt28 (انظر جدول المواد) وقم بتحليل تسلسل الأذرع وتسلسلات تكميلها العكسي. استخدم أداة DinaMelt للتأكد من أن Tm of Arms 2 و 3 أعلى من 65 درجة مئوية: على الأقل 10 درجات مئوية فوق درجة حرارة الفحص (55 درجة مئوية).
    1. حافظ على Tm من الذراع 1 على الأقل 1-3 درجة مئوية فوق درجة حرارة التفاعل (55 درجة مئوية) إذا كان سيتم تحقيق انتقائية التعرف العالية29.
  6. اجمع بين تسلسلات Arms 1 و 2 مع نصفي نواة DNAzyme وشظايا الربط F-sub13.
  7. تحليل البنية الثانوية لخيوط الحمض النووي المصممة باستخدام UNAFold27.
    ملاحظة: 55 درجة مئوية (درجة حرارة الفحص) ، 200 مللي متر Mg2+ ، 250 مللي متر أيونات أحادية التكافؤ (HEPES ، Na + ، K +).
    1. استخدم التصميم فقط إذا كان ΔG القابل للطي أقل من - 4 كيلو كالوري / مول. حاول تجنب التسلسلات الطويلة الغنية ب CG. إذا كان الهيكل الثانوي مستقرا جدا ، فقم بإدخال طفرة في الذراع لزيادة الطي ΔG30. بدلا من ذلك ، يعد وضع Arm 3 2-3 nt بعيدا عن Arm 2 استراتيجية أخرى لتغيير تسلسل Arm 3 لتجنب الهياكل المستقرة بين الجزيئات.
  8. قم بإنشاء تسلسل عشوائي لجزء بلاط DNA طالما Arm 3. اجمع تسلسل Arm 3 مع تسلسل بلاط الحمض النووي عبر (dT) 4-6 أو جلايكول الإيثيلين (على سبيل المثال ، ثلاثي إيثيلين جلايكول (TEG) أو سداسي إيثيلين جلايكول (HEG)). يستخدم إصدار DNM المقدم في التجربة (dT)6.
  9. ربط الذراع 2 بالتسلسل المكمل لجزء تجانب الحمض النووي المحدد في الخطوة 1.8 عبر رابط.
  10. تحليل البنية الثانوية لخيوط الحمض النووي المصممة باستخدام تطبيق الويب UNAFold. تأكد من أن طاقة الطي لكل شريط DNA أعلى من 4 كيلو جول / مول عند 55 درجة مئوية ، وتجنب التسلسلات الطويلة المخصبة ب CG. على نحو مفضل ، قم بتغيير تسلسل بلاط الحمض النووي.
  11. ارسم الهيكل باستخدام أي برنامج رسومات متجه متاح. تستخدم هذه المقالة Biorender و Pixelmator Pro للتصور (انظر جدول المواد). تحقق من الدقة في الاتجاهات 5'->3' لكل خصلة.
    ملاحظة: الحصول على التسلسلات من بائع تجاري موثوق به.

2. اختبار وظيفي ل DNM

  1. إعداد العازلة والكواشف
    1. تحضير مخزن التفاعل المؤقت المكون من 50 mM HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.5-7.8) ، 50 mM NaCl ، 150 mM KCl ، و 200 mM MgCl2. املأ بالماء منزوع الأيونات حتى 50 مل.
    2. تحضير حصص 10 ميكرومتر من قليل النوكليوتيدات Dzb-Tile و Tile-Arm3. تحضير محلول 1 ميكرومتر من Dza ، و 100 ميكرومتر F-sub ، و 1 نانومتر ، 10 نانومتر ، 100 نانومتر في RNase / الماء الحر أو الماء منزوع الأيونات المعقم. يتم توفير تفاصيل تسلسل قليل النوكليوتيد في جدول المواد.
  2. تجميع DNM
    1. قم بإذابة محاليل قليل النوكليوتيد تماما قبل الاستخدام. مزيج بلطف عن طريق النقر (لا دوامة مكثفة). تدور (بسرعة ، لبضع ثوان) الحل باستخدام جهاز طرد مركزي صغير.
    2. امزج 1 ميكرومتر لكل من Dzb-Tile و Tile-Arm3 في 200 ميكرولتر من مخزن التفاعل المؤقت في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 0.5 مل.
    3. امزج الأنبوب برفق وقم بتدوير المحلول.
    4. لف غطاء الأنبوب المغلق بفيلم البارافين. بدلا من ذلك ، استخدم أنابيب الغطاء اللولبي.
    5. احتضن الأنبوب في دورق سعة 500 مل بالماء المغلي لمدة 2 دقيقة ، ثم أطفئ السخان واترك درجة الحرارة تبرد بشكل سلبي طوال الليل.
    6. قم بإعداد الصفحة الأصلية بنسبة 12٪: امزج 1 مل من 10х TBE buffer ، و 3 مل من 40٪ AA: BA ، وماء منزوع الأيونات حتى 10 مل ، و 50 ميكرولتر من APS ، و 5 ميكرولتر من TEMED (انظر جدول المواد). انقل الخليط إلى كاسيت الجل واتركه يتبلمر.
    7. امزج 1 ميكرولتر من كل عينة ، وهي DNM المجمعة و Dzb-Tile و Tile-arm3 ، مع 1 ميكرولتر من صبغة التحميل 4x وقم بتحميلها في الجل.
    8. ضع الكاسيت في الحجرة ، واملأه بمخزن مؤقت 1x TBE ، واترك الجل يعمل لمدة 90 دقيقة عند 80 فولت.
    9. صبغ الجل ببروميد الإيثيديوم وتصوره باستخدام نظام توثيق الهلام (انظر جدول المواد).
  3. مقايسة LOD
    1. تحضير 160 ميكرولتر من 200 نانومتر F-sub في المخزن المؤقت للتفاعل. يتم ذلك لتقييم الخلفية الأساسية لاستقرار الركيزة.
    2. تحضير 7 حصص من 160 ميكرولتر من DNM و F-sub و Dza المجمعة مسبقا بتركيزات 20 نانومتر من DNM و Dza و 200 نانومتر من F-sub في مخزن التفاعل. من بين الأنابيب السبعة ، احتفظ بالأنبوب # 1 كخلفية فارغة لتقييم التجميع التلقائي لنواة DNAzyme.
    3. أضف المادة المراد تحليلها إلى الأنابيب # 2-7 عند التركيزات النهائية 1 pM و 10 pM و 100 pM و 200 pM و 500 pM و 1000 pM.
    4. امزج الأنابيب برفق ، وقم بتدويرها لأسفل ، وصنف المحاليل إلى ثلاثة أجزاء سعة 50 ميكرولتر في لوحة سوداء ذات 96 بئرا. ختم اللوحة مع فيلم شفاف بصريا.
    5. احتضان اللوحة في حمام مائي عند 55 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تدور أسفل لوحة.
    6. قياس مضان عند 525 نانومتر (λex = 495 نانومتر). احسب المتوسط والانحراف المعياري لكل نقطة.
    7. احسب نسبة الفراغ إلى القاعدية بقسمة إشارة الأنبوب الذي يحتوي على F-sub و DNM على إشارة الأنبوب الذي يحتوي على F-sub فقط. تأكد من أن النسبة ضمن النطاق 1.1-1.5.
    8. احسب نسبة الإشارة إلى الفراغ بقسمة إشارة الأنبوب الذي يحتوي على F-sub وDNM والمادة المراد تحليلها على إشارة الأنبوب الذي يحتوي على F-sub وDNM فقط. اعتبر الإشارة موجبة حقيقية إذا كانت أعلى من متوسط الخلفية بالإضافة إلى ثلاثة انحرافات معيارية.
    9. كرر التجربة مرتين وتأكد من أن الانحراف المعياري بين التكرارات التحليلية أقل من 0.5.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

كان الهدف من التجربة الأولى هو توضيح تجميع DNM قبل الجزء الاصطناعي من المادة المراد تحليلها. أضيفت جميع خيوط DNM المكونة إلى المخزن المؤقت للتفاعل وتم تجميعها في الكأس الزجاجية. تم تقييم مركب DNM المجمع لحجمه الصحيح وتجانسه بواسطة PAGE الأصلي. تظهر الصفحة الأصلية DNM المجمع مع ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تصميم آلات الحمض النووي واضح ومباشر ولكنه يتطلب بعض الخبرة في تصميم مجسات التهجين أو الهياكل النانوية الوظيفية للحمض النووي. من المناسب إبقاء الجزء المراد تحليله قصيرا قدر الإمكان لتقليل عدد الهياكل الثانوية الممكنة وتبسيط غزو DNM إلى الهيكل الثانوي. يفضل أن يكون محتوى C...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يشكروا Ekaterina V. Nikitina على التكرم بتقديم gDNA ل EBV. يشكر مهند عطية وماريا ي. بيريزوفسكايا وماريا س. روبل وزارة التعليم والعلوم في الاتحاد الروسي (المنحة رقم FSER-2022-0009) وبرنامج الأولوية 2030.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL tubeBiofilCFT011015
100 bp+ DNA LadderEvrogenNL002
100-1000 µL pipetteKirgenKG-Pro1000
10-100 µL pipetteKirgenKG-Pro100
1-10 µL pipetteKirgenKG-Pro10
20-200 µL pipetteKirgenKG-Pro200
2-20 µL pipetteKirgenKG-Pro20
4x Gel Loading DyeEvrogenPB020
Acrylamide 4KAppliChemA1090,0500
Ammonium persulfateCarl Roth2809447
BiorenderBiorenderhttps://www.biorender.com
BisacrylamideMolekula22797959
Boric AcidTechSnabH-0202
ChemiDoc imaging systemBioRad12003153
Costar 96-Well Black Polystyrene PlateCorningCOS3915
DinaMeltRNA Institutehttp://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php
EDTAAmrescoAm-O105
Ethidium bromideBioLabMixEtBr-10
HEPESAmrescoAm-O485
Magnesium chlorideAppliChem131396
Mini Protean Tetra CellBioRad1658001EDU
pipette 10 µL tipsKirgenKG1111-L
pipette 1000 µL tipsKirgenKG1636
pipette 200 µL tipsKirgenKG1212-L
Pixelmator ProPixelmator Teamhttps://www.pixelmator.com/pro/
Potassium chlorideCarl Roth1782751
PowerPac Basic Power SupplyBioRad1645050
RNAse/DNAse free waterInvitrogen10977049
Sealing film for PCR platesSovtechP-502
Sodium chlorideVektonHCh (0,1)
Spark multimode microplate readerTecanSpark- 10M
T100 amplificatorBioRad10014822
TEMEDMolekula68604730
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneAmrescoAm-O497
UNAFoldRNA Institutehttp://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php
Water bathLOIPLB-140
Oligos used
Analyte:Evrogendirect order, standard desalting purification
GAGCACTTGGTCAGGCACACGG
ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG
TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG
GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG
CGGACTACGCCTTCGTTGC
Tile-Arm3:Evrogendirect order, standard desalting purification
CCG GGCTGCTGTGCCATTTT
TTGCTGACTACTGTCACCTCT
CTGCTAGTCT
Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG
TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC
CGCTGACCACAACGAGAGGAA
ACCTT		Evrogendirect order, standard desalting purification
Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT
GTCCGTGTGCCTGACCA		Evrogendirect order, standard desalting purification
F-sub oligonucleotide: AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU
CCCTGGGCA-BHQ1		DNA-Syntezdirect order, HPLC purification

References

  1. Kolpashchikov, D. M. Evolution of hybridization probes to DNA machines and robots. Acc. Chem Res. 52, 1949-1956 (2019).
  2. Guo, J., Ju, J., Turro, N. J. Fluorescent hybridization probes for nucleic acid detection. Anal. Bioanal Chem. 402, 3115-3125 (2012).
  3. Demidov, V. V., Frank-Kamenetskii, M. D. Two sides of the coin: affinity and specificity of nucleic acid interactions. Tr Bioche Sc. 29 (2), 62-71 (2004).
  4. Kolpashchikov, D. M. Binary probes for nucleic acid analysis. Chem Rev. 110, 4709-4723 (2010).
  5. Marti, A. A., Jockusch, S., Stevens, N., Ju, J., Turro, N. J. Fluorescent hybridization probes for sensitive and selective DNA and RNA detection. Acc Chem Res. 40 (6), 402-409 (2007).
  6. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Detection of bacterial 16S rRNA using a molecular beacon-based X sensor. Biosens.Bioelectron. 41, 386-390 (2013).
  7. Dark, P., et al. Accuracy of LightCycler Septi Fast for the detection and identification of pathogens in the blood of patients with suspected sepsis: a systematic review and meta-analysis. Intensive Care Med. 41, 21-33 (2015).
  8. Maltzeva, Y. I., Gorbenko, D. A., Nikitina, E. V., Rubel, M. S., Kolpashchikov, D. M. Visual Detection of Stem-Loop Primer Amplification (SPA) products without denaturation using peroxidase-like DNA machines (PxDM). Int J Mol Sc. 24 (9), 7812(2023).
  9. Gorbenko, D. A., et al. DNA nanomachine for visual detection of structured RNA and double stranded DNA. Chem Comm. 58 (35), 5395-5398 (2022).
  10. Roembke, B. T., Nakayama, S., Sintim, H. O. Nucleic acid detection using G-quadruplex amplification methodologies. Methods. 64 (3), 185-198 (2013).
  11. Mokany, E., Bone, S. M., Young, P. E., Doan, T. B., Todd, A. V. MNAzymes, a versatile new class of nucleic acid enzymes that can function as biosensors and molecular switches. JACS. 132 (3), 1051-1059 (2010).
  12. Gerasimova, Y. V., Cornett, E., Kolpashchikov, D. M. RNA cleaving deoxyribozyme sensor for nucleic acid analysis: the limit of detection. Chem Bio Chem. 11, 811-817 (2010).
  13. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Folding 16S RNA in a signal-producing structure for detection of bacteria. Angew Chem Int Ed. 52, 10586-10588 (2013).
  14. Hu, M., et al. Allosteric DNAzyme-based encoder for molecular information transfer. Chin. Chem Let. , 109232(2023).
  15. Peeters, B., et al. Solid-phase PCR-amplified DNAzyme activity for real-time FO-SPR detection of the MCR-2 gene. Anal Chem. 92 (15), 10783-10791 (2020).
  16. Wood, H. N., et al. Species typing of nontuberculous Mycobacteria by use of deoxyribozyme sensors. Clin Chem. 65 (2), 333-341 (2019).
  17. Yan, T., et al. Ultralow background one-pot detection of Lead (II) using a non-enzymatic double-cycle system mediated by a hairpin-involved DNAzyme. Biosen Bioelectron. 237, 115534(2023).
  18. Hasick, N. J., Radhika, R., Todd, A. V. Subzymes: Regulating DNAzymes for point of care nucleic acid sensing. Sens. Act. B: Chem. 297, 126704(2019).
  19. Safdar, S., et al. DNA-only, microwell-based bioassay for multiplex nucleic acid detection with single base-pair resolution using MNAzymes. Biosen Bioelectron. 152, 112017(2020).
  20. Cox, A. J., Bengtson, H. N., Gerasimova, Y. V., Rohde, K. H., Kolpashchikov, D. M. DNA antenna tile-associated deoxyribozyme sensor with improved sensitivity. Chem Bio Chem. 17 (21), 2038-2041 (2016).
  21. Lyalina, T. A., Goncharova, E. A., Prokofeva, N. Y., Voroshilina, E. S., Kolpashchikov, D. M. A DNA minimachine for selective and sensitive detection of DNA. Analyst. 144 (2), 416-420 (2019).
  22. Ateiah, M., Gandalipov, E. R., Rubel, A. A., Rubel, M. S., Kolpashchikov, D. M. DNA Nanomachine (DNM) Biplex Assay for Differentiating Bacillus cereus Species. Int J Mol Sc. 24 (5), 4473(2023).
  23. El-Deeb, A. A., et al. Toward a home test for COVID-19 diagnosis: DNA machine for amplification-free SARS-CoV-2 detection in clinical samples. Chem Med Chem. 17 (20), 202200382(2022).
  24. Kirichenko, A., Bryushkova, E., Dedkov, V., Dolgova, A. A Novel DNAzyme-based fluorescent biosensor for detection of RNA-containing Nipah henipavirus. Biosensors. 13 (2), 252(2023).
  25. Akhmetova, M. M., Rubel, M. S., Afanasenko, O. S., Kolpashchikov, D. M. Barley haplotyping using biplex deoxyribozyme nanomachine. Sens Act Rep. 4, 100132(2022).
  26. Okonechnikov, K., et al. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics. 28, 1166-1167 (2012).
  27. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
  28. Markham, N. R., Zuker, M. DINAMelt web server for nucleic acid melting prediction. Nucleic Acids Res. 33, Web Server issue W577-W581 (2005).
  29. Stancescu, M., Fedotova, T. A., Hooyberghs, J., Balaeff, A., Kolpashchikov, D. M. Nonequilibrium hybridization enables discrimination of a point mutation within 5-40 C. JACS. 138 (41), 13465-13468 (2016).
  30. Dong, J., Ouyang, Y., Wang, J., O'Hagan, M. P., Willner, I. Assembly of dynamic gated and cascaded transient DNAzyme networks. ACS Nano. 16 (4), 6153-6164 (2022).
  31. Montserrat Pagès, A., Hertog, M., Nicolaï, B., Spasic, D., Lammertyn, J. Unraveling the kinetics of the 10-23 RNA-cleaving DNAzyme. Int J Mol Sc. 24 (18), 13686(2023).
  32. Nguyen, C., Grimes, J., Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Molecular-beacon-based tricomponent probe for SNP analysis in folded nucleic acids. Chem-eur J. 17 (46), 13052-13058 (2011).
  33. MacDougall, D., Crummett, W. B. Guidelines for data acquisition and data quality evaluation in environmental chemistry. Anal Chem. 52 (14), 2242-2249 (1980).
  34. Gerasimova, Y. V., Yakovchuk, P., Dedkova, L. M., Hecht, S. M., Kolpashchikov, D. M. Expedited quantification of genetically modified ribosomal RNA by binary deoxyribozyme sensors. RNA. 10, 1834-1843 (2015).
  35. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Folding 16S RNA in a signal-producing structure for detection of bacteria. Angew Chem Int Ed. 52, 10586-10588 (2013).
  36. GC Content Calculator. , Available from: https://www.biologicscorp.com/tools/GCContent/#.ZEfxPiyOHYU (2023).
  37. Hussein, Z., et al. DNAzyme nanomachine with fluorogenic substrate delivery function: advancing sensitivity in nucleic acid detection. Anal Chem. 95 (51), 18667-18672 (2023).
  38. Safdar, S., et al. DNA-only, microwell-based bioassay for multiplex nucleic acid detection with single base-pair resolution using MNAzymes. Biosen Bioelectron. 152, 112017(2020).
  39. Gerasimova, Y. V., et al. Deoxyribozyme cascade for visual detection of bacterial RNA. Chem Bio Chem. 14, 2087-2090 (2013).
  40. Eckert, K. A., Kunkel, T. A. DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction. Gen Res. 1 (1), 17-24 (1991).
  41. Pandya, K., Jagani, D., Singh, N. CRISPR-Cas systems: Programmable nuclease revolutionizing the molecular diagnosis. Mol Biotech. , (2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

10 23 DNAzyme

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved