DNAzyme 10-23 - basierte Nanomaschinen zur Nukleinsäureerkennung

Zusammenfassung

Die DNAzyme-basierten Nanomaschinen können für den hochselektiven und sensitiven Nachweis von Nukleinsäuren eingesetzt werden. Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für das Design von DNAzym-basierten Nanomaschinen mit einem 10-23-Kern unter Verwendung freier Software und deren Anwendung am Beispiel der Detektion eines Epstein-Barr-Virusfragments.

Zusammenfassung

DNAzym-basierte Nanomaschinen (DNM) zum Nachweis von DNA- und RNA-Sequenzen (Analyten) sind multifunktionale Strukturen aus Oligonukleotiden. Zu ihren Funktionen gehören eine enge Analytbindung, eine hochselektive Analyterkennung, die Verstärkung des Fluoreszenzsignals durch mehrere katalytische Spaltungen eines fluorogenen Reportersubstrats und die Anziehung fluorogener Substrate für eine Erhöhung der Sensorreaktion. Funktionelle Einheiten werden für ihre kooperative Wirkung an ein gemeinsames DNA-Gerüst gebunden. Die RNA-spaltenden 10-23 DNMs weisen eine verbesserte Sensitivität im Vergleich zu nicht-katalytischen Hybridisierungssonden auf. Die Stabilität des DNM und die erhöhten Chancen auf Substraterkennung werden durch ein doppelsträngiges DNA-Fragment, eine Kachel, gewährleistet. DNM kann zwei Analyten mit einem einzigen Nukleotidunterschied in einer gefalteten RNA und einer doppelsträngigen DNA unterscheiden und Analyten in Konzentrationen nachweisen, die ~1000-mal niedriger sind als bei anderen proteinfreien Hybridisierungssonden. Dieser Artikel stellt das Konzept hinter dem diagnostischen Potenzial der DNA-Nanomaschinen-Aktivität vor und gibt einen Überblick über das Design, die Assemblierung und die Anwendung von DNM in Nukleinsäure-Detektionsassays.

Einleitung

Eine der frühesten Methoden zum Nukleinsäurenachweis ist die komplementäre Bindung von selektiven Oligonukleotiden an die analysierten RNA- oder DNA-Sequenzen. Bei diesem Verfahren werden Nukleinsäurefragmente (Sonden) verwendet, die Watson-Crick-Basenpaare mit einem gezielten DNA- oder RNA-Analyten¹ bilden können. Der Komplex wird dann durch eine Vielzahl von Techniken vom Analyten und der ungebundenen Sonde unterschieden. Bestimmte Methoden, wie z.B. Northern Blotting, in situ Hybridisierung oder qPCR, basieren auf dem Phänomen der komplementären Bindung². Die gebräuchlichsten Hybridisierungssonden haben zwei wesentliche Nachteile: eine geringe Empfindlichkeit (sie können mikromolare bis nanomolare Werte erreichen) sowie eine geringe Selektivität gegenüber Einzelnukleotidvariationen (SNV), einschließlich Punktmutationen. Das Problem erfordert einen ausgeklügelten Ansatz, da die Lösungen für diese Nachteile miteinander in Konflikt stehen³. Um die beste Selektivität zu erzielen, sollte das detektierende Oligonukleotid kurz genug gehalten werden, um instabile Hybride mit nicht übereinstimmenden Analyten zu bilden. Solche kurzen Oligonukleotide sind nicht in der Lage, die anvisierten Nukleinsäuren fest zu binden und ihre Sekundärstrukturen abzuwickeln, so dass sie oft kein nachweisbares Signal liefern. Besonders schwierig ist der Nachweis von CG-reichen Fragmenten in biologischer RNA oder doppelsträngiger DNA (dsDNA). Auf der anderen Seite sind lange Sonden unempfindlich gegenüber SNV³. Um den Stillstand zu überwinden, wurde das Konzept einer binären Sonde entwickelt⁴.

Binärsensoren teilen eine einzelne Nachweissonde in zwei Teile und spezialisieren ihre Fragmente, wobei eines von ihnen lange hält, um die Haarnadeln abzuwickeln oder in die dsDNA einzudringen. Das zweite binäre Sondenfragment bleibt kurz, um empfindlich auf eine nicht übereinstimmende Base reagieren zu können, was ein Mittel zum Nachweis von SNV bietet. Das Signal wird erzeugt, wenn die beiden binären Sensorteile^{miteinander verbunden werden 4}. Der gesamte Komplex kann über FRET⁵, die molekulare Beacon-Sonde ^6,7 oder G-Quadruplexe mit Peroxidase-ähnlicher Aktivität ^8,9,10 oder das RNA-spaltende 11,12,13 DNAzym sichtbar gemacht werden. Binäre Sensoren mit einem 10-23 DNAzyme-Kern wurden ausführlich beschrieben. Sie wurden angepasst, um einzelsträngige Nukleinsäurefragmente, die synthetisch hergestellt wurden¹¹, oder einzelsträngige Amplifikationsprodukte^{14, 15} zu detektieren. Ein Nachweis ohne Amplifikation ist beispielsweise auch möglich, wenn es sich um 16S rRNA handelt, die aus einer Zellkultur extrahiert wird, da dieses Molekül in den Zellen^12,16 reichlich vorhanden ist. Binäre Sensoren mit einem DNAzyme-Kern von 10 bis 23 können auch für die Detektion von Nicht-Nukleinsäuren angepasst werden, z. B. für^{Blei-Ionen 17}. Nichtsdestotrotz wird die geringe Empfindlichkeit nach wie vor als einer der Hauptnachteile von binären DNAzyme-Sensoren mit 10 bis 23 angesehen, und es wurden verschiedene Ansätze, einschließlich Kaskaden¹⁸ oder alternative signalverstärkende Methoden¹⁹, entwickelt, um dieses Problem zu lösen. Leider erhöhen die oben genannten Techniken die Kosten und die Instabilität der Sensorkomponenten drastisch und sind daher in der Praxis nicht angekommen.

Das in dieser Arbeit beschriebene Experiment verwendet 10-23 DNAzym-basierte DNA-Nanosensoren, die als DNA-Nanomaschinen (DNM) bezeichnet ^werden20,21. Zu diesen Strukturen gehören binäre Sensoren und auch (1) DNA-Facilitatoren, die die binäre Sonde flankieren, die strukturierten Regionen abwickeln und in doppelsträngige DNAs eindringen, und (2) eine DNA-Kachel, die alle DNM-Teile in unmittelbarer Nähe zusammenhält und die Chancen auf Signalbildung erhöht (Abbildung 1). Insgesamt senken die DNAzym-basierten DNMs von 10 bis 23 die Nachweisgrenze (LOD) bis in den pikomolären Bereich²¹; Sie können zum Nachweis von 16rRNA in Zelllysaten verwendet werden²² oder zum Nachweis des Vorhandenseins viraler RNA ohne Amplifikation^23,24. Gleichzeitig bleiben die DNMs sensitiv gegenüber der SNV und können sogar zur Genotypisierung von Allelen in heterozygoten Organismen verwendet werden²⁵. Die DNM-Methode kann als ergänzende Technik zu jedem Amplifikationstyp zur Produktvisualisierung oder Identifizierung des Produkts in einem komplexen Gemisch mit hoher Selektivität verwendet werden. Die DNMs erfordern im Gegensatz zu herkömmlichen TaqMan- und Beacon-Sonden keine Erwärmung der Probe und können daher in Endpunkt-Detektionsprotokollen verwendet werden, was die Gesamtdetektion kostengünstig macht.

Dieser Artikel beschreibt die in silico Entwicklung eines DNM und zeigt Verfahren zur Assemblierung und funktionellen Charakterisierung von DNM auf. Die Arbeit wurde an einem synthetischen Fragment des Epstein-Barr-Virus (EBV) durchgeführt, das den Positionen 13972-14154 der viralen DNA (OR652423.1) entspricht (siehe Materialtabelle).

Protokoll

1. DNM-Ausführung

1. Wählen Sie eine einzigartige Region innerhalb des Genoms von Interesse aus.
   HINWEIS: In dieser Arbeit wird eine Region des Epstein-Barr-Virus (EBV)-Genoms an den Positionen 13972-14154 (OR652423.1) verwendet.
2. Erstellen Sie ein Primer-Set für die Amplifikation des ausgewählten Fragments, z. B. über das in Ugene²⁶ eingebettete Primer3-Tool.
3. Öffnen Sie das UNAFold Web Tool²⁷ (siehe Materialtabelle) und fügen Sie den ausgewählten Bereich ein. Ändern Sie die Falttemperatur auf 55 °C und die Ionenbedingungen auf 250 mM monovalenter Ionen und 200 mM Mg²⁺.
   1. Öffnen Sie die resultierende Sekundärstruktur des ssDNA-Fragments und wählen Sie eine stabile Haarnadel aus. Lokalisieren Sie die Bindungsstelle der DNA-Nanomaschinen in den unstrukturierten Regionen oder alternativ in den Schleifen der Haarnadelstrukturen, um eine stärkere Bindung des Ziels zu erreichen.
4. Wenn die Zielanalytstelle in einer Stiel-Schlingen-Struktur gefaltet ist, platzieren Sie Arm 1 und 2 wie folgt: Stellen Sie sicher, dass Arm 2 eine Seite des Stiels, die Schlaufe und 3-5 nt der zweiten Stielseite bindet; Arm 1 bindet ein Fragment der zweiten Stielseite.
5. Öffnen Sie das DinaMelt-Werkzeug²⁸ (siehe Materialtabelle) und analysieren Sie die Sequenzen der Arme und ihre Reverse-Komplement-Sequenzen. Stellen Sie mit dem DinaMelt-Werkzeug sicher, dass der T_m der Arme 2 und 3 über 65 °C liegt: mindestens 10 °C über der Assay-Temperatur (55 °C).
   1. Der T_m von Arm 1 ist mindestens 1-3 °C über der Reaktionstemperatur (55 °C) zu halten, wenn eine hohe Erkennungsselektivität erreicht werden soll²⁹.
6. Kombinieren Sie die Sequenzen der Arme 1 und 2 mit den Hälften des DNAzyme-Kerns und den F-Sub-Bindungsfragmenten¹³.
7. Analysieren Sie die Sekundärstruktur der designten DNA-Stränge mit UNAFold²⁷.
   HINWEIS: 55 °C (Assay-Temperatur), 200 mM Mg²⁺, 250 mM monovalente Ionen (HEPES, Na⁺, K⁺).
   1. Verwenden Sie das Design nur, wenn der Faltwert ΔG kleiner als - 4 kcal/mol ist. Versuchen Sie, lange CG-reiche Sequenzen zu vermeiden. Wenn die Sekundärstruktur zu stabil ist, wird eine Mutation in den Arm eingeführt, um die Faltung ΔG³⁰ zu erhöhen. Alternativ ist das Platzieren von Arm 3 2-3 nt von Arm 2 entfernt eine weitere Strategie, um die Sequenz von Arm 3 zu verändern, um stabile intermolekulare Strukturen zu vermeiden.
8. Erstellen Sie eine zufällige Sequenz für das DNA-Kachelfragment, das so lang ist wie Arm 3. Kombinieren Sie die Sequenz von Arm 3 mit der DNA-Kachelsequenz über (dT)_4-6 oder Ethylenglykol (z. B. Triethylenglykol (TEG) oder Hexaethylenglykol (HEG)). Die im Experiment vorgestellte DNM-Version verwendet (dT)₆.
9. Verknüpfen Sie Arm 2 mit der Sequenz, die komplementär zu dem in Schritt 1.8 ausgewählten DNA-Kachelfragment ist, über einen Linker.
10. Analysieren Sie die Sekundärstruktur der entworfenen DNA-Stränge mit der UNAFold-Web-App. Stellen Sie sicher, dass die Faltungsenergie jedes DNA-Strangs bei 55 °C über 4 kJ/mol liegt, und vermeiden Sie lange, mit CG angereicherte Sequenzen. Ändern Sie vorzugsweise die Sequenz der DNA-Kachel.
11. Zeichnen Sie die Struktur mit einer verfügbaren Vektorgrafiksoftware. In diesem Artikel werden Biorender und Pixelmator Pro zur Visualisierung verwendet (siehe Materialtabelle). Überprüfen Sie die Genauigkeit in 5'->3'-Richtungen für jeden Strang.
    HINWEIS: Beziehen Sie die Sequenzen von einem zuverlässigen kommerziellen Anbieter.

2. Funktionstest des DNM

1. Vorbereitung von Puffer und Reagenzien
   1. Bereiten Sie den Reaktionspuffer vor, der aus 50 mM HEPES (pH 7,5-7,8), 50 mM NaCl, 150 mM KCl und 200 mM MgCl₂ besteht. Füllen Sie mit dem entionisierten Wasser bis zu 50 mL.
   2. Bereiten Sie 10 μM Aliquots von Dzb-Tile- und Tile-Arm3-Oligonukleotiden vor. Bereiten Sie 1 μM Lösung des Dza, einen 100 μM F-Sub und 1 nM, 10 nM, 100 nM Analyten in RNase/freiem Wasser oder sterilem deionisiertem Wasser vor. Die Einzelheiten zu den Oligonukleotidsequenzen sind in der Materialtabelle enthalten.
2. DNM-Montage
   1. Tauen Sie die Oligonukleotidlösungen vor der Verwendung vollständig auf. Vorsichtig durch Klopfen mischen (nicht intensiv vortexen). Schleudern Sie die Lösung mit einer Mikrozentrifuge (schnell, einige Sekunden lang) herunter.
   2. Mischen Sie je 1 μM Dzb-Tile und Tile-Arm3 in 200 μL des Reaktionspuffers in 0,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen.
   3. Mischen Sie das Röhrchen vorsichtig und schleudern Sie die Lösung herunter.
   4. Wickeln Sie den Deckel der geschlossenen Tube mit Paraffinfolie ein. Alternativ können Sie auch Schraubverschlussröhrchen verwenden.
   5. Inkubieren Sie das Röhrchen 2 Minuten lang in einem 500-ml-Becherglas mit kochendem Wasser, schalten Sie dann die Heizung aus und lassen Sie die Temperatur über Nacht passiv abkühlen.
   6. Bereiten Sie die native 12%ige PAGE vor: Mischen Sie 1 ml 10х TBE-Puffer, 3 ml 40% AA:BA, deionisiertes Wasser bis zu 10 ml, 50 μl APS und 5 μl TEMED (siehe Materialtabelle). Bewegen Sie die Mischung in die Gelkassette und lassen Sie sie polymerisieren.
   7. Mischen Sie 1 μL jeder Probe, nämlich den zusammengesetzten DNM, Dzb-Tile und Tile-arm3, mit 1 μL 4x Ladefarbstoff und laden Sie sie in das Gel.
   8. Setzen Sie die Kassette in die Kammer ein, füllen Sie sie mit 1x FSME-Puffer und lassen Sie das Gel 90 min bei 80 V laufen.
   9. Färben Sie das Gel mit Ethidiumbromid und visualisieren Sie es mit einem Gel-Dokumentationssystem (siehe Materialtabelle).
3. LOD-Assay
   1. Bereiten Sie 160 μl 200 nM F-Sub im Reaktionspuffer vor. Dies geschieht, um den grundlegenden Hintergrund der Substratstabilität zu beurteilen.
   2. Bereiten Sie 7 Aliquots mit 160 μl vorkonfektioniertem DNM, F-Sub und Dza in Konzentrationen von 20 nM DNM und Dza und 200 nM F-Sub im Reaktionspuffer vor. Behalten Sie von den sieben Röhren die Röhre #1 als leeren Hintergrund, um die spontane Assemblierung des DNAzyme-Kerns zu beurteilen.
   3. Geben Sie den Analyten in die Röhrchen #2-7 in den Endkonzentrationen von 1 pM, 10 pM, 100 pM, 200 pM, 500 pM und 1000 pM.
   4. Mischen Sie vorsichtig, schleudern Sie die Röhrchen herunter und klassifizieren Sie die Lösungen in drei 50-μl-Portionen in einer schwarzen 96-Well-Platte. Versiegeln Sie die Platte mit einer optisch transparenten Folie.
   5. Die Platte im Wasserbad bei 55 °C 1 h inkubieren. Schleudern Sie den Teller nach unten.
   6. Messung der Fluoreszenz bei 525 nm (λ_ex = 495 nm). Berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung für jeden Punkt.
   7. Berechnen Sie das Verhältnis von Rohton zu Basis, indem Sie das Signal der Röhre, die F-Sub und DNM enthält, durch das Signal der Röhre dividieren, die nur F-Sub enthält. Stellen Sie sicher, dass das Verhältnis im Bereich von 1,1 bis 1,5 liegt.
   8. Berechnen Sie das Signal-zu-Blind-Verhältnis, indem Sie das Signal der Röhre, die F-Sub, DNM und den Analyten enthält, durch das Signal der Röhre dividieren, die nur F-Sub und DNM enthält. Betrachten Sie das Signal als richtig positiv, wenn es höher ist als der Hintergrunddurchschnitt plus drei Standardabweichungen.
   9. Wiederholen Sie den Versuch zweimal, und stellen Sie sicher, dass die Standardabweichung zwischen den analytischen Wiederholungen weniger als 0,5 beträgt.

Ergebnisse

Ziel des ersten Experiments war es, den Aufbau des DNM vor dem synthetischen Fragment des Analyten zu zeigen. Alle DNM-Stränge, aus denen sie bestehen, wurden dem Reaktionspuffer zugesetzt und im Becherglas assembliert. Der assemblierte DNM-Komplex wurde durch natives PAGE auf seine korrekte Größe und Homogenität bewertet. Native PAGE zeigt den assemblierten DNM mit dem Analyten in Spur 1 und zwei DNM-Strängen in den Spuren 2 und 4. Wenn die DNA-Nanomaschine nicht assembliert würde...

Diskussion

Das Design von DNA-Maschinen ist einfach, erfordert aber etwas Erfahrung in der Entwicklung von Hybridisierungssonden oder funktionellen DNA-Nanostrukturen. Es ist angebracht, das Analytfragment so kurz wie möglich zu halten, um die Anzahl möglicher Sekundärstrukturen zu verringern und die DNM-Invasion in die Sekundärstruktur zu vereinfachen. Der CG-Gehalt sollte vorzugsweise unter 60 % liegen, um stabile intramolekulare Strukturen zu vermeiden. Die erfolgreiche Montage des DNM wird ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tube	Biofil	CFT011015
100 bp+ DNA Ladder	Evrogen	NL002
100-1000 µL pipette	Kirgen	KG-Pro1000
10-100 µL pipette	Kirgen	KG-Pro100
1-10 µL pipette	Kirgen	KG-Pro10
20-200 µL pipette	Kirgen	KG-Pro200
2-20 µL pipette	Kirgen	KG-Pro20
4x Gel Loading Dye	Evrogen	PB020
Acrylamide 4K	AppliChem	A1090,0500
Ammonium persulfate	Carl Roth	2809447
Biorender	Biorender		https://www.biorender.com
Bisacrylamide	Molekula	22797959
Boric Acid	TechSnab	H-0202
ChemiDoc imaging system	BioRad	12003153
Costar 96-Well Black Polystyrene Plate	Corning	COS3915
DinaMelt	RNA Institute		http://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php
EDTA	Amresco	Am-O105
Ethidium bromide	BioLabMix	EtBr-10
HEPES	Amresco	Am-O485
Magnesium chloride	AppliChem	131396
Mini Protean Tetra Cell	BioRad	1658001EDU
pipette 10 µL tips	Kirgen	KG1111-L
pipette 1000 µL tips	Kirgen	KG1636
pipette 200 µL tips	Kirgen	KG1212-L
Pixelmator Pro	Pixelmator Team		https://www.pixelmator.com/pro/
Potassium chloride	Carl Roth	1782751
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050
RNAse/DNAse free water	Invitrogen	10977049
Sealing film for PCR plates	Sovtech	P-502
Sodium chloride	Vekton	HCh (0,1)
Spark multimode microplate reader	Tecan	Spark- 10M
T100 amplificator	BioRad	10014822
TEMED	Molekula	68604730
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Amresco	Am-O497
UNAFold	RNA Institute		http://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php
Water bath	LOIP	LB-140
Oligos used
Analyte:	Evrogen		direct order, standard desalting purification
GAGCACTTGGTCAGGCACACGG ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG CGGACTACGCCTTCGTTGC
Tile-Arm3:	Evrogen		direct order, standard desalting purification
CCG GGCTGCTGTGCCATTTT TTGCTGACTACTGTCACCTCT CTGCTAGTCT
Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC CGCTGACCACAACGAGAGGAA ACCTT	Evrogen		direct order, standard desalting purification
Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT GTCCGTGTGCCTGACCA	Evrogen		direct order, standard desalting purification
F-sub oligonucleotide: AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU CCCTGGGCA-BHQ1	DNA-Syntez		direct order, HPLC purification