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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Le nanomacchine basate su DNAzyme possono essere utilizzate per il rilevamento altamente selettivo e sensibile degli acidi nucleici. Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per la progettazione di nanomacchine basate su DNAzyme con un nucleo 10-23 utilizzando software libero e la loro applicazione nel rilevamento di un frammento di virus di Epstein-Barr come esempio.

Abstract

Le nanomacchine basate su DNAzimi (DNM) per la rilevazione di sequenze di DNA e RNA (analiti) sono strutture multifunzionali costituite da oligonucleotidi. Le loro funzioni includono lo stretto legame dell'analita, il riconoscimento altamente selettivo dell'analita, l'amplificazione del segnale fluorescente mediante molteplici scissioni catalitiche di un substrato reporter fluorogenico e l'attrazione del substrato fluorogenico per un aumento della risposta del sensore. Le unità funzionali sono attaccate a un'impalcatura comune di DNA per la loro azione cooperativa. I DNM 10-23 con scissione dell'RNA presentano una sensibilità migliorata rispetto alle sonde di ibridazione non catalitica. La stabilità del DNM e le maggiori possibilità di riconoscimento del substrato sono fornite da un frammento di DNA a doppio filamento, una piastrella. DNM è in grado di differenziare due analiti con una differenza di singolo nucleotide in un RNA ripiegato e in un DNA a doppio filamento e rilevare analiti a concentrazioni ~1000 volte inferiori rispetto ad altre sonde di ibridazione senza proteine. Questo articolo presenta il concetto alla base del potenziale diagnostico dell'attività delle nanomacchine a DNA e una panoramica della progettazione, dell'assemblaggio e dell'applicazione del DNM nei saggi di rilevamento degli acidi nucleici.

Introduzione

Uno dei primi metodi per la rilevazione dell'acido nucleico è il legame complementare di oligonucleotidi selettivi alle sequenze di RNA o DNA analizzate. Questo metodo impiega frammenti di acido nucleico (sonde) che possono formare coppie di basi di Watson-Crick con un analita di DNA o RNA1 mirato. Il complesso viene quindi differenziato dall'analita e dalla sonda non legata mediante una varietà di tecniche. Alcuni metodi, come il Northern blotting, l'ibridazione in situ o qPCR, si basano sul fenomeno del legame complementare2. Le sonde di ibridazione più comuni presentano due svantaggi significativi: bassa sensibilità (possono raggiungere livelli da micromolari a nanomolari) e bassa selettività alle variazioni di singolo nucleotide (SNV), comprese le mutazioni puntiformi. La questione richiede un approccio sofisticato poiché le soluzioni a questi inconvenienti sono in conflitto tra loro3. Per fornire la migliore selettività, l'oligonucleotide rivelatore deve essere mantenuto sufficientemente corto da formare ibridi instabili con analiti non corrispondenti. Tali oligonucleotidi corti non sono in grado di legare strettamente gli acidi nucleici bersaglio e di svolgere le loro strutture secondarie, quindi spesso non riescono a fornire un segnale rilevabile. È particolarmente difficile rilevare frammenti ricchi di CG nell'RNA biologico, o DNA a doppio filamento (dsDNA). D'altra parte, le sonde lunghe sono insensibili a SNV3. Per sbloccare la situazione, è stato sviluppato il concetto di sonda binaria4.

I sensori binari dividono una singola sonda di rilevamento in due parti e ne specializzano i frammenti, mantenendone uno a lungo per srotolare le forcine o invadere il dsDNA. Il secondo frammento di sonda binaria rimane corto per essere sensibile a una base non corrispondente, fornendo così un mezzo per rilevare SNV. Il segnale verrà prodotto se le due parti binarie del sensore sono unite insieme4. L'intero complesso può essere visualizzato tramite FRET5, sonda beacon molecolare 6,7 o G-quadruplex con attività simile alla perossidasi 8,9,10, oppure 11,12,13 DNAzima che scissa l'RNA. I sensori binari con un nucleo di DNAzima 10-23 sono stati ampiamente descritti. Sono stati adattati per rilevare frammenti di acido nucleico a singolo filamento creati sinteticamente11 o prodotti di amplificazione a singolo filamento 14,15. La rilevazione senza amplificazione è possibile, ad esempio, anche nel caso dell'rRNA 16S estratto da una coltura cellulare, poiché questa molecola è abbondante nelle cellule 12,16. I sensori binari con un nucleo DNAzyme 10-23 possono anche essere adattati per la rilevazione di acidi non nucleici, come per gli ioni piombo17. Tuttavia, la bassa sensibilità è ancora considerata uno dei principali svantaggi dei sensori binari 10-23 DNAzyme e per risolvere questo problema sono stati sviluppati vari approcci, tra cui le cascate18 o i metodi alternativi di miglioramento del segnale19. Sfortunatamente, le tecniche di cui sopra aumentano drasticamente il costo e l'instabilità dei componenti del sensore, e quindi non sono entrate in pratica.

L'esperimento descritto in questo lavoro utilizza 10-23 nanosensori di DNA basati su DNAzima denominati DNA-nanomacchine (DNM)20,21. Queste strutture includono sensori binari e anche (1) facilitatori di DNA che fiancheggiano la sonda binaria, svolgendo le regioni strutturate e invadendo il DNA a doppio filamento, e (2) una piastrella di DNA che tiene insieme tutte le parti DNM in stretta vicinanza e aumenta le possibilità di formazione del segnale (Figura 1). Complessivamente, i DNM basati su DNAzima 10-23 riducono il limite di rilevabilità (LOD) fino all'intervallo picomolare21; possono essere utilizzati per rilevare il 16rRNA nei lisati cellulari22 o segnalare la presenza di RNA virale senza amplificazione23,24. Allo stesso tempo, i DNM rimangono sensibili all'SNV e possono anche essere utilizzati per genotipizzare gli alleli in organismi eterozigoti25. Il metodo DNM può essere utilizzato come tecnica complementare a qualsiasi tipo di amplificazione per la visualizzazione del prodotto o l'identificazione del prodotto in una miscela complessa con elevata selettività. I DNM, a differenza delle sonde TaqMan e beacon convenzionali, non richiedono il riscaldamento del campione e quindi possono essere utilizzati nei protocolli di rilevamento degli endpoint, rendendo il rilevamento complessivo conveniente.

Questo articolo descrive lo sviluppo in silico di un DNM e illustra le procedure per l'assemblaggio e la caratterizzazione funzionale del DNM. Il lavoro è stato eseguito utilizzando un frammento sintetico del virus di Epstein-Barr (EBV) corrispondente alle posizioni 13972-14154 del DNA virale (OR652423.1) (vedi Tabella dei materiali).

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Protocollo

1. Progettazione DNM

  1. Seleziona una regione unica all'interno del genoma di interesse.
    NOTA: Questo lavoro utilizza una regione del genoma del virus di Epstein-Barr (EBV) nelle posizioni 13972-14154 (OR652423.1).
  2. Crea un set di primer per l'amplificazione del frammento selezionato, ad esempio, tramite lo strumento Primer3 incorporato in Ugene26.
  3. Aprire lo strumento web UNAFold27 (vedere Tabella dei materiali) e inserire la regione selezionata. Modificare la temperatura di ripiegamento a 55 °C e le condizioni ioniche a 250 mM di ioni monovalenti e 200 mM di Mg2+.
    1. Aprire la struttura secondaria risultante del frammento di ssDNA e selezionare una forcina stabile. Localizzare il sito di legame delle nanomacchine a DNA nelle regioni non strutturate o, in alternativa, sugli anelli delle strutture a forcina per ottenere un legame più forte del bersaglio.
  4. Se il sito dell'analita di destinazione è piegato in una struttura ad anello dello stelo, posizionare i bracci 1 e 2 come segue: Assicurarsi che il braccio 2 leghi un lato dello stelo, l'ansa e 3-5 nt del secondo lato dello stelo; Il braccio 1 lega un frammento del secondo lato del gambo.
  5. Aprire lo strumento DinaMelt28 (vedi Tabella dei materiali) e analizzare le sequenze dei bracci e le loro sequenze di complemento inverso. Utilizzare lo strumento DinaMelt per assicurarsi che la Tm dei bracci 2 e 3 sia superiore a 65 °C: almeno 10 °C al di sopra della temperatura del saggio (55 °C).
    1. Mantenere la Tm del braccio 1 ad almeno 1-3 °C al di sopra della temperatura di reazione (55 °C) se si vuole raggiungere un'elevata selettività di riconoscimento29.
  6. Combina le sequenze Arms 1 e 2 con le metà del nucleo DNAzyme e i frammenti di legame F-sub13.
  7. Analizza la struttura secondaria dei filamenti di DNA progettati utilizzando UNAFold27.
    NOTA: 55 °C (temperatura del saggio), 200 mM Mg2+, 250 mM di ioni monovalenti (HEPES, Na+, K+).
    1. Utilizzare il design solo se il ΔG di piegatura è inferiore a - 4 kcal/mol. Cerca di evitare lunghe sequenze ricche di CG. Se la struttura secondaria è troppo stabile, introdurre una mutazione nel braccio per aumentare il ΔG di ripiegamentodi 30. In alternativa, posizionare il braccio 3 a 2-3 nt di distanza dal braccio 2 è un'altra strategia per modificare la sequenza del braccio 3 per evitare strutture intermolecolari stabili.
  8. Crea una sequenza casuale per il frammento di tessera di DNA lunga quanto il braccio 3. Combina la sequenza Arm 3 con la sequenza di tessere di DNA tramite (dT)4-6 o glicole etilenico (ad esempio, glicole trietilenico (TEG) o glicole esaetilenico (HEG)). La versione DNM presentata nell'esperimento utilizza (dT)6.
  9. Collegare Arm 2 con la sequenza complementare al frammento di piastrella di DNA selezionato nel passaggio 1.8 tramite un linker.
  10. Analizza la struttura secondaria dei filamenti di DNA progettati utilizzando l'app web UNAFold. Assicurarsi che l'energia di ripiegamento di ciascun filamento di DNA sia superiore a 4 kJ/mol a 55 °C ed evitare lunghe sequenze arricchite di CG. Preferibilmente, cambia la sequenza delle tessere di DNA.
  11. Disegna la struttura utilizzando qualsiasi software di grafica vettoriale disponibile. Questo articolo utilizza Biorender e Pixelmator Pro per la visualizzazione (vedi Tabella dei materiali). Verificare l'accuratezza nelle direzioni 5'->3' per ogni filo.
    NOTA: Ottenere le sequenze da un fornitore commerciale affidabile.

2. Test funzionale del DNM

  1. Preparazione del tampone e dei reagenti
    1. Preparare il tampone di reazione composto da 50 mM di HEPES (pH 7,5-7,8), 50 mM di NaCl, 150 mM di KCl e 200 mM di MgCl2. Riempire con acqua deionizzata fino a 50 mL.
    2. Preparare aliquote da 10 μM di oligonucleotidi Dzb-Tile e Tile-Arm3. Preparare 1 μM di soluzione di Dza, un F-sub da 100 μM e analiti da 1 nM, 10 nM, 100 nM in RNasi/acqua libera o acqua deionizzata sterile. I dettagli delle sequenze oligonucleotidiche sono forniti nella Tabella dei Materiali.
  2. Assemblaggio DNM
    1. Scongelare completamente le soluzioni di oligonucleotidi prima dell'uso. Mescolare delicatamente picchiettando (non vorticare intensamente). Centrifugare (rapidamente, per alcuni secondi) la soluzione utilizzando una microcentrifuga.
    2. Miscelare 1 μM ciascuno di Dzb-Tile e Tile-Arm3 in 200 μL del tampone di reazione in provette per microcentrifuga da 0,5 mL.
    3. Mescolare delicatamente il tubo e far girare la soluzione.
    4. Avvolgere il coperchio del tubo chiuso con pellicola di paraffina. In alternativa, utilizzare tubi con tappo a vite.
    5. Incubare la provetta in un becher da 500 ml con acqua bollente per 2 minuti, quindi spegnere il riscaldatore e lasciare raffreddare passivamente la temperatura per una notte.
    6. Preparare il 12% nativo PAGE: Miscelare 1 mL di tampone 10х TBE, 3 mL di AA:BA al 40%, acqua deionizzata fino a 10 mL, 50 μL di APS e 5 μL di TEMED (vedere la Tabella dei materiali). Sposta la miscela nella cassetta del gel e lasciala polimerizzare.
    7. Miscelare 1 μl di ciascun campione, ovvero DNM, Dzb-Tile e Tile-arm3 assemblati, con 1 μl di colorante di caricamento 4x e caricarli nel gel.
    8. Inserire la cassetta nella camera, riempirla con 1x tampone TBE e lasciare scorrere il gel per 90 minuti a 80 V.
    9. Colorare il gel con bromuro di etidio e visualizzarlo utilizzando un sistema di documentazione in gel (vedi Tabella dei materiali).
  3. Saggio LOD
    1. Preparare 160 μl di 200 nM F-sub nel tampone di reazione. Questo viene fatto per valutare il fondo di base della stabilità del substrato.
    2. Preparare 7 aliquote da 160 μL di DNM, F-sub e Dza preassemblati a concentrazioni di 20 nM di DNM e Dza e 200 nM di F-sub nel tampone di reazione. Delle sette provette, tenere la provetta #1 come sfondo bianco per valutare l'assemblaggio spontaneo del nucleo del DNAzyme.
    3. Aggiungere l'analita nelle provette #2-7 alle concentrazioni finali di 1 pM, 10 pM, 100 pM, 200 pM, 500 pM e 1000 pM.
    4. Miscelare delicatamente, centrifugare le provette e classificare le soluzioni in tre porzioni da 50 μl in una piastra nera a 96 pozzetti. Sigillare la piastra con una pellicola otticamente trasparente.
    5. Incubare la piastra in bagnomaria a 55 °C per 1 ora. Girare il piatto.
    6. Misurare la fluorescenza a 525 nm (λex = 495 nm). Calcola la media e la deviazione standard per ogni punto.
    7. Calcola il rapporto bianco/base dividendo il segnale del tubo che contiene F-sub e DNM per il segnale del tubo che contiene solo F-sub. Assicurarsi che il rapporto sia compreso tra 1,1 e 1,5.
    8. Calcolare il rapporto segnale/bianco dividendo il segnale della provetta che contiene F-sub, DNM e l'analita per il segnale della provetta che contiene solo F-sub e DNM. Considera il segnale come vero positivo se è superiore alla media di fondo più tre deviazioni standard.
    9. Ripetere l'esperimento due volte e assicurarsi che la deviazione standard tra le ripetizioni analitiche sia inferiore a 0,5.

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Risultati

Lo scopo del primo esperimento era quello di mostrare l'assemblaggio del DNM prima del frammento sintetico dell'analita. Tutti i filamenti DNM costituenti sono stati aggiunti al tampone di reazione e assemblati nel becher. Il complesso DNM assemblato è stato valutato per le sue dimensioni e omogeneità corrette mediante PAGE nativo. La PAGINA nativa mostra il DNM assemblato con l'analita nella corsia 1 e due filamenti DNM nelle corsie 2 e 4. Se la nanomacchina del DNA non fosse assembla...

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Discussione

La progettazione di macchine per DNA è semplice, ma richiede una certa esperienza nella progettazione di sonde di ibridazione o nanostrutture funzionali di DNA. È opportuno mantenere il frammento dell'analita il più corto possibile per ridurre il numero di possibili strutture secondarie e semplificare l'invasione del DNM alla struttura secondaria. Il contenuto di CG dovrebbe essere preferibilmente inferiore al 60% per evitare strutture intramolecolari stabili. Il corretto assemblaggio...

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Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano Ekaterina V. Nikitina per aver gentilmente fornito il gDNA di EBV. Muhannad Ateiah, Maria Y. Berezovskaya e Maria S. Rubel ringraziano il Ministero dell'Istruzione e della Scienza della Federazione Russa (sovvenzione n. FSER-2022-0009) e il programma Priority 2030.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL tubeBiofilCFT011015
100 bp+ DNA LadderEvrogenNL002
100-1000 µL pipetteKirgenKG-Pro1000
10-100 µL pipetteKirgenKG-Pro100
1-10 µL pipetteKirgenKG-Pro10
20-200 µL pipetteKirgenKG-Pro200
2-20 µL pipetteKirgenKG-Pro20
4x Gel Loading DyeEvrogenPB020
Acrylamide 4KAppliChemA1090,0500
Ammonium persulfateCarl Roth2809447
BiorenderBiorenderhttps://www.biorender.com
BisacrylamideMolekula22797959
Boric AcidTechSnabH-0202
ChemiDoc imaging systemBioRad12003153
Costar 96-Well Black Polystyrene PlateCorningCOS3915
DinaMeltRNA Institutehttp://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php
EDTAAmrescoAm-O105
Ethidium bromideBioLabMixEtBr-10
HEPESAmrescoAm-O485
Magnesium chlorideAppliChem131396
Mini Protean Tetra CellBioRad1658001EDU
pipette 10 µL tipsKirgenKG1111-L
pipette 1000 µL tipsKirgenKG1636
pipette 200 µL tipsKirgenKG1212-L
Pixelmator ProPixelmator Teamhttps://www.pixelmator.com/pro/
Potassium chlorideCarl Roth1782751
PowerPac Basic Power SupplyBioRad1645050
RNAse/DNAse free waterInvitrogen10977049
Sealing film for PCR platesSovtechP-502
Sodium chlorideVektonHCh (0,1)
Spark multimode microplate readerTecanSpark- 10M
T100 amplificatorBioRad10014822
TEMEDMolekula68604730
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneAmrescoAm-O497
UNAFoldRNA Institutehttp://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php
Water bathLOIPLB-140
Oligos used
Analyte:Evrogendirect order, standard desalting purification
GAGCACTTGGTCAGGCACACGG
ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG
TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG
GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG
CGGACTACGCCTTCGTTGC
Tile-Arm3:Evrogendirect order, standard desalting purification
CCG GGCTGCTGTGCCATTTT
TTGCTGACTACTGTCACCTCT
CTGCTAGTCT
Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG
TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC
CGCTGACCACAACGAGAGGAA
ACCTT		Evrogendirect order, standard desalting purification
Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT
GTCCGTGTGCCTGACCA		Evrogendirect order, standard desalting purification
F-sub oligonucleotide: AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU
CCCTGGGCA-BHQ1		DNA-Syntezdirect order, HPLC purification

Riferimenti

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