Nanomachines à base de DNAzyme 10-23 pour la reconnaissance des acides nucléiques

Résumé

Les nanomachines basées sur DNAzyme peuvent être utilisées pour la détection hautement sélective et sensible des acides nucléiques. Cet article décrit un protocole détaillé pour la conception de nanomachines basées sur DNAzyme avec un cœur de 10 à 23 à l’aide de logiciels libres et leur application dans la détection d’un fragment de virus d’Epstein-Barr à titre d’exemple.

Résumé

Les nanomachines à base d’ADN (DNM) pour la détection de séquences d’ADN et d’ARN (analytes) sont des structures multifonctionnelles constituées d’oligonucléotides. Leurs fonctions comprennent la liaison serrée de l’analyte, la reconnaissance hautement sélective de l’analyte, l’amplification du signal fluorescent par plusieurs clivages catalytiques d’un substrat rapporteur fluorogène et l’attraction du substrat fluorogène pour une augmentation de la réponse du capteur. Les unités fonctionnelles sont attachées à un échafaudage d’ADN commun pour leur action coopérative. Les DNM 10-23 à clivage de l’ARN présentent une sensibilité améliorée par rapport aux sondes d’hybridation non catalytiques. La stabilité du DNM et les chances accrues de reconnaissance du substrat sont fournies par un fragment d’ADN double brin, une tuile. Le DNM peut différencier deux analytes avec une seule différence nucléotidique dans un ARN replié et un ADN double brin et détecter des analytes à des concentrations ~1000 fois inférieures à celles des autres sondes d’hybridation sans protéines. Cet article présente le concept derrière le potentiel diagnostique de l’activité des nanomachines d’ADN et donne un aperçu de la conception, de l’assemblage et de l’application de DNM dans les tests de détection d’acides nucléiques.

Introduction

L’une des premières méthodes de détection des acides nucléiques est la liaison complémentaire d’oligonucléotides sélectifs aux séquences d’ARN ou d’ADN analysées. Cette méthode utilise des fragments d’acide nucléique (sondes) qui peuvent former des paires de bases Watson-Crick avec un^analyte d’ADN ou d’ARN 1 ciblé. Le complexe est ensuite différencié de l’analyte et de la sonde non liée par diverses techniques. Certaines méthodes, comme le Northern blot, l’hybridation in situ , ou qPCR, sont basées sur le phénomène de liaison complémentaire². Les sondes d’hybridation les plus co....

Protocole

1. Conception DNM

1. Sélectionnez une région unique dans le génome d’intérêt.
   REMARQUE : Ce travail utilise une région du génome du virus d’Epstein-Barr (VEB) aux positions 13972-14154 (OR652423.1).
2. Créez un jeu d’amorces pour l’amplification du fragment sélectionné, par exemple, via l’outil Primer3 intégré à Ugene²⁶.
3. Ouvrez l’outil Web UNAFold²⁷ (voir la table des matériaux) et insérez la région sélectionnée. Modifiez la température de repliement à 55 °C et les conditions ioniques à 250 mM d’ions monovalents et 200....

Discussion

La conception de machines à ADN est simple mais nécessite une certaine expérience dans la conception de sondes d’hybridation ou de nanostructures d’ADN fonctionnelles. Il convient de garder le fragment d’analyte aussi court que possible afin de diminuer le nombre de structures secondaires possibles et de simplifier l’invasion de DNM dans la structure secondaire. La teneur en CG doit de préférence être inférieure à 60 % pour éviter des structures intramoléculaires stable.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tube	Biofil	CFT011015
100 bp+ DNA Ladder	Evrogen	NL002
100-1000 µL pipette	Kirgen	KG-Pro1000
10-100 µL pipette	Kirgen	KG-Pro100
1-10 µL pipette	Kirgen	KG-Pro10
20-200 µL pipette	Kirgen	KG-Pro200
2-20 µL pipette	Kirgen	KG-Pro20
4x Gel Loading Dye	Evrogen	PB020
Acrylamide 4K	AppliChem	A1090,0500
Ammonium persulfate	Carl Roth	2809447
Biorender	Biorender		https://www.biorender.com
Bisacrylamide	Molekula	22797959
Boric Acid	TechSnab	H-0202
ChemiDoc imaging system	BioRad	12003153
Costar 96-Well Black Polystyrene Plate	Corning	COS3915
DinaMelt	RNA Institute		http://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php
EDTA	Amresco	Am-O105
Ethidium bromide	BioLabMix	EtBr-10
HEPES	Amresco	Am-O485
Magnesium chloride	AppliChem	131396
Mini Protean Tetra Cell	BioRad	1658001EDU
pipette 10 µL tips	Kirgen	KG1111-L
pipette 1000 µL tips	Kirgen	KG1636
pipette 200 µL tips	Kirgen	KG1212-L
Pixelmator Pro	Pixelmator Team		https://www.pixelmator.com/pro/
Potassium chloride	Carl Roth	1782751
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050
RNAse/DNAse free water	Invitrogen	10977049
Sealing film for PCR plates	Sovtech	P-502
Sodium chloride	Vekton	HCh (0,1)
Spark multimode microplate reader	Tecan	Spark- 10M
T100 amplificator	BioRad	10014822
TEMED	Molekula	68604730
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Amresco	Am-O497
UNAFold	RNA Institute		http://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php
Water bath	LOIP	LB-140
Oligos used
Analyte:	Evrogen		direct order, standard desalting purification
GAGCACTTGGTCAGGCACACGG ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG CGGACTACGCCTTCGTTGC
Tile-Arm3:	Evrogen		direct order, standard desalting purification
CCG GGCTGCTGTGCCATTTT TTGCTGACTACTGTCACCTCT CTGCTAGTCT
Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC CGCTGACCACAACGAGAGGAA ACCTT	Evrogen		direct order, standard desalting purification
Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT GTCCGTGTGCCTGACCA	Evrogen		direct order, standard desalting purification
F-sub oligonucleotide: AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU CCCTGGGCA-BHQ1	DNA-Syntez		direct order, HPLC purification