DNAzyme 10-23 - Nanomáquinas basadas en el reconocimiento de ácidos nucleicos

Resumen

Las nanomáquinas basadas en DNAzyme se pueden utilizar para la detección altamente selectiva y sensible de ácidos nucleicos. Este artículo describe un protocolo detallado para el diseño de nanomáquinas basadas en DNAzyme con un núcleo 10-23 utilizando software libre y su aplicación en la detección de un fragmento de virus de Epstein-Barr como ejemplo.

Resumen

Las nanomáquinas basadas en DNAzyme (DNM) para la detección de secuencias de ADN y ARN (analitos) son estructuras multifuncionales hechas de oligonucleótidos. Sus funciones incluyen la unión estrecha del analito, el reconocimiento altamente selectivo del analito, la amplificación de la señal fluorescente mediante múltiples escisiones catalíticas de un sustrato indicador fluorogénico y la atracción del sustrato fluorogénico para aumentar la respuesta del sensor. Las unidades funcionales están unidas a un andamiaje común de ADN para su acción cooperativa. Los DNM 10-23 de escisión de ARN presentan una sensibilidad mejorada en comparación con las sondas de hibridación no catalítica. La estabilidad del DNM y el aumento de las posibilidades de reconocimiento del sustrato son proporcionados por un fragmento de ADN de doble cadena, un mosaico. DNM puede diferenciar dos analitos con una sola diferencia de nucleótido en un ARN plegado y un ADN bicatenario y detectar analitos en concentraciones ~ 1000 veces más bajas que otras sondas de hibridación sin proteínas. Este artículo presenta el concepto detrás del potencial de diagnóstico de la actividad de las nanomáquinas de ADN y describe el diseño, el ensamblaje y la aplicación de DNM en ensayos de detección de ácidos nucleicos.

Introducción

Uno de los primeros métodos para la detección de ácidos nucleicos es la unión complementaria de oligonucleótidos selectivos a las secuencias de ARN o ADN analizadas. Este método emplea fragmentos de ácido nucleico (sondas) que pueden formar pares de bases de Watson-Crick con un analito de ADN o ARN¹ específico. A continuación, el complejo se diferencia del analito y de la sonda no unida mediante una variedad de técnicas. Ciertos métodos, como el Northern blot, la hibridación in situ o qPCR, se basan en el fenómeno de la unión complementaria². Las sondas de hibridación más comune....

Protocolo

1. Diseño DNM

1. Seleccione una región única dentro del genoma de interés.
   NOTA: Este trabajo utiliza una región del genoma del virus de Epstein-Barr (VEB) en las posiciones 13972-14154 (OR652423.1).
2. Cree un conjunto de cebadores para la amplificación del fragmento seleccionado, por ejemplo, a través de la herramienta Primer3 incrustada en Ugene²⁶.
3. Abra la herramienta web UNAFold²⁷ (ver Tabla de Materiales) e inserte la región seleccionada. Cambie la temperatura de plegamiento a 55 °C y las condiciones iónicas a 250....

Resultados

El objetivo del primer experimento fue mostrar el ensamblaje del DNM antes del fragmento sintético del analito. Todos los hilos de DNM constituyentes se añadieron al tampón de reacción y se ensamblaron en el vaso de precipitados. El complejo DNM ensamblado fue evaluado para determinar su tamaño y homogeneidad correctos por PAGE nativo. La página nativa muestra el DNM ensamblado con el analito en el carril 1 y dos hebras de DNM en los carriles 2 y 4. Si la nanomáquina de ADN no est.......

Discusión

El diseño de máquinas de ADN es sencillo, pero requiere cierta experiencia en el diseño de sondas de hibridación o nanoestructuras funcionales de ADN. Es conveniente mantener el fragmento de analito lo más corto posible para disminuir el número de posibles estructuras secundarias y simplificar la invasión de DNM a la estructura secundaria. El contenido de CG debe ser preferiblemente inferior al 60% para evitar estructuras intramoleculares estables. El ensamblaje exitoso del DNM se.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tube	Biofil	CFT011015
100 bp+ DNA Ladder	Evrogen	NL002
100-1000 µL pipette	Kirgen	KG-Pro1000
10-100 µL pipette	Kirgen	KG-Pro100
1-10 µL pipette	Kirgen	KG-Pro10
20-200 µL pipette	Kirgen	KG-Pro200
2-20 µL pipette	Kirgen	KG-Pro20
4x Gel Loading Dye	Evrogen	PB020
Acrylamide 4K	AppliChem	A1090,0500
Ammonium persulfate	Carl Roth	2809447
Biorender	Biorender		https://www.biorender.com
Bisacrylamide	Molekula	22797959
Boric Acid	TechSnab	H-0202
ChemiDoc imaging system	BioRad	12003153
Costar 96-Well Black Polystyrene Plate	Corning	COS3915
DinaMelt	RNA Institute		http://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php
EDTA	Amresco	Am-O105
Ethidium bromide	BioLabMix	EtBr-10
HEPES	Amresco	Am-O485
Magnesium chloride	AppliChem	131396
Mini Protean Tetra Cell	BioRad	1658001EDU
pipette 10 µL tips	Kirgen	KG1111-L
pipette 1000 µL tips	Kirgen	KG1636
pipette 200 µL tips	Kirgen	KG1212-L
Pixelmator Pro	Pixelmator Team		https://www.pixelmator.com/pro/
Potassium chloride	Carl Roth	1782751
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050
RNAse/DNAse free water	Invitrogen	10977049
Sealing film for PCR plates	Sovtech	P-502
Sodium chloride	Vekton	HCh (0,1)
Spark multimode microplate reader	Tecan	Spark- 10M
T100 amplificator	BioRad	10014822
TEMED	Molekula	68604730
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Amresco	Am-O497
UNAFold	RNA Institute		http://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php
Water bath	LOIP	LB-140
Oligos used
Analyte:	Evrogen		direct order, standard desalting purification
GAGCACTTGGTCAGGCACACGG ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG CGGACTACGCCTTCGTTGC
Tile-Arm3:	Evrogen		direct order, standard desalting purification
CCG GGCTGCTGTGCCATTTT TTGCTGACTACTGTCACCTCT CTGCTAGTCT
Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC CGCTGACCACAACGAGAGGAA ACCTT	Evrogen		direct order, standard desalting purification
Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT GTCCGTGTGCCTGACCA	Evrogen		direct order, standard desalting purification
F-sub oligonucleotide: AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU CCCTGGGCA-BHQ1	DNA-Syntez		direct order, HPLC purification