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Resumo

As nanomáquinas baseadas em DNAzyme podem ser usadas para detecção altamente seletiva e sensível de ácidos nucléicos. Este artigo descreve um protocolo detalhado para o projeto de nanomáquinas baseadas em DNAzyme com um núcleo 10-23 usando software livre e sua aplicação na detecção de um fragmento de vírus Epstein-Barr como exemplo.

Resumo

As nanomáquinas baseadas em DNAzyme (DNM) para a detecção de sequências de DNA e RNA (analitos) são estruturas multifuncionais feitas de oligonucleotídeos. Suas funções incluem ligação apertada do analito, reconhecimento altamente seletivo do analito, amplificação de sinal fluorescente por múltiplas clivagens catalíticas de um substrato repórter fluorogênico e atração de substrato fluorogênico para um aumento na resposta do sensor. As unidades funcionais são anexadas a um andaime de DNA comum para sua ação cooperativa. Os DNMs 10-23 de clivagem de RNA apresentam sensibilidade aprimorada em comparação com sondas de hibridização não catalíticas. A estabilidade do DNM e o aumento das chances de reconhecimento do substrato são fornecidos por um fragmento de DNA de fita dupla, um ladrilho. O DNM pode diferenciar dois analitos com uma única diferença de nucleotídeo em um RNA dobrado e um DNA de fita dupla e detectar analitos em concentrações ~ 1000 vezes menores do que outras sondas de hibridização livre de proteínas. Este artigo apresenta o conceito por trás do potencial diagnóstico da atividade da DNA-nanomáquina e apresenta uma visão geral do projeto, montagem e aplicação do DNM em ensaios de detecção de ácido nucleico.

Introdução

Um dos primeiros métodos para detecção de ácidos nucleicos é a ligação complementar de oligonucleotídeos seletivos às sequências de RNA ou DNA analisadas. Este método emprega fragmentos de ácido nucleico (sondas) que podem formar pares de bases Watson-Crick com um analito de DNA ou RNA direcionado1. O complexo é então diferenciado do analito e da sonda não ligada por uma variedade de técnicas. Certos métodos, como Northern blotting, hibridização in situ ou qPCR, são baseados no fenômeno da ligação complementar2. As sondas de hibridização mais comuns têm duas desvantagens significativas: baixa sensibilidade (podem atingir níveis micromolares a nanomolares), bem como baixa seletividade a variações de nucleotídeo único (SNV), incluindo mutações pontuais. A questão requer uma abordagem sofisticada, uma vez que as soluções para essas desvantagens entram em conflito entre si3. Para fornecer a melhor seletividade, o oligonucleotídeo de detecção deve ser mantido curto o suficiente para formar híbridos instáveis com analitos incompatíveis. Esses oligonucleotídeos curtos não são capazes de se ligar firmemente aos ácidos nucléicos direcionados e desenrolar suas estruturas secundárias, muitas vezes falhando em fornecer um sinal detectável. É especialmente desafiador detectar fragmentos ricos em CG no RNA biológico ou DNA de fita dupla (dsDNA). Por outro lado, as sondas longas são insensíveis ao SNV3. Para quebrar o impasse, o conceito de uma sonda binária foi desenvolvido4.

Sensores binários dividem uma única sonda de detecção em duas partes e especializam seus fragmentos, mantendo um deles longo para desenrolar os grampos de cabelo ou invadir o dsDNA. O segundo fragmento de sonda binária permanece curto para ser sensível a uma base incompatível, fornecendo assim um meio de detectar SNV. O sinal será produzido se as duas partes binárias do sensor forem unidas4. O complexo completo pode ser visualizado via FRET5, sonda de farol molecular 6,7 ou G-quadruplexes com atividade semelhante à peroxidase 8,9,10, ou então RNA-clivagem 11,12,13 DNAzyme. Sensores binários com um núcleo DNAzyme 10-23 foram amplamente descritos. Eles foram adaptados para detectar fragmentos de ácido nucleico de fita simples criados sinteticamente11 ou produtos de amplificação de fita simples14,15. A detecção sem amplificação também é possível, por exemplo, no caso do rRNA 16S extraído de uma cultura celular, uma vez que essa molécula é abundante nas células12,16. Sensores binários com um núcleo DNAzyme 10-23 também podem ser adaptados para detecção de ácidos não nucléicos, como para íons de chumbo17. No entanto, a baixa sensibilidade ainda é considerada uma das principais desvantagens dos sensores binários 10-23 DNAzyme, e várias abordagens, incluindo cascatas18 ou métodos alternativos de aprimoramento de sinal19, foram desenvolvidas para resolver esse problema. Infelizmente, as técnicas acima aumentam drasticamente o custo e a instabilidade dos componentes do sensor e, portanto, não entraram em prática.

O experimento descrito neste trabalho usa 10-23 nanossensores de DNA baseados em DNAzyme, chamados de nanomáquinas de DNA (DNM) 20 , 21 . Essas estruturas incluem sensores binários e também (1) facilitadores de DNA flanqueando a sonda binária, desenrolando as regiões estruturadas e invadindo DNAs de fita dupla, e (2) um bloco de DNA que mantém todas as partes do DNM juntas em estreita proximidade e aumenta as chances de formação de sinal (Figura 1). Ao todo, os DNMs baseados em DNAzyme 10-23 diminuem o limite de detecção (LOD) até a faixa picomolar21; eles podem ser usados para detectar 16rRNA em lisados celulares22 ou relatar a presença de RNA viral sem amplificação23,24. Ao mesmo tempo, os DNMs permanecem sensíveis ao SNV e podem até ser usados para genotipar alelos em organismos heterozigotos25. O método DNM pode ser utilizado como técnica complementar a qualquer tipo de amplificação para visualização ou identificação do produto em uma mistura complexa com alta seletividade. Os DNMs, ao contrário das sondas convencionais TaqMan e beacon, não requerem aquecimento da amostra e, portanto, podem ser usados em protocolos de detecção de ponto final, tornando a detecção geral econômica.

Este artigo descreve o desenvolvimento in silico de um DNM e demonstra procedimentos para montagem e caracterização funcional do DNM. O trabalho foi realizado usando um fragmento sintético do vírus Epstein-Barr (EBV) correspondente às posições 13972-14154 do DNA viral (OR652423.1) (ver Tabela de materiais).

Protocolo

1. Projeto de DNM

  1. Selecione uma região única dentro do genoma de interesse.
    NOTA: Este trabalho usa uma região do genoma do vírus Epstein-Barr (EBV) nas posições 13972-14154 (OR652423.1).
  2. Crie um conjunto de primers para a amplificação do fragmento selecionado, por exemplo, por meio da ferramenta Primer3 incorporada no Ugene26.
  3. Abra a ferramenta da web UNAFold27 (consulte Tabela de Materiais) e insira a região selecionada. Altere a temperatura de dobramento para 55 °C e as condições iônicas para 250 mM de íons monovalentes e 200 mM de Mg2+.
    1. Abra a estrutura secundária resultante do fragmento de ssDNA e selecione um grampo de cabelo estável. Localize o local de ligação das nanomáquinas de DNA nas regiões não estruturadas ou, alternativamente, nas alças das estruturas em grampo para obter uma ligação mais forte do alvo.
  4. Se o local do analito alvo estiver dobrado em uma estrutura de alça de haste, coloque os braços 1 e 2 da seguinte forma: Certifique-se de que o braço 2 une um lado da haste, a alça e 3-5 nt do segundo lado da haste; O braço 1 liga um fragmento do segundo lado da haste.
  5. Abra a ferramenta DinaMelt28 (ver Tabela de Materiais) e analise as sequências dos braços e suas sequências de complemento reverso. Use a ferramenta DinaMelt para certificar-se de que o Tm dos braços 2 e 3 esteja acima de 65 °C: pelo menos 10 °C acima da temperatura do ensaio (55 °C).
    1. Manter o Tm do braço 1 pelo menos 1-3 °C acima da temperatura de reacção (55 °C) se for necessária uma selectividade de reconhecimento elevada29.
  6. Combine as sequências dos Braços 1 e 2 com as metades do núcleo DNAzyme e os fragmentos de ligação F-sub13.
  7. Analise a estrutura secundária das fitas de DNA projetadas usando UNAFold27.
    NOTA: 55 °C (temperatura de ensaio), 200 mM Mg2+, 250 mM de íons monovalentes (HEPES, Na+, K+).
    1. Utilizar o desenho ou modelo apenas se o ΔG dobrável for inferior a - 4 kcal/mol. Tente evitar longas sequências ricas em CG. Se a estrutura secundária for muito estável, introduza uma mutação no braço para aumentar o dobramento ΔG30. Alternativamente, colocar o Braço 3 2-3 nt longe do Braço 2 é outra estratégia para alterar a sequência do Braço 3 para evitar estruturas intermoleculares estáveis.
  8. Crie uma sequência aleatória para o fragmento de bloco de DNA do tamanho do Braço 3. Combine a sequência do Braço 3 com a sequência de blocos de DNA via (dT)4-6 ou etilenoglicol (por exemplo, trietilenoglicol (TEG) ou hexaetilenoglicol (HEG)). A versão DNM apresentada no experimento utiliza (dT)6.
  9. Vincule o Braço 2 com a sequência complementar ao fragmento de bloco de DNA selecionado na etapa 1.8 por meio de um ligante.
  10. Analise a estrutura secundária das fitas de DNA projetadas usando o aplicativo da web UNAFold. Certifique-se de que a energia de dobramento de cada fita de DNA esteja acima de 4 kJ / mol a 55 ° C e evite longas sequências enriquecidas com CG. De preferência, altere a sequência do bloco de DNA.
  11. Desenhe a estrutura usando qualquer software de gráficos vetoriais disponível. Este artigo usa Biorender e Pixelmator Pro para visualização (consulte Tabela de materiais). Verifique a precisão em direções de 5'->3' para cada fio.
    NOTA: Obtenha as sequências de um fornecedor comercial confiável.

2. Teste funcional do DNM

  1. Preparação de tampão e reagentes
    1. Prepare o tampão de reação composto de HEPES 50 mM (pH 7,5-7,8), NaCl 50 mM, KCl 150 mM e MgCl200 mM 2. Encha com a água deionizada até 50 mL.
    2. Preparar alíquotas de 10 μM de oligonucleótidos Dzb-Tile e Tile-Arm3. Preparar uma solução de 1 μM de Dza, um F-sub de 100 μM e analitos de 1 nM, 10 nM, 100 nM em RNase/água livre ou água desionizada estéril. Os detalhes das sequências de oligonucleotídeos são fornecidos na Tabela de Materiais.
  2. Montagem DNM
    1. Descongele completamente as soluções de oligonucleotídeos antes de usar. Misture delicadamente batendo (não faça vórtice intenso). Gire para baixo (rapidamente, por alguns segundos) a solução usando uma microcentrífuga.
    2. Misture 1 μM de Dzb-Tile e Tile-Arm3 em 200 μL do tampão de reação em tubos de microcentrífuga de 0,5 mL.
    3. Misture o tubo suavemente e gire a solução.
    4. Enrole a tampa do tubo fechado com filme de parafina. Como alternativa, use tubos com tampa de rosca.
    5. Incube o tubo em um béquer de 500 mL com água fervente por 2 min, depois desligue o aquecedor e deixe a temperatura esfriar passivamente durante a noite.
    6. Prepare o PAGE nativo de 12%: Misture 1 mL de tampão TBE 10х, 3 mL de 40% AA:BA, água deionizada até 10 mL, 50 μL de APS e 5 μL de TEMED (consulte a Tabela de Materiais). Mova a mistura para o de gel e deixe polimerizar.
    7. Misture 1 μL de cada amostra, ou seja, o DNM, Dzb-Tile e Tile-arm3 montados, com 1 μL de corante de carga 4x e carregue-os no gel.
    8. Coloque o na câmara, encha-o com 1x tampão TBE e deixe o gel funcionar por 90 min a 80 V.
    9. Tinga o gel com brometo de etídio e visualize-o usando um sistema de documentação de gel (consulte a Tabela de Materiais).
  3. Ensaio LOD
    1. Preparar 160 μL de 200 nM F-sub no tampão de reacção. Isso é feito para avaliar o histórico básico da estabilidade do substrato.
    2. Prepare 7 alíquotas de 160 μL de DNM, F-sub e Dza pré-montados em concentrações de 20 nM de DNM e Dza e 200 nM de F-sub no tampão de reação. Dos sete tubos, mantenha o tubo # 1 como o fundo em branco para avaliar a montagem espontânea do núcleo DNAzyme.
    3. Adicione o analito nos tubos #2-7 nas concentrações finais de 1 pM, 10 pM, 100 pM, 200 pM, 500 pM e 1000 pM.
    4. Misture suavemente, gire os tubos e classifique as soluções em três porções de 50 μL em uma placa preta de 96 poços. Sele a placa com uma película opticamente transparente.
    5. Incubar a placa em banho-maria a 55 °C durante 1 h. Gire o prato para baixo.
    6. Medir a fluorescência a 525 nm (λex = 495 nm). Calcule a média e o desvio padrão para cada ponto.
    7. Calcule a proporção em branco para o básico dividindo o sinal do tubo que contém F-sub e DNM pelo sinal do tubo que contém apenas F-sub. Certifique-se de que a proporção esteja dentro da faixa de 1,1-1,5.
    8. Calcule a relação sinal-branco dividindo o sinal do tubo que contém F-sub, DNM e o analito pelo sinal do tubo que contém apenas F-sub e DNM. Considere o sinal como verdadeiro positivo se for maior que a média de fundo mais três desvios padrão.
    9. Repita o experimento duas vezes e certifique-se de que o desvio padrão entre as repetições analíticas seja menor que 0,5.

Resultados

O objetivo do primeiro experimento foi mostrar a montagem do DNM antes do fragmento sintético do analito. Todas as fitas DNM constituintes foram adicionadas ao tampão de reação e montadas no béquer. O complexo DNM montado foi avaliado quanto ao seu tamanho correto e homogeneidade por PAGE nativo. A PÁGINA nativa mostra o DNM montado com o analito na pista 1 e duas fitas DNM nas pistas 2 e 4. Se a nanomáquina de DNA não fosse montada, 2 ou 3 bandas separadas seriam visíveis em ve...

Discussão

O projeto de máquinas de DNA é simples, mas requer alguma experiência no projeto de sondas de hibridização ou nanoestruturas funcionais de DNA. É apropriado manter o fragmento do analito o mais curto possível para diminuir o número de possíveis estruturas secundárias e simplificar a invasão do DNM à estrutura secundária. O conteúdo de CG deve ser preferencialmente inferior a 60% para evitar estruturas intramoleculares estáveis. A montagem bem-sucedida do DNM é alcançada ...

Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer a Ekaterina V. Nikitina por gentilmente fornecer o gDNA do EBV. Muhannad Ateiah, Maria Y. Berezovskaya e Maria S. Rubel agradecem ao Ministério da Educação e Ciência da Federação Russa (Grant No FSER-2022-0009) e ao programa Prioridade 2030.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL tubeBiofilCFT011015
100 bp+ DNA LadderEvrogenNL002
100-1000 µL pipetteKirgenKG-Pro1000
10-100 µL pipetteKirgenKG-Pro100
1-10 µL pipetteKirgenKG-Pro10
20-200 µL pipetteKirgenKG-Pro200
2-20 µL pipetteKirgenKG-Pro20
4x Gel Loading DyeEvrogenPB020
Acrylamide 4KAppliChemA1090,0500
Ammonium persulfateCarl Roth2809447
BiorenderBiorenderhttps://www.biorender.com
BisacrylamideMolekula22797959
Boric AcidTechSnabH-0202
ChemiDoc imaging systemBioRad12003153
Costar 96-Well Black Polystyrene PlateCorningCOS3915
DinaMeltRNA Institutehttp://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php
EDTAAmrescoAm-O105
Ethidium bromideBioLabMixEtBr-10
HEPESAmrescoAm-O485
Magnesium chlorideAppliChem131396
Mini Protean Tetra CellBioRad1658001EDU
pipette 10 µL tipsKirgenKG1111-L
pipette 1000 µL tipsKirgenKG1636
pipette 200 µL tipsKirgenKG1212-L
Pixelmator ProPixelmator Teamhttps://www.pixelmator.com/pro/
Potassium chlorideCarl Roth1782751
PowerPac Basic Power SupplyBioRad1645050
RNAse/DNAse free waterInvitrogen10977049
Sealing film for PCR platesSovtechP-502
Sodium chlorideVektonHCh (0,1)
Spark multimode microplate readerTecanSpark- 10M
T100 amplificatorBioRad10014822
TEMEDMolekula68604730
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneAmrescoAm-O497
UNAFoldRNA Institutehttp://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php
Water bathLOIPLB-140
Oligos used
Analyte:Evrogendirect order, standard desalting purification
GAGCACTTGGTCAGGCACACGG
ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG
TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG
GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG
CGGACTACGCCTTCGTTGC
Tile-Arm3:Evrogendirect order, standard desalting purification
CCG GGCTGCTGTGCCATTTT
TTGCTGACTACTGTCACCTCT
CTGCTAGTCT
Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG
TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC
CGCTGACCACAACGAGAGGAA
ACCTT		Evrogendirect order, standard desalting purification
Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT
GTCCGTGTGCCTGACCA		Evrogendirect order, standard desalting purification
F-sub oligonucleotide: AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU
CCCTGGGCA-BHQ1		DNA-Syntezdirect order, HPLC purification

Referências

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