DNAzyme 10-23 - 核酸認識用ナノマシン

要約

DNAzymeベースのナノマシンは、核酸の高選択性と高感度な検出に使用できます。この記事では、フリーソフトウェアを使用した10-23コアのDNAzymeベースのナノマシンの設計に関する詳細なプロトコルと、例としてEpstein-Barrウイルスフラグメントの検出におけるそれらのアプリケーションについて説明します。

要約

DNAおよびRNA配列(分析物)を検出するためのDNAzymeベースのナノマシン(DNM)は、オリゴヌクレオチドで作られた多機能構造です。その機能には、緊密な分析物の結合、選択性の高い分析種の認識、蛍光レポーター基質の複数の触媒切断による蛍光シグナル増幅、およびセンサー応答の増加のための蛍光基質引力が含まれます。機能ユニットは、共通のDNAスキャフォールドに取り付けられ、協調的な働きをします。RNA切断10-23 DNMは、非触媒ハイブリダイゼーションプローブと比較して感度が向上しています。DNMの安定性と基質認識の可能性の増加は、二本鎖DNAフラグメントであるタイルによってもたらされます。DNMは、フォールドRNAと二本鎖DNAで一塩基が異なる2つの分析種を区別し、他のタンパク質フリーハイブリダイゼーションプローブよりも~1000倍低い濃度で分析種を検出できます。この記事では、DNA-ナノマシン活性の診断可能性の背後にある概念と、核酸検出アッセイにおけるDNMの設計、組み立て、およびアプリケーションの概要を示します。

概要

核酸検出の最も初期の方法の1つは、分析されたRNAまたはDNA配列への選択的オリゴヌクレオチドの相補的結合です。この方法では、標的DNAまたはRNA分析物¹とWatson-Crick塩基対を形成できる核酸フラグメント(プローブ)を使用します。次に、複合体は、さまざまな手法によって分析物および非結合プローブと区別されます。ノーザンブロッティング、 in situ ハイブリダイゼーション、またはqPCRなどの特定の方法は、相補的結合²の現象に基づいています。最も一般的なハイブリダイゼーションプローブには、感度が低い(マイクロモルからナノモルレベルに達する)ことと、点変異を含む一塩基変異(SNV)に対する選択性が低いという2つの重大な欠点があります。この問題は、これらの欠点の解決策が互いに矛盾するため、洗練されたアプローチが必要です³。最高の選択性を得るためには、検出するオリゴヌクレオチドを、不適合な分析種と不安定なハイブリッドを形成するのに十分な短さに保つ必要があります。このような短いオリゴヌクレオチドは、標的核酸にしっかりと結合できず、その二次構造をほどくことができないため、検出可能なシグナルが得られないことがよくあります。生物学的RNAや二本鎖DNA(dsDNA)中のCGリッチフラグメントを検出することは....

プロトコル

1. DNM設計

1. 目的のゲノム内の一意の領域を選択します。
   注:この研究では、エプスタイン・バーウイルス(EBV)ゲノムの13972-14154(OR652423.1)の領域を使用しています。
2. 選択したフラグメントを増幅するためのプライマーセットを、例えばUgene²⁶に埋め込まれたPrimer3ツールで作成します。
3. UNAFold Web Tool²⁷ ( 資料の表を参照) を開き、選択した領域を挿入します。フォールディング温度を55°Cに変更し、イオン条件を一価イオンを250 mM、Mg²⁺を200 mMに変更します。
   1. 得られたssDNAフラグメントの二次構造を開き、安定したヘアピンを選択します。DNA-ナノマシンの結合部位を非構造化領域、またはヘアピン構造のループ上に位置付けて、ターゲットのより強力な結合を実現します。
4. 標的分析物部位がステムループ構造で折り畳まれている場合は、アーム1とアーム2を次のように配置します:アーム2がステムの片側、ループ、および2番目のステム側の3〜5 ntに結合していることを確認します。アーム1は、第2のス....

ディスカッション

DNAマシンの設計は簡単ですが、ハイブリダイゼーションプローブや機能的なDNAナノ構造の設計にはある程度の経験が必要です。分析種のフラグメントをできるだけ短く保つことで、二次構造の数を減らし、二次構造へのDNM浸潤を簡素化することが適切です。CG含有量は、安定した分子内構造を避けるために、できれば60%未満である必要があります。DNMの組み立ては、?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tube	Biofil	CFT011015
100 bp+ DNA Ladder	Evrogen	NL002
100-1000 µL pipette	Kirgen	KG-Pro1000
10-100 µL pipette	Kirgen	KG-Pro100
1-10 µL pipette	Kirgen	KG-Pro10
20-200 µL pipette	Kirgen	KG-Pro200
2-20 µL pipette	Kirgen	KG-Pro20
4x Gel Loading Dye	Evrogen	PB020
Acrylamide 4K	AppliChem	A1090,0500
Ammonium persulfate	Carl Roth	2809447
Biorender	Biorender		https://www.biorender.com
Bisacrylamide	Molekula	22797959
Boric Acid	TechSnab	H-0202
ChemiDoc imaging system	BioRad	12003153
Costar 96-Well Black Polystyrene Plate	Corning	COS3915
DinaMelt	RNA Institute		http://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php
EDTA	Amresco	Am-O105
Ethidium bromide	BioLabMix	EtBr-10
HEPES	Amresco	Am-O485
Magnesium chloride	AppliChem	131396
Mini Protean Tetra Cell	BioRad	1658001EDU
pipette 10 µL tips	Kirgen	KG1111-L
pipette 1000 µL tips	Kirgen	KG1636
pipette 200 µL tips	Kirgen	KG1212-L
Pixelmator Pro	Pixelmator Team		https://www.pixelmator.com/pro/
Potassium chloride	Carl Roth	1782751
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050
RNAse/DNAse free water	Invitrogen	10977049
Sealing film for PCR plates	Sovtech	P-502
Sodium chloride	Vekton	HCh (0,1)
Spark multimode microplate reader	Tecan	Spark- 10M
T100 amplificator	BioRad	10014822
TEMED	Molekula	68604730
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Amresco	Am-O497
UNAFold	RNA Institute		http://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php
Water bath	LOIP	LB-140
Oligos used
Analyte:	Evrogen		direct order, standard desalting purification
GAGCACTTGGTCAGGCACACGG ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG CGGACTACGCCTTCGTTGC
Tile-Arm3:	Evrogen		direct order, standard desalting purification
CCG GGCTGCTGTGCCATTTT TTGCTGACTACTGTCACCTCT CTGCTAGTCT
Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC CGCTGACCACAACGAGAGGAA ACCTT	Evrogen		direct order, standard desalting purification
Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT GTCCGTGTGCCTGACCA	Evrogen		direct order, standard desalting purification
F-sub oligonucleotide: AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU CCCTGGGCA-BHQ1	DNA-Syntez		direct order, HPLC purification