JoVE Logo
发表
联系我们

登录

需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

基于 DNAzyme 的纳米机器可用于核酸的高选择性和灵敏检测。本文以免费软件为例，描述了使用免费软件设计具有 10-23 核心的基于 DNAzyme 的纳米机器的详细方案及其在 Epstein-Barr 病毒片段检测中的应用。

摘要

用于检测 DNA 和 RNA 序列（分析物）的基于 DNAzyme 的纳米机器 （DNM） 是由寡核苷酸制成的多功能结构。它们的功能包括紧密的分析物结合、高选择性的分析物识别、通过荧光报告基因底物的多次催化裂解放大荧光信号，以及提高传感器响应的荧光底物吸引。功能单元连接到一个共同的 DNA 支架上，以实现它们的协同作用。与非催化杂交探针相比，RNA 切割 10-23 个 DNM 具有更高的灵敏度。DNM 的稳定性和底物识别机会的增加是由双链 DNA 片段（一个 tile）提供的。DNM 可以区分折叠 RNA 和双链 DNA 中具有单核苷酸差异的两种分析物，并检测浓度比其他无蛋白杂交探针低 ~1000 倍的分析物。本文介绍了 DNA-纳米机器活性诊断潜力背后的概念，并概述了 DNM 的设计、组装和在核酸检测分析中的应用。

引言

核酸检测的最早方法之一是选择性寡核苷酸与分析的 RNA 或 DNA 序列的互补结合。该方法采用可与靶向 DNA 或 RNA 分析物形成 Watson-Crick 碱基对的核酸片段（探针）1。然后通过各种技术将复合物与分析物和未结合的探针区分开来。某些方法（如 Northern 印迹、 原位 杂交或 qPCR）基于互补结合现象 2。最常见的杂交探针有两个明显的缺点:灵敏度低（它们可以达到微摩尔到纳摩尔水平）以及对单核苷酸变异 （SNV） 的低选择性，包括点突变。这个问题需要一种复杂的方法，因为这些缺点的解决方案是相互冲突的3.为了提供最佳选择性，检测寡核苷酸应保持足够短，以便与错配分析物形成不稳定的杂交体。这种短寡核苷酸无法紧密结合目标核酸并解开其二级结构，因此通常无法提供可检测的信号。在生物 RNA 或双链 DNA （dsDNA） 中检测富含 CG 的片段尤其具有挑战性。另一方面，长探针对 SNV3 不敏感。为了打破僵局，已经开发了二进制探针的概念4.

二元传感器将单个检测探针分成两部分并专门化其片段，使其中一个片段保持较长以解开发夹或侵入 dsDNA。第二个二元探针片段保持短，以便对不匹配的碱基敏感，从而提供了一种检测 SNV 的方法。如果两个二进制传感器部件连接在一起，就会产生信号4.完整的复合物可以通过 FRET 5、分子信标探针 6,7 或具有过氧化物酶样活性 8,9,10 的 G 四链体，或者 RNA 切割 11,12,13 DNAzyme 进行可视化。具有 10-23 DNAzyme 核心的二元传感器已经得到了充分的描述。它们已适应于检测合成产生的单链核酸片段11 或单链扩增产物14,15。例如，从细胞培养物中提取的 16S rRNA 也可以进行检测，因为该分子在细胞中含量丰富12,16。具有 10-23 DNAzyme 核心的二元传感器也可用于非核酸检测，例如铅离子17。尽管如此，低灵敏度仍然被认为是二元 10-23 DNAzyme 传感器的主要缺点之一，并且已经开发了各种方法，包括级联18 或替代信号增强方法19，来解决这个问题。遗憾的是，上述技术大大增加了传感器组件的成本和不稳定性，因此尚未付诸实践。

这项工作中描述的实验使用 10-23 个基于 DNAzyme 的 DNA 纳米传感器，称为 DNA 纳米机 （DNM）20,21。这些结构包括二元传感器以及 （1） 位于二元探针两侧的 DNA 促进剂，展开结构化区域并侵入双链 DNA，以及 （2） 将所有 DNM 部分紧密结合并增加信号形成机会的 DNA 图块（图 1）。总而言之，10-23 个基于 DNAzyme 的 DNM 将检测限 （LOD） 降低到皮摩尔范围21;它们可用于检测细胞裂解物中的 16rRNA22 或报告病毒 RNA 的存在而不进行扩增23,24。同时，DNM 对 SNV 仍然敏感，甚至可以用于对杂合生物体中的等位基因进行基因分型25。DNM 方法可用作任何扩增类型的补充技术，用于高选择性复杂混合物中的产物可视化或鉴定。与传统的 TaqMan 和信标探针不同，DNM 不需要加热样品，因此可用于终点检测方案，使整体检测具有成本效益。

本文介绍了 DNM 的计算机开发， 并演示了 DNM 的组装和功能表征程序。该工作是使用对应于病毒 DNA 13972-14154 位置 （OR652423.1） 的 Epstein-Barr 病毒 （EBV） 的合成片段进行的（参见 材料表）。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

1. DNM 设计

  1. 在感兴趣的基因组中选择一个独特的区域。
    注:这项工作在位置 13972-14154 （OR652423.1） 中使用了 Epstein-Barr 病毒 （EBV） 基因组的一个区域。
  2. 创建用于扩增所选片段的引物组，例如 ，通过 嵌入 Ugene26 中的 Primer3 工具。
  3. 打开 UNAFold web 工具27 （请参阅 材料表）并插入所选区域。将折叠温度更改为 55 °C，离子条件更改为 250 mM 的一价离子和 200 mM 的 Mg2+。
    1. 打开 ssDNA 片段的二级结构并选择稳定的发夹。将 DNA 纳米机器的结合位点定位在非结构化区域或发夹结构的环上，以实现更强的靶标结合。
  4. 如果目标分析物位点折叠成茎环结构，则按如下方式放置臂 1 和 2:确保臂 2 结合茎的一侧、环和第二茎侧的 3-5 nt;Arm 1 结合第二茎侧的片段。
  5. 打开 DinaMelt 工具28 （参见 材料表）并分析臂的序列及其反向互补序列。使用 DinaMelt 工具确保 Arms 2 和 3 的 Tm 高于 65 °C:至少比测定温度 （55 °C） 高 10 °C。
    1. 如果要实现高识别选择性，请将 Arm 1 的 Tm 保持在反应温度 （55 °C） 以上至少 1-3 °C29。
  6. 将 Arms 1 和 2 序列与 DNAzyme 核心的两半和 F-sub 结合片段13 结合。
  7. 使用 UNAFold27 分析设计的 DNA 链的二级结构。
    注:55 °C（测定温度），200 mM Mg2+，250 mM 单价离子（HEPES，Na+，K+）。
    1. 仅当折叠 ΔG 低于 - 4 kcal/mol 时才使用该设计。尽量避免使用富含 CG 的长序列。如果二级结构太稳定，则向手臂引入突变以增加折叠 ΔG30。或者，将 Arm 3 2-3 nt 放置在远离 Arm 2 的位置是另一种改变 Arm 3 序列以避免稳定的分子间结构的策略。
  8. 为 DNA 瓦片片段创建一个随机序列，只要 Arm 3 即可。 通过 （dT）4-6 或乙二醇（例如，三甘醇 （TEG） 或六甘醇 （HEG））将 Arm 3 序列与 DNA 瓦片序列结合。实验中提供的 DNM 版本使用 （dT）6。
  9. 通过接头将臂 2 与步骤 1.8 中选择的 DNA 瓦片片段互补的序列连接起来。
  10. 使用 UNAFold 网络应用程序分析设计的 DNA 链的二级结构。确保每条 DNA 链的折叠能量在 55 °C 时高于 4 kJ/mol，并避免长 CG 富集序列。最好更改 DNA 瓦片序列。
  11. 使用任何可用的矢量图形软件绘制结构。本文使用 Biorender 和 Pixelmator Pro 进行可视化（参见 材料表）。验证每根链 5'->3' 方向的准确性。
    注意:从可靠的商业供应商处获取序列。

2. DNM 的功能测试

  1. 缓冲液和试剂的制备
    1. 制备由 50 mM HEPES （pH 7.5-7.8）、50 mM NaCl、150 mM KCl 和 200 mM MgCl2 组成的反应缓冲液。加入去离子水，最多可填充 50 mL。
    2. 制备 10 μM 等分试样的 Dzb-Tile 和 Tile-Arm3 寡核苷酸。在无 RNase/Free 水或无菌去离子水中制备 1 μM Dza、100 μM F-Sub 和 1 nM、10 nM、100 nM 分析物溶液。寡核苷酸序列的详细信息在 材料表中提供。
  2. DNM 程序集
    1. 使用前请完全解冻寡核苷酸溶液。轻敲轻轻混合（不要强烈涡旋）。使用微量离心机旋转（快速，几秒钟）溶液。
    2. 在 0.5 mL 微量离心管中，将 Dzb-Tile 和 Tile-Arm3 各混合在 200 μL 反应缓冲液中。
    3. 轻轻混合试管并旋转溶液。
    4. 用石蜡膜包裹封闭管的盖子。或者，使用螺帽管。
    5. 将试管放入装有沸水的 500 mL 烧杯中孵育 2 分钟，然后关闭加热器，让温度被动冷却过夜。
    6. 准备 12% 天然 PAGE:混合 1 mL 10х TBE 缓冲液、3 mL 40% AA:BA、最多 10 mL 的去离子水、50 μL APS 和 5 μL TEMED（参见 材料表）。将混合物移至凝胶盒中，使其聚合。
    7. 将 1 μL 每个样品（即组装的 DNM、Dzb-Tile 和 Tile-arm3）与 1 μL 4x 上样染料混合，然后将它们加载到凝胶中。
    8. 将盒放入腔室中，用 1x TBE 缓冲液填充，让凝胶在 80 V 下运行 90 分钟。
    9. 用溴化乙锭对凝胶进行染色，并使用凝胶记录系统对其进行可视化（参见 材料表）。
  3. LOD 检测
    1. 在反应缓冲液中制备 160 μL 的 200 nM F-sub。这样做是为了评估基材稳定性的基本背景。
    2. 在反应缓冲液中制备 7 等分试样，浓度为 20 nM DNM 和 Dza 以及 200 nM F-sub 的 160 μL 预组装 DNM、F-sub 和 Dza。在七个试管中，将试管 #1 作为空白背景，以评估 DNAzyme 核心的自发组装。
    3. 将分析物以 1 pM、10 pM、100 pM、200 pM、500 pM 和 1000 pM 的终浓度添加到试管 #2-7 中。
    4. 轻轻混合，旋转试管，将溶液分成 3 份 50 μL 放入黑色 96 孔板中。用光学透明薄膜密封板。
    5. 将板在 55 °C 的水浴中孵育 1 小时。旋转盘子。
    6. 测量 525 nm 处的荧光 （λex = 495 nm）。计算每个点的平均值和标准差。
    7. 通过将包含 F-sub 和 DNM 的管信号除以仅包含 F-sub 的管信号来计算空白与碱性比。确保比率在 1.1-1.5 范围内。
    8. 通过将包含 F-sub、DNM 和分析物的试管信号除以仅包含 F-sub 和 DNM 的试管信号来计算信标空白比。如果信号高于背景平均值加上三个标准差，则将其视为真阳性。
    9. 重复实验两次，并确保分析重复之间的标准差小于 0.5。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

第一个实验的目的是显示分析物的合成片段之前 DNM 的组装。将所有组成 DNM 链添加到反应缓冲液中并在烧杯中组装。通过天然 PAGE 评估组装的 DNM 复合物的正确大小和均一性。非变性 PAGE 显示了组装的 DNM，其中分析物位于泳道 1 中，两条 DNM 链位于泳道 2 和 4 中。如果 DNA 纳米机器没有组装，则可以看到 2 或 3 个单独的条带，而不是单个低迁移率条带（ 图...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

DNA 机器的设计很简单，但需要一些设计杂交探针或功能性 DNA 纳米结构的经验。适当的做法是使分析物碎片尽可能短，以减少可能的二级结构的数量并简化 DNM 对二级结构的侵袭。CG 含量最好低于 60%，以避免稳定的分子内结构。DNM 的成功组装是在缓慢的冷却速率下实现的。在某些情况下，DNM 可以在管中自发组装，并且可以省去退火步骤。DNM 组装可以在 0.1-0.3 °C/min 的热?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

披露声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

作者要感谢 Ekaterina V. Nikitina 慷慨提供 EBV 的 gDNA。Muhannad Ateiah、Maria Y. Berezovskaya 和 Maria S. Rubel 感谢俄罗斯联邦教育和科学部（拨款号 FSER-2022-0009）和 2030 年优先计划。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL tubeBiofilCFT011015
100 bp+ DNA LadderEvrogenNL002
100-1000 µL pipetteKirgenKG-Pro1000
10-100 µL pipetteKirgenKG-Pro100
1-10 µL pipetteKirgenKG-Pro10
20-200 µL pipetteKirgenKG-Pro200
2-20 µL pipetteKirgenKG-Pro20
4x Gel Loading DyeEvrogenPB020
Acrylamide 4KAppliChemA1090,0500
Ammonium persulfateCarl Roth2809447
BiorenderBiorenderhttps://www.biorender.com
BisacrylamideMolekula22797959
Boric AcidTechSnabH-0202
ChemiDoc imaging systemBioRad12003153
Costar 96-Well Black Polystyrene PlateCorningCOS3915
DinaMeltRNA Institutehttp://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php
EDTAAmrescoAm-O105
Ethidium bromideBioLabMixEtBr-10
HEPESAmrescoAm-O485
Magnesium chlorideAppliChem131396
Mini Protean Tetra CellBioRad1658001EDU
pipette 10 µL tipsKirgenKG1111-L
pipette 1000 µL tipsKirgenKG1636
pipette 200 µL tipsKirgenKG1212-L
Pixelmator ProPixelmator Teamhttps://www.pixelmator.com/pro/
Potassium chlorideCarl Roth1782751
PowerPac Basic Power SupplyBioRad1645050
RNAse/DNAse free waterInvitrogen10977049
Sealing film for PCR platesSovtechP-502
Sodium chlorideVektonHCh (0,1)
Spark multimode microplate readerTecanSpark- 10M
T100 amplificatorBioRad10014822
TEMEDMolekula68604730
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneAmrescoAm-O497
UNAFoldRNA Institutehttp://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php
Water bathLOIPLB-140
Oligos used
Analyte:Evrogendirect order, standard desalting purification
GAGCACTTGGTCAGGCACACGG
ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG
TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG
GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG
CGGACTACGCCTTCGTTGC
Tile-Arm3:Evrogendirect order, standard desalting purification
CCG GGCTGCTGTGCCATTTT
TTGCTGACTACTGTCACCTCT
CTGCTAGTCT
Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG
TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC
CGCTGACCACAACGAGAGGAA
ACCTT		Evrogendirect order, standard desalting purification
Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT
GTCCGTGTGCCTGACCA		Evrogendirect order, standard desalting purification
F-sub oligonucleotide: AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU
CCCTGGGCA-BHQ1		DNA-Syntezdirect order, HPLC purification

参考文献

  1. Kolpashchikov, D. M. Evolution of hybridization probes to DNA machines and robots. Acc. Chem Res. 52, 1949-1956 (2019).
  2. Guo, J., Ju, J., Turro, N. J. Fluorescent hybridization probes for nucleic acid detection. Anal. Bioanal Chem. 402, 3115-3125 (2012).
  3. Demidov, V. V., Frank-Kamenetskii, M. D. Two sides of the coin: affinity and specificity of nucleic acid interactions. Tr Bioche Sc. 29 (2), 62-71 (2004).
  4. Kolpashchikov, D. M. Binary probes for nucleic acid analysis. Chem Rev. 110, 4709-4723 (2010).
  5. Marti, A. A., Jockusch, S., Stevens, N., Ju, J., Turro, N. J. Fluorescent hybridization probes for sensitive and selective DNA and RNA detection. Acc Chem Res. 40 (6), 402-409 (2007).
  6. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Detection of bacterial 16S rRNA using a molecular beacon-based X sensor. Biosens.Bioelectron. 41, 386-390 (2013).
  7. Dark, P., et al. Accuracy of LightCycler Septi Fast for the detection and identification of pathogens in the blood of patients with suspected sepsis: a systematic review and meta-analysis. Intensive Care Med. 41, 21-33 (2015).
  8. Maltzeva, Y. I., Gorbenko, D. A., Nikitina, E. V., Rubel, M. S., Kolpashchikov, D. M. Visual Detection of Stem-Loop Primer Amplification (SPA) products without denaturation using peroxidase-like DNA machines (PxDM). Int J Mol Sc. 24 (9), 7812(2023).
  9. Gorbenko, D. A., et al. DNA nanomachine for visual detection of structured RNA and double stranded DNA. Chem Comm. 58 (35), 5395-5398 (2022).
  10. Roembke, B. T., Nakayama, S., Sintim, H. O. Nucleic acid detection using G-quadruplex amplification methodologies. Methods. 64 (3), 185-198 (2013).
  11. Mokany, E., Bone, S. M., Young, P. E., Doan, T. B., Todd, A. V. MNAzymes, a versatile new class of nucleic acid enzymes that can function as biosensors and molecular switches. JACS. 132 (3), 1051-1059 (2010).
  12. Gerasimova, Y. V., Cornett, E., Kolpashchikov, D. M. RNA cleaving deoxyribozyme sensor for nucleic acid analysis: the limit of detection. Chem Bio Chem. 11, 811-817 (2010).
  13. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Folding 16S RNA in a signal-producing structure for detection of bacteria. Angew Chem Int Ed. 52, 10586-10588 (2013).
  14. Hu, M., et al. Allosteric DNAzyme-based encoder for molecular information transfer. Chin. Chem Let. , 109232(2023).
  15. Peeters, B., et al. Solid-phase PCR-amplified DNAzyme activity for real-time FO-SPR detection of the MCR-2 gene. Anal Chem. 92 (15), 10783-10791 (2020).
  16. Wood, H. N., et al. Species typing of nontuberculous Mycobacteria by use of deoxyribozyme sensors. Clin Chem. 65 (2), 333-341 (2019).
  17. Yan, T., et al. Ultralow background one-pot detection of Lead (II) using a non-enzymatic double-cycle system mediated by a hairpin-involved DNAzyme. Biosen Bioelectron. 237, 115534(2023).
  18. Hasick, N. J., Radhika, R., Todd, A. V. Subzymes: Regulating DNAzymes for point of care nucleic acid sensing. Sens. Act. B: Chem. 297, 126704(2019).
  19. Safdar, S., et al. DNA-only, microwell-based bioassay for multiplex nucleic acid detection with single base-pair resolution using MNAzymes. Biosen Bioelectron. 152, 112017(2020).
  20. Cox, A. J., Bengtson, H. N., Gerasimova, Y. V., Rohde, K. H., Kolpashchikov, D. M. DNA antenna tile-associated deoxyribozyme sensor with improved sensitivity. Chem Bio Chem. 17 (21), 2038-2041 (2016).
  21. Lyalina, T. A., Goncharova, E. A., Prokofeva, N. Y., Voroshilina, E. S., Kolpashchikov, D. M. A DNA minimachine for selective and sensitive detection of DNA. Analyst. 144 (2), 416-420 (2019).
  22. Ateiah, M., Gandalipov, E. R., Rubel, A. A., Rubel, M. S., Kolpashchikov, D. M. DNA Nanomachine (DNM) Biplex Assay for Differentiating Bacillus cereus Species. Int J Mol Sc. 24 (5), 4473(2023).
  23. El-Deeb, A. A., et al. Toward a home test for COVID-19 diagnosis: DNA machine for amplification-free SARS-CoV-2 detection in clinical samples. Chem Med Chem. 17 (20), 202200382(2022).
  24. Kirichenko, A., Bryushkova, E., Dedkov, V., Dolgova, A. A Novel DNAzyme-based fluorescent biosensor for detection of RNA-containing Nipah henipavirus. Biosensors. 13 (2), 252(2023).
  25. Akhmetova, M. M., Rubel, M. S., Afanasenko, O. S., Kolpashchikov, D. M. Barley haplotyping using biplex deoxyribozyme nanomachine. Sens Act Rep. 4, 100132(2022).
  26. Okonechnikov, K., et al. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics. 28, 1166-1167 (2012).
  27. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
  28. Markham, N. R., Zuker, M. DINAMelt web server for nucleic acid melting prediction. Nucleic Acids Res. 33, Web Server issue W577-W581 (2005).
  29. Stancescu, M., Fedotova, T. A., Hooyberghs, J., Balaeff, A., Kolpashchikov, D. M. Nonequilibrium hybridization enables discrimination of a point mutation within 5-40 C. JACS. 138 (41), 13465-13468 (2016).
  30. Dong, J., Ouyang, Y., Wang, J., O'Hagan, M. P., Willner, I. Assembly of dynamic gated and cascaded transient DNAzyme networks. ACS Nano. 16 (4), 6153-6164 (2022).
  31. Montserrat Pagès, A., Hertog, M., Nicolaï, B., Spasic, D., Lammertyn, J. Unraveling the kinetics of the 10-23 RNA-cleaving DNAzyme. Int J Mol Sc. 24 (18), 13686(2023).
  32. Nguyen, C., Grimes, J., Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Molecular-beacon-based tricomponent probe for SNP analysis in folded nucleic acids. Chem-eur J. 17 (46), 13052-13058 (2011).
  33. MacDougall, D., Crummett, W. B. Guidelines for data acquisition and data quality evaluation in environmental chemistry. Anal Chem. 52 (14), 2242-2249 (1980).
  34. Gerasimova, Y. V., Yakovchuk, P., Dedkova, L. M., Hecht, S. M., Kolpashchikov, D. M. Expedited quantification of genetically modified ribosomal RNA by binary deoxyribozyme sensors. RNA. 10, 1834-1843 (2015).
  35. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Folding 16S RNA in a signal-producing structure for detection of bacteria. Angew Chem Int Ed. 52, 10586-10588 (2013).
  36. GC Content Calculator. , Available from: https://www.biologicscorp.com/tools/GCContent/#.ZEfxPiyOHYU (2023).
  37. Hussein, Z., et al. DNAzyme nanomachine with fluorogenic substrate delivery function: advancing sensitivity in nucleic acid detection. Anal Chem. 95 (51), 18667-18672 (2023).
  38. Safdar, S., et al. DNA-only, microwell-based bioassay for multiplex nucleic acid detection with single base-pair resolution using MNAzymes. Biosen Bioelectron. 152, 112017(2020).
  39. Gerasimova, Y. V., et al. Deoxyribozyme cascade for visual detection of bacterial RNA. Chem Bio Chem. 14, 2087-2090 (2013).
  40. Eckert, K. A., Kunkel, T. A. DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction. Gen Res. 1 (1), 17-24 (1991).
  41. Pandya, K., Jagani, D., Singh, N. CRISPR-Cas systems: Programmable nuclease revolutionizing the molecular diagnosis. Mol Biotech. , (2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

DNA 10 23 DNA RNA DNA DNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。