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Las nanomáquinas basadas en DNAzyme se pueden utilizar para la detección altamente selectiva y sensible de ácidos nucleicos. Este artículo describe un protocolo detallado para el diseño de nanomáquinas basadas en DNAzyme con un núcleo 10-23 utilizando software libre y su aplicación en la detección de un fragmento de virus de Epstein-Barr como ejemplo.
Las nanomáquinas basadas en DNAzyme (DNM) para la detección de secuencias de ADN y ARN (analitos) son estructuras multifuncionales hechas de oligonucleótidos. Sus funciones incluyen la unión estrecha del analito, el reconocimiento altamente selectivo del analito, la amplificación de la señal fluorescente mediante múltiples escisiones catalíticas de un sustrato indicador fluorogénico y la atracción del sustrato fluorogénico para aumentar la respuesta del sensor. Las unidades funcionales están unidas a un andamiaje común de ADN para su acción cooperativa. Los DNM 10-23 de escisión de ARN presentan una sensibilidad mejorada en comparación con las sondas de hibridación no catalítica. La estabilidad del DNM y el aumento de las posibilidades de reconocimiento del sustrato son proporcionados por un fragmento de ADN de doble cadena, un mosaico. DNM puede diferenciar dos analitos con una sola diferencia de nucleótido en un ARN plegado y un ADN bicatenario y detectar analitos en concentraciones ~ 1000 veces más bajas que otras sondas de hibridación sin proteínas. Este artículo presenta el concepto detrás del potencial de diagnóstico de la actividad de las nanomáquinas de ADN y describe el diseño, el ensamblaje y la aplicación de DNM en ensayos de detección de ácidos nucleicos.
Uno de los primeros métodos para la detección de ácidos nucleicos es la unión complementaria de oligonucleótidos selectivos a las secuencias de ARN o ADN analizadas. Este método emplea fragmentos de ácido nucleico (sondas) que pueden formar pares de bases de Watson-Crick con un analito de ADN o ARN1 específico. A continuación, el complejo se diferencia del analito y de la sonda no unida mediante una variedad de técnicas. Ciertos métodos, como el Northern blot, la hibridación in situ o qPCR, se basan en el fenómeno de la unión complementaria2. Las sondas de hibridación más comunes tienen dos inconvenientes significativos: baja sensibilidad (pueden alcanzar niveles de micromolar a nanomolar) y baja selectividad a variaciones de un solo nucleótido (SNV), incluidas las mutaciones puntuales. El problema requiere un enfoque sofisticado, ya que las soluciones a estos inconvenientes entran en conflicto entre sí3. Para proporcionar la mejor selectividad, el oligonucleótido de detección debe ser lo suficientemente corto como para formar híbridos inestables con analitos no coincidentes. Estos oligonucleótidos cortos no son capaces de unirse firmemente a los ácidos nucleicos específicos y desenrollar sus estructuras secundarias, por lo que a menudo no proporcionan una señal detectable. Es especialmente difícil detectar fragmentos ricos en CG en el ARN biológico o ADN bicatenario (dsDNA). Por otro lado, las sondas largas son insensibles a SNV3. Para romper el punto muerto, se ha desarrollado el concepto de una sonda binaria4.
Los sensores binarios dividen una sola sonda de detección en dos partes y especializan sus fragmentos, manteniendo uno de ellos largo para desenrollar las horquillas o invadir el dsDNA. El segundo fragmento de sonda binaria sigue siendo corto para ser sensible a una base no coincidente, lo que proporciona un medio para detectar SNV. La señal se producirá si las dos partes del sensor binario están unidas4. El complejo completo se puede visualizar a través de FRET5, sonda de baliza molecular 6,7 o G-quadruplex con actividad similar a la peroxidasa 8,9,10, o bien mediante escisión de ARN 11,12,13 DNAzyme. Los sensores binarios con un núcleo DNAzyme 10-23 han sido ampliamente descritos. Se han adaptado para detectar fragmentos de ácido nucleico monocatenario creados sintéticamente11, o productos de amplificación monocatenario 14,15. La detección sin amplificación también es posible, por ejemplo, en el caso del ARNr 16S extraído de un cultivo celular, ya que esta molécula es abundante en las células12,16. Los sensores binarios con un núcleo DNAzyme 10-23 también se pueden adaptar para la detección de ácidos no nucleicos, como para los iones de plomo17. Sin embargo, la baja sensibilidad sigue considerándose uno de los principales inconvenientes de los sensores binarios 10-23 DNAzyme, y se han desarrollado varios enfoques, como las cascadas18 o los métodos alternativos de mejora de la señal19, para abordar este problema. Desafortunadamente, las técnicas anteriores aumentan drásticamente el costo y la inestabilidad de los componentes del sensor, por lo que no se han puesto en práctica.
El experimento descrito en este trabajo utiliza 10-23 nanosensores de ADN basados en DNAzyme, denominados nanomáquinas de ADN (DNM)20,21. Estas estructuras incluyen sensores binarios y también (1) facilitadores de ADN que flanquean la sonda binaria, desenrollando las regiones estructuradas e invadiendo ADN bicatenario, y (2) una baldosa de ADN que mantiene todas las partes del DNM juntas en estrecha proximidad y aumenta las posibilidades de formación de señales (Figura 1). En conjunto, los DNMs basados en DNAzyme 10-23 disminuyen el límite de detección (LOD) hasta el rango picomolar21; pueden utilizarse para detectar 16rRNA en lisados celulares22 o informar de la presencia de ARN viral sin amplificación 23,24. Al mismo tiempo, los DNMs siguen siendo sensibles al SNV e incluso pueden ser utilizados para genotipar alelos en organismos heterocigotos25. El método DNM se puede utilizar como una técnica complementaria a cualquier tipo de amplificación para la visualización del producto o la identificación del producto en una mezcla compleja con alta selectividad. Los DNM, a diferencia de las sondas convencionales TaqMan y de baliza, no requieren el calentamiento de la muestra y, por lo tanto, se pueden utilizar en protocolos de detección de punto final, lo que hace que la detección general sea rentable.
Este artículo describe el desarrollo in silico de un DNM y demuestra los procedimientos para el ensamblaje y la caracterización funcional del DNM. El trabajo se realizó utilizando un fragmento sintético del virus de Epstein-Barr (VEB) correspondiente a las posiciones 13972-14154 del ADN viral (OR652423.1) (ver Tabla de materiales).
1. Diseño DNM
2. Prueba de funcionamiento de la DNM
El objetivo del primer experimento fue mostrar el ensamblaje del DNM antes del fragmento sintético del analito. Todos los hilos de DNM constituyentes se añadieron al tampón de reacción y se ensamblaron en el vaso de precipitados. El complejo DNM ensamblado fue evaluado para determinar su tamaño y homogeneidad correctos por PAGE nativo. La página nativa muestra el DNM ensamblado con el analito en el carril 1 y dos hebras de DNM en los carriles 2 y 4. Si la nanomáquina de ADN no est...
El diseño de máquinas de ADN es sencillo, pero requiere cierta experiencia en el diseño de sondas de hibridación o nanoestructuras funcionales de ADN. Es conveniente mantener el fragmento de analito lo más corto posible para disminuir el número de posibles estructuras secundarias y simplificar la invasión de DNM a la estructura secundaria. El contenido de CG debe ser preferiblemente inferior al 60% para evitar estructuras intramoleculares estables. El ensamblaje exitoso del DNM se...
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Los autores desean agradecer a Ekaterina V. Nikitina por proporcionar amablemente el ADNg del VEB. Muhannad Ateiah, Maria Y. Berezovskaya y Maria S. Rubel agradecen al Ministerio de Educación y Ciencia de la Federación de Rusia (Subvención n.º FSER-2022-0009) y al programa Prioridad 2030.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL tube | Biofil | CFT011015 | |
100 bp+ DNA Ladder | Evrogen | NL002 | |
100-1000 µL pipette | Kirgen | KG-Pro1000 | |
10-100 µL pipette | Kirgen | KG-Pro100 | |
1-10 µL pipette | Kirgen | KG-Pro10 | |
20-200 µL pipette | Kirgen | KG-Pro200 | |
2-20 µL pipette | Kirgen | KG-Pro20 | |
4x Gel Loading Dye | Evrogen | PB020 | |
Acrylamide 4K | AppliChem | A1090,0500 | |
Ammonium persulfate | Carl Roth | 2809447 | |
Biorender | Biorender | https://www.biorender.com | |
Bisacrylamide | Molekula | 22797959 | |
Boric Acid | TechSnab | H-0202 | |
ChemiDoc imaging system | BioRad | 12003153 | |
Costar 96-Well Black Polystyrene Plate | Corning | COS3915 | |
DinaMelt | RNA Institute | http://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php | |
EDTA | Amresco | Am-O105 | |
Ethidium bromide | BioLabMix | EtBr-10 | |
HEPES | Amresco | Am-O485 | |
Magnesium chloride | AppliChem | 131396 | |
Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658001EDU | |
pipette 10 µL tips | Kirgen | KG1111-L | |
pipette 1000 µL tips | Kirgen | KG1636 | |
pipette 200 µL tips | Kirgen | KG1212-L | |
Pixelmator Pro | Pixelmator Team | https://www.pixelmator.com/pro/ | |
Potassium chloride | Carl Roth | 1782751 | |
PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | |
RNAse/DNAse free water | Invitrogen | 10977049 | |
Sealing film for PCR plates | Sovtech | P-502 | |
Sodium chloride | Vekton | HCh (0,1) | |
Spark multimode microplate reader | Tecan | Spark- 10M | |
T100 amplificator | BioRad | 10014822 | |
TEMED | Molekula | 68604730 | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Amresco | Am-O497 | |
UNAFold | RNA Institute | http://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php | |
Water bath | LOIP | LB-140 | |
Oligos used | |||
Analyte: | Evrogen | direct order, standard desalting purification | |
GAGCACTTGGTCAGGCACACGG ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG CGGACTACGCCTTCGTTGC | |||
Tile-Arm3: | Evrogen | direct order, standard desalting purification | |
CCG GGCTGCTGTGCCATTTT TTGCTGACTACTGTCACCTCT CTGCTAGTCT | |||
Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC CGCTGACCACAACGAGAGGAA ACCTT | Evrogen | direct order, standard desalting purification | |
Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT GTCCGTGTGCCTGACCA | Evrogen | direct order, standard desalting purification | |
F-sub oligonucleotide: AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU CCCTGGGCA-BHQ1 | DNA-Syntez | direct order, HPLC purification |
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