DNAzyme 10-23 - basierte Nanomaschinen zur Nukleinsäureerkennung

Zusammenfassung

Die DNAzyme-basierten Nanomaschinen können für den hochselektiven und sensitiven Nachweis von Nukleinsäuren eingesetzt werden. Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für das Design von DNAzym-basierten Nanomaschinen mit einem 10-23-Kern unter Verwendung freier Software und deren Anwendung am Beispiel der Detektion eines Epstein-Barr-Virusfragments.

Zusammenfassung

DNAzym-basierte Nanomaschinen (DNM) zum Nachweis von DNA- und RNA-Sequenzen (Analyten) sind multifunktionale Strukturen aus Oligonukleotiden. Zu ihren Funktionen gehören eine enge Analytbindung, eine hochselektive Analyterkennung, die Verstärkung des Fluoreszenzsignals durch mehrere katalytische Spaltungen eines fluorogenen Reportersubstrats und die Anziehung fluorogener Substrate für eine Erhöhung der Sensorreaktion. Funktionelle Einheiten werden für ihre kooperative Wirkung an ein gemeinsames DNA-Gerüst gebunden. Die RNA-spaltenden 10-23 DNMs weisen eine verbesserte Sensitivität im Vergleich zu nicht-katalytischen Hybridisierungssonden auf. Die Stabilität des DNM und die erhöhten Chancen auf Substraterkennung werden durch ein doppelsträngiges DNA-Fragment, eine Kachel, gewährleistet. DNM kann zwei Analyten mit einem einzigen Nukleotidunterschied in einer gefalteten RNA und einer doppelsträngigen DNA unterscheiden und Analyten in Konzentrationen nachweisen, die ~1000-mal niedriger sind als bei anderen proteinfreien Hybridisierungssonden. Dieser Artikel stellt das Konzept hinter dem diagnostischen Potenzial der DNA-Nanomaschinen-Aktivität vor und gibt einen Überblick über das Design, die Assemblierung und die Anwendung von DNM in Nukleinsäure-Detektionsassays.

Einleitung

Eine der frühesten Methoden zum Nukleinsäurenachweis ist die komplementäre Bindung von selektiven Oligonukleotiden an die analysierten RNA- oder DNA-Sequenzen. Bei diesem Verfahren werden Nukleinsäurefragmente (Sonden) verwendet, die Watson-Crick-Basenpaare mit einem gezielten DNA- oder RNA-Analyten¹ bilden können. Der Komplex wird dann durch eine Vielzahl von Techniken vom Analyten und der ungebundenen Sonde unterschieden. Bestimmte Methoden, wie z.B. Northern Blotting, in situ Hybridisierung oder qPCR, basieren auf dem Phänomen der komplementären Bindung². Die gebräuchlichsten....

Protokoll

1. DNM-Ausführung

1. Wählen Sie eine einzigartige Region innerhalb des Genoms von Interesse aus.
   HINWEIS: In dieser Arbeit wird eine Region des Epstein-Barr-Virus (EBV)-Genoms an den Positionen 13972-14154 (OR652423.1) verwendet.
2. Erstellen Sie ein Primer-Set für die Amplifikation des ausgewählten Fragments, z. B. über das in Ugene²⁶ eingebettete Primer3-Tool.
3. Öffnen Sie das UNAFold Web Tool²⁷ (siehe Materialtabelle) und fügen Sie den ausgewählten Bereich ein. Ändern Sie die Falttemperatur auf 55 °C und die Ionenbedi....

Diskussion

Das Design von DNA-Maschinen ist einfach, erfordert aber etwas Erfahrung in der Entwicklung von Hybridisierungssonden oder funktionellen DNA-Nanostrukturen. Es ist angebracht, das Analytfragment so kurz wie möglich zu halten, um die Anzahl möglicher Sekundärstrukturen zu verringern und die DNM-Invasion in die Sekundärstruktur zu vereinfachen. Der CG-Gehalt sollte vorzugsweise unter 60 % liegen, um stabile intramolekulare Strukturen zu vermeiden. Die erfolgreiche Montage des DNM wird .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tube	Biofil	CFT011015
100 bp+ DNA Ladder	Evrogen	NL002
100-1000 µL pipette	Kirgen	KG-Pro1000
10-100 µL pipette	Kirgen	KG-Pro100
1-10 µL pipette	Kirgen	KG-Pro10
20-200 µL pipette	Kirgen	KG-Pro200
2-20 µL pipette	Kirgen	KG-Pro20
4x Gel Loading Dye	Evrogen	PB020
Acrylamide 4K	AppliChem	A1090,0500
Ammonium persulfate	Carl Roth	2809447
Biorender	Biorender		https://www.biorender.com
Bisacrylamide	Molekula	22797959
Boric Acid	TechSnab	H-0202
ChemiDoc imaging system	BioRad	12003153
Costar 96-Well Black Polystyrene Plate	Corning	COS3915
DinaMelt	RNA Institute		http://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php
EDTA	Amresco	Am-O105
Ethidium bromide	BioLabMix	EtBr-10
HEPES	Amresco	Am-O485
Magnesium chloride	AppliChem	131396
Mini Protean Tetra Cell	BioRad	1658001EDU
pipette 10 µL tips	Kirgen	KG1111-L
pipette 1000 µL tips	Kirgen	KG1636
pipette 200 µL tips	Kirgen	KG1212-L
Pixelmator Pro	Pixelmator Team		https://www.pixelmator.com/pro/
Potassium chloride	Carl Roth	1782751
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050
RNAse/DNAse free water	Invitrogen	10977049
Sealing film for PCR plates	Sovtech	P-502
Sodium chloride	Vekton	HCh (0,1)
Spark multimode microplate reader	Tecan	Spark- 10M
T100 amplificator	BioRad	10014822
TEMED	Molekula	68604730
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Amresco	Am-O497
UNAFold	RNA Institute		http://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php
Water bath	LOIP	LB-140
Oligos used
Analyte:	Evrogen		direct order, standard desalting purification
GAGCACTTGGTCAGGCACACGG ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG CGGACTACGCCTTCGTTGC
Tile-Arm3:	Evrogen		direct order, standard desalting purification
CCG GGCTGCTGTGCCATTTT TTGCTGACTACTGTCACCTCT CTGCTAGTCT
Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC CGCTGACCACAACGAGAGGAA ACCTT	Evrogen		direct order, standard desalting purification
Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT GTCCGTGTGCCTGACCA	Evrogen		direct order, standard desalting purification
F-sub oligonucleotide: AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU CCCTGGGCA-BHQ1	DNA-Syntez		direct order, HPLC purification