Nanomachines à base de DNAzyme 10-23 pour la reconnaissance des acides nucléiques

Résumé

Les nanomachines basées sur DNAzyme peuvent être utilisées pour la détection hautement sélective et sensible des acides nucléiques. Cet article décrit un protocole détaillé pour la conception de nanomachines basées sur DNAzyme avec un cœur de 10 à 23 à l’aide de logiciels libres et leur application dans la détection d’un fragment de virus d’Epstein-Barr à titre d’exemple.

Résumé

Les nanomachines à base d’ADN (DNM) pour la détection de séquences d’ADN et d’ARN (analytes) sont des structures multifonctionnelles constituées d’oligonucléotides. Leurs fonctions comprennent la liaison serrée de l’analyte, la reconnaissance hautement sélective de l’analyte, l’amplification du signal fluorescent par plusieurs clivages catalytiques d’un substrat rapporteur fluorogène et l’attraction du substrat fluorogène pour une augmentation de la réponse du capteur. Les unités fonctionnelles sont attachées à un échafaudage d’ADN commun pour leur action coopérative. Les DNM 10-23 à clivage de l’ARN présentent une sensibilité améliorée par rapport aux sondes d’hybridation non catalytiques. La stabilité du DNM et les chances accrues de reconnaissance du substrat sont fournies par un fragment d’ADN double brin, une tuile. Le DNM peut différencier deux analytes avec une seule différence nucléotidique dans un ARN replié et un ADN double brin et détecter des analytes à des concentrations ~1000 fois inférieures à celles des autres sondes d’hybridation sans protéines. Cet article présente le concept derrière le potentiel diagnostique de l’activité des nanomachines d’ADN et donne un aperçu de la conception, de l’assemblage et de l’application de DNM dans les tests de détection d’acides nucléiques.

Introduction

L’une des premières méthodes de détection des acides nucléiques est la liaison complémentaire d’oligonucléotides sélectifs aux séquences d’ARN ou d’ADN analysées. Cette méthode utilise des fragments d’acide nucléique (sondes) qui peuvent former des paires de bases Watson-Crick avec un^analyte d’ADN ou d’ARN 1 ciblé. Le complexe est ensuite différencié de l’analyte et de la sonde non liée par diverses techniques. Certaines méthodes, comme le Northern blot, l’hybridation in situ , ou qPCR, sont basées sur le phénomène de liaison complémentaire². Les sondes d’hybridation les plus courantes présentent deux inconvénients importants : une faible sensibilité (elles peuvent atteindre des niveaux micromolaires à nanomolaires) ainsi qu’une faible sélectivité aux variations nucléotidiques uniques (SNV), y compris les mutations ponctuelles. La question nécessite une approche sophistiquée puisque les solutions à ces inconvénients entrent en conflit les unes avec les autres³. Pour offrir la meilleure sélectivité, l’oligonucléotide de détection doit être suffisamment court pour former des hybrides instables avec des analytes non appariés. De tels oligonucléotides courts ne sont pas capables de lier étroitement les acides nucléiques ciblés et de dérouler leurs structures secondaires, échouant ainsi souvent à fournir un signal détectable. Il est particulièrement difficile de détecter des fragments riches en CG dans l’ARN biologique, ou ADN double brin (ADNdb). En revanche, les sondes longues sont insensibles à SNV³. Pour sortir de l’impasse, le concept d’une sonde binaire a été développé⁴.

Des capteurs binaires divisent une seule sonde de détection en deux morceaux et spécialisent ses fragments, en gardant l’un d’entre eux long pour dérouler les épingles à cheveux ou envahir l’ADNdb. Le deuxième fragment de sonde binaire reste court pour être sensible à une base non appariée, fournissant ainsi un moyen de détecter SNV. Le signal sera produit si les deux parties du capteur binaire sont jointes^4. Le complexe complet peut être visualisé via FRET⁵, la sonde de balise moléculaire ^6,7, ou les G-quadruplexes avec une activité semblable à celle de la peroxydase ^8,9,10, ou bien 11,12,13 DNAzyme de clivage de l’ARN. Les capteurs binaires avec un noyau DNAzyme de 10 à 23 ont été amplement décrits. Ils ont été adaptés pour détecter des fragments d’acide nucléique simple brin créés synthétiquement¹¹, ou des produits d’amplification simple brin ^14,15. Une détection sans amplification est également possible, par exemple, dans le cas de l’ARNr 16S extrait d’une culture cellulaire, puisque cette molécule est abondante dans les cellules^12,16. Les capteurs binaires avec un noyau DNAzyme 10-23 peuvent également être adaptés pour la détection d’acides non nucléiques, comme pour les ions plomb¹⁷. Néanmoins, la faible sensibilité est toujours considérée comme l’un des principaux inconvénients des capteurs binaires 10-23 DNAzyme, et diverses approches, y compris les cascades¹⁸ ou des méthodes alternatives d’amélioration du signal¹⁹, ont été développées pour résoudre ce problème. Malheureusement, les techniques ci-dessus augmentent considérablement le coût et l’instabilité des composants du capteur, et ne sont donc pas encore entrées en pratique.

L’expérience décrite dans ce travail utilise 10-23 nanocapteurs d’ADN basés sur DNAzyme, appelés nanomachines d’ADN (DNM)^20,21. Ces structures comprennent des capteurs binaires et aussi (1) des facilitateurs d’ADN flanquant la sonde binaire, déroulant les régions structurées et envahissant l’ADN double brin, et (2) une tuile d’ADN qui maintient toutes les parties DNM ensemble à proximité et augmente les chances de formation de signaux (Figure 1). Dans l’ensemble, les 10-23 DNM basés sur DNAzyme abaissent la limite de détection (LOD) jusqu’à la plage picomolaire²¹ ; ils peuvent être utilisés pour détecter l’ARN16r dans les lysats cellulaires²² ou signaler la présence d’ARN viral sans amplification ^23,24. Dans le même temps, les DNM restent sensibles au SNV et peuvent même être utilisés pour génotyper les allèles chez les organismes hétérozygotes²⁵. La méthode DNM peut être utilisée comme technique complémentaire à tout type d’amplification pour la visualisation de produits ou l’identification du produit dans un mélange complexe à haute sélectivité. Les DNM, contrairement aux sondes TaqMan et aux sondes de balise conventionnelles, ne nécessitent pas de chauffage de l’échantillon et peuvent donc être utilisées dans les protocoles de détection de points finaux, ce qui rend la détection globale rentable.

Cet article décrit le développement in silico d’un DNM et démontre les procédures d’assemblage et de caractérisation fonctionnelle du DNM. Le travail a été réalisé à l’aide d’un fragment synthétique du virus d’Epstein-Barr (VEB) correspondant aux positions 13972-14154 de l’ADN viral (OR652423.1) (voir Tableau des matériaux).

Protocole

1. Conception DNM

1. Sélectionnez une région unique dans le génome d’intérêt.
   REMARQUE : Ce travail utilise une région du génome du virus d’Epstein-Barr (VEB) aux positions 13972-14154 (OR652423.1).
2. Créez un jeu d’amorces pour l’amplification du fragment sélectionné, par exemple, via l’outil Primer3 intégré à Ugene²⁶.
3. Ouvrez l’outil Web UNAFold²⁷ (voir la table des matériaux) et insérez la région sélectionnée. Modifiez la température de repliement à 55 °C et les conditions ioniques à 250 mM d’ions monovalents et 200 mM de Mg²⁺.
   1. Ouvrez la structure secondaire résultante du fragment d’ADNsb et sélectionnez une épingle à cheveux stable. Localiser le site de liaison des nanomachines d’ADN dans les régions non structurées ou, alternativement, sur les boucles des structures en épingle à cheveux pour obtenir une liaison plus forte de la cible.
4. Si le site de l’analyte ciblé est plié dans une structure tige-boucle, placez les bras 1 et 2 comme suit : Assurez-vous que le bras 2 lie un côté de la tige, l’anse, et 3 à 5 nt du deuxième côté de la tige ; Le bras 1 lie un fragment du deuxième côté de la tige.
5. Ouvrez l’outil DinaMelt²⁸ (voir Tableau des matériaux) et analysez les séquences des bras et leurs séquences de complément inverse. À l’aide de l’outil DinaMelt, assurez-vous que le T_m des bras 2 et 3 est supérieur à 65 °C : au moins 10 °C au-dessus de la température de dosage (55 °C).
   1. Maintenir le T_m du bras 1 à au moins 1-3 °C au-dessus de la température de réaction (55 °C) si l’on veut obtenir une sélectivité de reconnaissance élevée²⁹.
6. Combinez les séquences Arms 1 et 2 avec les moitiés du noyau DNAzyme et les fragments de liaison F-sub¹³.
7. Analysez la structure secondaire des brins d’ADN conçus à l’aide d’UNAFold²⁷.
   REMARQUE : 55 °C (température d’essai), 200 mM Mg²⁺, 250 mM ions monovalents (HEPES, Na⁺, K⁺).
   1. N’utilisez le modèle que si le ΔG de pliage est inférieur à - 4 kcal/mol. Essayez d’éviter les longues séquences riches en images de synthèse. Si la structure secondaire est trop stable, introduire une mutation dans le bras pour augmenter le repliement ΔG³⁰. Alternativement, placer le bras 3 à 2-3 nt loin du bras 2 est une autre stratégie pour changer la séquence du bras 3 afin d’éviter des structures intermoléculaires stables.
8. Créez une séquence aléatoire pour le fragment de tuile d’ADN aussi long que l’Arm 3. Combinez la séquence Arm 3 avec la séquence de tuiles d’ADN via (dT)_4-6 ou éthylène glycol (par exemple, triéthylène glycol (TEG) ou hexaéthylène glycol (HEG)). La version DNM présentée dans l’expérience utilise (dT)₆.
9. Reliez le bras 2 avec la séquence complémentaire au fragment de tuile d’ADN sélectionné à l’étape 1.8 via un éditeur de liens.
10. Analysez la structure secondaire des brins d’ADN conçus à l’aide de l’application Web UNAFold. Assurez-vous que l’énergie de repliement de chaque brin d’ADN est supérieure à 4 kJ/mol à 55 °C, et évitez les longues séquences enrichies en CG. De préférence, modifiez la séquence de tuiles d’ADN.
11. Dessinez la structure à l’aide de n’importe quel logiciel de graphisme vectoriel disponible. Cet article utilise Biorender et Pixelmator Pro pour la visualisation (voir la Table des matériaux). Vérifiez la précision dans les directions 5'->3' pour chaque brin.
    REMARQUE : Procurez-vous les séquences auprès d’un fournisseur commercial fiable.

2. Test fonctionnel du DNM

1. Préparation du tampon et des réactifs
   1. Préparez le tampon réactionnel composé de 50 mM d’HEPES (pH 7,5-7,8), 50 mM de NaCl, 150 mM de KCl et 200 mM de MgCl₂. Remplissez avec de l’eau déminéralisée jusqu’à 50 ml.
   2. Préparez 10 μM d’aliquotes d’oligonucléotides Dzb-Tile et Tile-Arm3. Préparez une solution de 1 μM de Dza, d’un F-sub de 100 μM et d’analytes de 1 nM, 10 nM et 100 nM dans de l’eau RNase/libre ou de l’eau désionisée stérile. Les détails des séquences d’oligonucléotides sont fournis dans la Table des matériaux.
2. Assemblage DNM
   1. Décongelez complètement les solutions d’oligonucléotides avant de les utiliser. Mélanger délicatement en tapotant (ne pas tourbillonner intensément). Faites tourner (rapidement, pendant quelques secondes) la solution à l’aide d’une microcentrifugeuse.
   2. Mélangez 1 μM de Dzb-Tile et Tile-Arm3 dans 200 μL de tampon de réaction dans des tubes de microcentrifugation de 0,5 mL.
   3. Mélangez doucement le tube et faites tourner la solution.
   4. Enveloppez le couvercle du tube fermé avec un film de paraffine. Vous pouvez également utiliser des tubes à bouchon à vis.
   5. Incuber le tube dans un bécher de 500 ml avec de l’eau bouillante pendant 2 min, puis éteindre le chauffage et laisser la température refroidir passivement pendant la nuit.
   6. Préparez le PAGE natif à 12 % : Mélangez 1 mL de tampon TBE 10х, 3 mL de 40 % d’AA :BA, de l’eau désionisée jusqu’à 10 mL, 50 μL d’APS et 5 μL de TEMED (voir le tableau des matériaux). Déplacez le mélange dans la cassette de gel et laissez-le polymériser.
   7. Mélangez 1 μL de chaque échantillon, à savoir le DNM, le Dzb-Tile et le Tile-arm assemblés3, avec 1 μL de colorant de chargement 4x et chargez-les dans le gel.
   8. Placez la cassette dans la chambre, remplissez-la avec 1 tampon TBE et laissez le gel fonctionner pendant 90 min à 80 V.
   9. Teindre le gel avec du bromure d’éthidium et le visualiser à l’aide d’un système de documentation du gel (voir le tableau des matériaux).
3. Dosage LOD
   1. Préparez 160 μL de F-sub 200 nM dans le tampon de réaction. Ceci est fait pour évaluer le contexte de base de la stabilité du substrat.
   2. Préparez 7 aliquotes de 160 μL de DNM, F-sub et Dza préassemblés à des concentrations de 20 nM de DNM et de Dza et de 200 nM de F-sub dans le tampon de réaction. Sur les sept tubes, gardez le tube #1 comme arrière-plan vierge pour évaluer l’assemblage spontané du noyau de DNAzyme.
   3. Ajouter l’analyte dans les tubes #2-7 aux concentrations finales de 1 pM, 10 pM, 100 pM, 200 pM, 500 pM et 1000 pM.
   4. Mélangez délicatement, faites tourner les tubes et classez les solutions en trois portions de 50 μL dans une plaque noire de 96 puits. Scellez la plaque avec un film optiquement transparent.
   5. Incuber la plaque au bain-marie à 55 °C pendant 1 h. Faites tourner l’assiette.
   6. Mesurez la fluorescence à 525 nm (λ_ex = 495 nm). Calculez la moyenne et l’écart-type pour chaque point.
   7. Calculez le rapport blanc/de base en divisant le signal du tube qui contient F-sub et DNM par le signal du tube qui ne contient que F-sub. Assurez-vous que le rapport se situe dans la plage de 1,1 à 1,5.
   8. Calculez le rapport signal/blanc en divisant le signal du tube qui contient F-sub, DNM et l’analyte par le signal du tube qui contient uniquement F-sub et DNM. Considérez le signal comme vraiment positif s’il est supérieur à la moyenne de fond plus trois écarts-types.
   9. Répétez l’expérience deux fois et assurez-vous que l’écart-type entre les répétitions analytiques est inférieur à 0,5.

Résultats

Le but de la première expérience était de montrer l’assemblage du DNM avant le fragment synthétique de l’analyte. Tous les brins DNM constitutifs ont été ajoutés au tampon de réaction et assemblés dans le bécher. La taille et l’homogénéité du complexe DNM assemblé ont été évaluées par PAGE natif. La PAGE native montre le DNM assemblé avec l’analyte dans la voie 1 et deux brins DNM dans les voies 2 et 4. Si la nanomachine à ADN n’était pas assemblée, 2 ou 3...

Discussion

La conception de machines à ADN est simple mais nécessite une certaine expérience dans la conception de sondes d’hybridation ou de nanostructures d’ADN fonctionnelles. Il convient de garder le fragment d’analyte aussi court que possible afin de diminuer le nombre de structures secondaires possibles et de simplifier l’invasion de DNM dans la structure secondaire. La teneur en CG doit de préférence être inférieure à 60 % pour éviter des structures intramoléculaires stable...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tube	Biofil	CFT011015
100 bp+ DNA Ladder	Evrogen	NL002
100-1000 µL pipette	Kirgen	KG-Pro1000
10-100 µL pipette	Kirgen	KG-Pro100
1-10 µL pipette	Kirgen	KG-Pro10
20-200 µL pipette	Kirgen	KG-Pro200
2-20 µL pipette	Kirgen	KG-Pro20
4x Gel Loading Dye	Evrogen	PB020
Acrylamide 4K	AppliChem	A1090,0500
Ammonium persulfate	Carl Roth	2809447
Biorender	Biorender		https://www.biorender.com
Bisacrylamide	Molekula	22797959
Boric Acid	TechSnab	H-0202
ChemiDoc imaging system	BioRad	12003153
Costar 96-Well Black Polystyrene Plate	Corning	COS3915
DinaMelt	RNA Institute		http://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php
EDTA	Amresco	Am-O105
Ethidium bromide	BioLabMix	EtBr-10
HEPES	Amresco	Am-O485
Magnesium chloride	AppliChem	131396
Mini Protean Tetra Cell	BioRad	1658001EDU
pipette 10 µL tips	Kirgen	KG1111-L
pipette 1000 µL tips	Kirgen	KG1636
pipette 200 µL tips	Kirgen	KG1212-L
Pixelmator Pro	Pixelmator Team		https://www.pixelmator.com/pro/
Potassium chloride	Carl Roth	1782751
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050
RNAse/DNAse free water	Invitrogen	10977049
Sealing film for PCR plates	Sovtech	P-502
Sodium chloride	Vekton	HCh (0,1)
Spark multimode microplate reader	Tecan	Spark- 10M
T100 amplificator	BioRad	10014822
TEMED	Molekula	68604730
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Amresco	Am-O497
UNAFold	RNA Institute		http://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php
Water bath	LOIP	LB-140
Oligos used
Analyte:	Evrogen		direct order, standard desalting purification
GAGCACTTGGTCAGGCACACGG ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG CGGACTACGCCTTCGTTGC
Tile-Arm3:	Evrogen		direct order, standard desalting purification
CCG GGCTGCTGTGCCATTTT TTGCTGACTACTGTCACCTCT CTGCTAGTCT
Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC CGCTGACCACAACGAGAGGAA ACCTT	Evrogen		direct order, standard desalting purification
Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT GTCCGTGTGCCTGACCA	Evrogen		direct order, standard desalting purification
F-sub oligonucleotide: AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU CCCTGGGCA-BHQ1	DNA-Syntez		direct order, HPLC purification