Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ננו-מכונות מבוססות DNAzyme יכולות לשמש לזיהוי סלקטיבי ורגיש ביותר של חומצות גרעין. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט לתכנון ננו-מכונות מבוססות DNAzyme עם ליבה של 10-23 המשתמשות בתוכנה חופשית ויישומן בזיהוי מקטע וירוס אפשטיין-בר כדוגמה.

Abstract

ננו-מכונות מבוססות DNAzyme (DNM) לזיהוי רצפי DNA ו-RNA (אנליטים) הם מבנים רב-תכליתיים העשויים מאוליגונוקלאוטידים. תפקידיהם כוללים קשירת אנליטים הדוקה, זיהוי אנליטי סלקטיבי ביותר, הגברת אות פלואורסצנטי על ידי שסעים קטליטיים מרובים של מצע כתב פלואורוגני, ומשיכה של מצע פלואורוגני להגברת תגובת החיישן. יחידות פונקציונליות מחוברות לפיגום DNA משותף לצורך פעולתן המשותפת. 10-23 DNMs החותכים RNA מתאפיינים ברגישות משופרת בהשוואה לבדיקות הכלאה לא קטליטיות. יציבות הדנ"מ והסיכוי המוגבר לזיהוי המצע מסופקים על ידי מקטע דנ"א דו-גדילי, אריח. DNM יכול להבדיל בין שני אנליטים עם הבדל נוקלאוטיד יחיד ב-RNA מקופל ובדנ"א דו-גדילי ולזהות אנליטים בריכוזים ~1000 נמוכים פי 1000 מבדיקות הכלאה אחרות ללא חלבון. מאמר זה מציג את הרעיון מאחורי הפוטנציאל האבחנתי של פעילות DNA-nanomachine וסוקר תכנון, הרכבה ויישום של DNM במבחני זיהוי חומצות גרעין.

Introduction

אחת השיטות המוקדמות ביותר לזיהוי חומצות גרעין היא קשירה משלימה של אוליגונוקלאוטידים סלקטיביים לרצפי RNA או DNA שנותחו. שיטה זו משתמשת במקטעי חומצות גרעין (גשושים) שיכולים ליצור זוגות בסיס ווטסון-קריק עם DNA ממוקד או RNA אנליטי1. לאחר מכן הקומפלקס נבדל מן האנליט והגשושית הבלתי קשורה על ידי מגוון טכניקות. שיטות מסוימות, כגון כתם צפוני, הכלאה באתרו , או qPCR, מבוססות על תופעת הקשירה המשלימה2. לגשושיות ההכלאה הנפוצות ביותר יש שני חסרונות משמעותיים: רגישות נמוכה (הן יכולות להגיע לרמות מיקרומולאריות עד ננומולריות) וכן סלקטיביות נמוכה לווריאציות של נוקלאוטידים בודדים (SNV), כולל מוטציות נקודתיות. הנושא דורש גישה מתוחכמת, שכן הפתרונות לחסרונות אלה מתנגשים זה בזה3. כדי לספק את הסלקטיביות הטובה ביותר, האוליגונוקלאוטיד המזהה צריך להישמר קצר מספיק כדי ליצור היברידים לא יציבים עם אנליטים לא תואמים. אוליגונוקלאוטידים קצרים כאלה אינם מסוגלים לקשור חומצות גרעין ממוקדות בחוזקה ולהרפות את המבנים המשניים שלהן, ולכן לעתים קרובות אינם מצליחים לספק אות הניתן לזיהוי. זה מאתגר במיוחד לזהות מקטעים עשירים ב-CG ב-RNA ביולוגי, או DNA דו-גדילי (dsDNA). מצד שני, בדיקות ארוכות אינן רגישות ל- SNV3. כדי לשבור את הקיפאון, הרעיון של בדיקה בינארית פותח4.

חיישנים בינאריים מפצלים גשושית גילוי אחת לשני חלקים ומתמחים במקטעים שלה, ושומרים על אחד מהם זמן רב כדי לשחרר את סיכות השיער או לפלוש ל-dsDNA. מקטע הגשושית הבינארי השני נשאר קצר כדי להיות רגיש לבסיס לא תואם, ובכך מספק אמצעי לגילוי SNV. האות יופק אם שני חלקי החיישן הבינארי מחוברים יחד4. ניתן להמחיש את הקומפלקס המלא באמצעות FRET5, בדיקת משואות מולקולרית 6,7, או G-quadruplexes עם פעילות דמוית פרוקסידז 8,9,10, או אחרת DNAzyme 11,12,13 RNA. חיישנים בינאריים עם ליבת DNAzyme 10-23 תוארו היטב. הם הותאמו לאיתור שברי חומצות גרעין חד-גדיליות שנוצרו באופן סינתטי11, או תוצרי הגברה חד-גדיליים 14,15. גילוי ללא הגברה אפשרי גם, למשל, במקרה של 16S rRNA המופק מתרבית תאים, שכן מולקולה זו נמצאת בשפע בתאים12,16. חיישנים בינאריים עם ליבת DNAzyme 10-23 יכולים להיות מותאמים גם לזיהוי חומצות שאינן גרעיניות, כגון עבור יוני עופרת17. עם זאת, רגישות נמוכה עדיין נחשבת לאחד החסרונות העיקריים של חיישני DNAzyme בינאריים 10-23, וגישות שונות, כולל מפלים18 או שיטות חלופיות לשיפור אותות19, פותחו כדי לטפל בבעיה זו. למרבה הצער, הטכניקות הנ"ל מגדילות באופן דרסטי את העלות וחוסר היציבות של רכיבי החיישן, ולכן הן לא נכנסו לפרקטיקה.

הניסוי המתואר בעבודה זו משתמש ב-10-23 ננו-חיישנים מבוססי DNAzyme המכונים DNA-nanomachines (DNM)20,21. המבנים האלה כוללים חיישנים בינאריים וגם (1) מנחי דנ"א שמאגפים את הגשושית הבינארית, משחררים את האזורים המובנים ופולשים לדנ"א דו-גדילי, ו-(2) אריח דנ"א שמחזיק את כל חלקי הדנ"א יחד בסמיכות ומגדיל את הסיכוי להיווצרות אותות (איור 1). בסך הכל, 10-23 DNM מבוססי DNAzyme מפחיתים את גבול הגילוי (LOD) עד לטווח הפיקומולרי21; הם יכולים לשמש כדי לזהות 16rRNA בתא lysates22 או לדווח על נוכחות של RNA נגיפי ללא הגברה 23,24. יחד עם זאת, הדנ"מ נשאר רגיש ל-SNV ואף יכול לשמש לגנוטיפ אללים באורגניזמים הטרוזיגוטיים25. שיטת DNM יכולה לשמש כטכניקה משלימה לכל סוג הגברה להדמיית המוצר או זיהוי המוצר בתערובת מורכבת עם סלקטיביות גבוהה. ה- DNMs, שלא כמו בדיקות TaqMan ומשואות קונבנציונליות, אינם דורשים חימום של הדגימה ולכן ניתן להשתמש בהם בפרוטוקולי זיהוי נקודות קצה, מה שהופך את הזיהוי הכולל לחסכוני.

מאמר זה מתאר את הפיתוח בסיליקו של DNM ומדגים נהלים להרכבה ואפיון פונקציונלי של DNM. העבודה בוצעה באמצעות מקטע סינתטי של וירוס אפשטיין-בר (EBV) המתאים למיקומים 13972-14154 של הדנ"א הנגיפי (OR652423.1) (ראה טבלת חומרים).

Protocol

1. תכנון DNM

  1. בחר אזור ייחודי בתוך הגנום המעניין.
    הערה: עבודה זו משתמשת באזור בגנום של וירוס אפשטיין-בר (EBV) במיקומים 13972-14154 (OR652423.1).
  2. צור ערכת פריימר להגברה של המקטע שנבחר, לדוגמה, באמצעות הכלי Primer3 המוטבע ב- Ugene26.
  3. פתח את כלי האינטרנט UNAFold27 (ראה רשימת חומרים) והוסף את האזור שנבחר. שנו את טמפרטורת הקיפול ל-55°C, ואת התנאים היוניים ל-250 מילימול של יונים חד-ערכיים, ו-200 מילימול של Mg2+.
    1. פתח את המבנה המשני המתקבל של מקטע ssDNA ובחר סיכת שיער יציבה. אתר את אתר הקישור של ננו-מכונות הדנ"א באזורים הבלתי מובנים או, לחילופין, על הלולאות של מבני סיכות הראש כדי להשיג קשירה חזקה יותר של המטרה.
  4. אם אתר האנליטה הממוקד מקופל במבנה של לולאת גזע, מקם את זרוע 1 ו-2 באופן הבא: ודא שזרוע 2 קושרת צד אחד של הגבעול, הלולאה ו-3-5 nt של צד הגבעול השני; זרוע 1 קושרת שבר של צד הגבעול השני.
  5. פתח את הכלי DinaMelt28 (ראה טבלת חומרים) ונתח את רצפי הזרועות ואת רצפי המשלים ההפוכים שלהן. השתמש בכלי DinaMelt כדי לוודא שה- Tm של זרועות 2 ו- 3 הוא מעל 65 ° C: לפחות 10 ° C מעל טמפרטורת הבדיקה (55 ° C).
    1. שמור על Tm של זרוע 1 לפחות 1-3 ° C מעל טמפרטורת התגובה (55 ° C) אם סלקטיביות זיהוי גבוהה תושג29.
  6. שלבו רצפי זרועות 1 ו-2 עם חצאי ליבת ה-DNAzyme ומקטעי הקישור F-sub13.
  7. נתח את המבנה המשני של גדילי הדנ"א המתוכננים באמצעות UNAFold27.
    הערה: 55°C (טמפרטורת בדיקה), 200 mM Mg2+, 250 mM יונים חד-ערכיים (HEPES, Na+, K+).
    1. השתמש בעיצוב רק אם ΔG המתקפל נמוך מ - 4 קק"ל / מול. נסו להימנע מרצפים ארוכים עשירים ב-CG. אם המבנה המשני יציב מדי, הציגו מוטציה לזרוע כדי להגדיל את ΔG30 המתקפל. לחלופין, הצבת זרוע 3 2-3 nt הרחק מזרוע 2 היא אסטרטגיה נוספת לשינוי רצף זרוע 3 כדי למנוע מבנים בין-מולקולריים יציבים.
  8. צור רצף אקראי למקטע אריח DNA ארוך כמו זרוע 3. שלב את רצף Arm 3 עם רצף אריחי DNA באמצעות (dT)4-6 או אתילן גליקול (למשל, טריאתילן גליקול (TEG) או הקסאתילן גליקול (HEG)). גרסת ה-DNM שהוצגה בניסוי משתמשת ב-(dT)6.
  9. קשר את זרוע 2 עם הרצף המשלים למקטע אריח ה- DNA שנבחר בשלב 1.8 באמצעות מקשר.
  10. נתח את המבנה המשני של גדילי ה- DNA המעוצבים באמצעות אפליקציית האינטרנט UNAFold. ודא שאנרגיית הקיפול של כל גדיל DNA היא מעל 4 kJ/mol ב- 55 ° C, והימנע מרצפים ארוכים מועשרים ב- CG. רצוי, לשנות את רצף אריחי ה- DNA.
  11. צייר את המבנה באמצעות כל תוכנת גרפיקה וקטורית זמינה. מאמר זה משתמש ב- Biorender וב- Pixelmator Pro לתצוגה חזותית (ראה טבלת חומרים). ודא את הדיוק בכיוונים 5'->3' עבור כל גדיל.
    הערה: השג את הרצפים מספק מסחרי אמין.

2. בדיקה פונקציונלית של ה- DNM

  1. הכנת חיץ וריאגנטים
    1. הכן את מאגר התגובה המורכב מ- 50 mM HEPES (pH 7.5-7.8), 50 mM NaCl, 150 mM KCl ו- 200 mM MgCl2. ממלאים במים נטולי יונים, עד 50 מ"ל.
    2. הכן 10 מיקרומטר aliquots של Dzb-Tile ו Tile-Arm3 oligonucleotides. הכן תמיסת 1 מיקרומטר של Dza, 100 מיקרומטר F-sub, ו 1 ננומטר, 10 ננומטר, 100 ננומטר אנליטים ב RNase / מים חופשיים או מים סטריליים deionized. הפרטים של רצפי האוליגונוקלאוטידים מופיעים בטבלת החומרים.
  2. הרכבת DNM
    1. הפשירו לחלוטין את תמיסות האוליגונוקלאוטיד לפני השימוש. ערבבו בעדינות על ידי הקשה (אין לערבל באופן אינטנסיבי). סובב למטה (במהירות, למספר שניות) את הפתרון באמצעות מיקרוצנטריפוגה.
    2. ערבב 1 מיקרומטר כל אחד של Dzb-Tile ו- Tile-Arm3 ב- 200 μL של מאגר התגובה בצינורות מיקרוצנטריפוגות של 0.5 מ"ל.
    3. מערבבים את הצינור בעדינות ומסובבים את התמיסה.
    4. עוטפים את מכסה הצינור הסגור בסרט פרפין. לחלופין, השתמש בצינורות מכסה בורג.
    5. דוגרים על הצינור לתוך 500 מ"ל עם מים רותחים למשך 2 דקות, ואז מכבים את תנור החימום ונותנים לטמפרטורה להתקרר באופן פסיבי למשך הלילה.
    6. הכינו את 12% ה-PAGE המקורי: ערבבו 1 מ"ל של 10х TBE buffer, 3 מ"ל של 40% AA:BA, מים נטולי יונים, עד 10 מ"ל, 50 μL של APS ו-5 μL של TEMED (ראו טבלת חומרים). מעבירים את התערובת לקסטת הג'ל ונותנים לה להתפלמר.
    7. מערבבים 1 μL של כל דגימה, כלומר, DNM מורכב, Dzb-Tile, ו Tile-arm3, עם 1 μL של 4x טעינת צבע לטעון אותם לתוך ג'ל.
    8. הכניסו את הקלטת לתא, מלאו אותה במאגר TBE 1x ותנו לג'ל לפעול במשך 90 דקות במתח של 80 וולט.
    9. צבעו את הג'ל עם אתידיום ברומיד ודמיינו אותו באמצעות מערכת תיעוד ג'ל (ראו טבלת חומרים).
  3. בדיקת לוד
    1. הכן 160 μL של 200 ננומטר F-sub במאגר התגובה. זה נעשה כדי להעריך את הרקע הבסיסי של יציבות המצע.
    2. הכינו 7 אליציטוטים של 160 מיקרוליטר של DNM, F-sub ו-Dza שהורכבו מראש בריכוזים של 20 ננומטר של DNM ו-Dza ו-200 ננומטר של F-sub במאגר התגובה. מתוך שבעת הצינורות, שמור על צינור #1 כרקע ריק כדי להעריך את ההרכבה הספונטנית של ליבת DNAzyme.
    3. הוסף את האנליט לתוך צינורות #2-7 בריכוזים הסופיים של 1 pM, 10 pM, 100 pM, 200 pM, 500 pM ו 1000 pM.
    4. מערבבים בעדינות, מסובבים את הצינורות, ומסווגים את התמיסות לשלושה חלקים של 50 מיקרוליטר לצלחת שחורה של 96 בארות. אטמו את הצלחת בסרט אופטי שקוף.
    5. לדגור את הצלחת באמבט מים ב 55 ° C במשך 1 שעות. סובבו את הצלחת.
    6. מדוד פלואורסצנטיות ב- 525 ננומטר (λex = 495 ננומטר). חישוב הממוצע וסטיית התקן עבור כל נקודה.
    7. חשב את היחס הריק לבסיסי על ידי חלוקת האות של הצינור המכיל F-sub ו- DNM באות של הצינור המכיל F-sub בלבד. ודא שהיחס נמצא בטווח של 1.1-1.5.
    8. חשב את יחס האות לריק על-ידי חלוקת האות של הצינור המכיל F-sub, DNM והאנליט לאות של הצינור המכיל F-sub ו- DNM בלבד. שקול את האות כחיובי אמיתי אם הוא גבוה מממוצע הרקע בתוספת שלוש סטיות תקן.
    9. חזרו על הניסוי פעמיים וודאו שסטיית התקן בין החזרות האנליטיות קטנה מ-0.5.

תוצאות

מטרת הניסוי הראשון הייתה להראות את הרכבת הדנ"מ לפני המקטע הסינתטי של האנליט. כל גדילי ה-DNM המרכיבים נוספו למאגר התגובה והורכבו בכד. קומפלקס ה- DNM שהורכב הוערך עבור גודלו הנכון וההומוגניות שלו על ידי דף מקורי. דף מקורי מציג את ה-DNM שהורכב עם האנליט בנתיב 1 ושני גדילי DNM בנתיבי?...

Discussion

התכנון של מכונות DNA הוא פשוט, אך דורש ניסיון מסוים בתכנון בדיקות הכלאה או ננו-מבנים פונקציונליים של DNA. ראוי לשמור על קטע אנליטי קצר ככל האפשר כדי להפחית את מספר המבנים המשניים האפשריים ולפשט את פלישת ה- DNM למבנה המשני. תכולת CG צריכה להיות מתחת ל -60% כדי למנוע מבנים תוך-מולקו?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות ליקטרינה ו. ניקיטינה על מתן gDNA של EBV. Muhannad Ateiah, Maria Y. Berezovskaya, ומריה ס 'רובל מודים למשרד החינוך והמדע של הפדרציה הרוסית (מענק No FSER-2022-0009) ואת תוכנית עדיפות 2030.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL tubeBiofilCFT011015
100 bp+ DNA LadderEvrogenNL002
100-1000 µL pipetteKirgenKG-Pro1000
10-100 µL pipetteKirgenKG-Pro100
1-10 µL pipetteKirgenKG-Pro10
20-200 µL pipetteKirgenKG-Pro200
2-20 µL pipetteKirgenKG-Pro20
4x Gel Loading DyeEvrogenPB020
Acrylamide 4KAppliChemA1090,0500
Ammonium persulfateCarl Roth2809447
BiorenderBiorenderhttps://www.biorender.com
BisacrylamideMolekula22797959
Boric AcidTechSnabH-0202
ChemiDoc imaging systemBioRad12003153
Costar 96-Well Black Polystyrene PlateCorningCOS3915
DinaMeltRNA Institutehttp://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php
EDTAAmrescoAm-O105
Ethidium bromideBioLabMixEtBr-10
HEPESAmrescoAm-O485
Magnesium chlorideAppliChem131396
Mini Protean Tetra CellBioRad1658001EDU
pipette 10 µL tipsKirgenKG1111-L
pipette 1000 µL tipsKirgenKG1636
pipette 200 µL tipsKirgenKG1212-L
Pixelmator ProPixelmator Teamhttps://www.pixelmator.com/pro/
Potassium chlorideCarl Roth1782751
PowerPac Basic Power SupplyBioRad1645050
RNAse/DNAse free waterInvitrogen10977049
Sealing film for PCR platesSovtechP-502
Sodium chlorideVektonHCh (0,1)
Spark multimode microplate readerTecanSpark- 10M
T100 amplificatorBioRad10014822
TEMEDMolekula68604730
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneAmrescoAm-O497
UNAFoldRNA Institutehttp://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php
Water bathLOIPLB-140
Oligos used
Analyte:Evrogendirect order, standard desalting purification
GAGCACTTGGTCAGGCACACGG
ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG
TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG
GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG
CGGACTACGCCTTCGTTGC
Tile-Arm3:Evrogendirect order, standard desalting purification
CCG GGCTGCTGTGCCATTTT
TTGCTGACTACTGTCACCTCT
CTGCTAGTCT
Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG
TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC
CGCTGACCACAACGAGAGGAA
ACCTT		Evrogendirect order, standard desalting purification
Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT
GTCCGTGTGCCTGACCA		Evrogendirect order, standard desalting purification
F-sub oligonucleotide: AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU
CCCTGGGCA-BHQ1		DNA-Syntezdirect order, HPLC purification

References

  1. Kolpashchikov, D. M. Evolution of hybridization probes to DNA machines and robots. Acc. Chem Res. 52, 1949-1956 (2019).
  2. Guo, J., Ju, J., Turro, N. J. Fluorescent hybridization probes for nucleic acid detection. Anal. Bioanal Chem. 402, 3115-3125 (2012).
  3. Demidov, V. V., Frank-Kamenetskii, M. D. Two sides of the coin: affinity and specificity of nucleic acid interactions. Tr Bioche Sc. 29 (2), 62-71 (2004).
  4. Kolpashchikov, D. M. Binary probes for nucleic acid analysis. Chem Rev. 110, 4709-4723 (2010).
  5. Marti, A. A., Jockusch, S., Stevens, N., Ju, J., Turro, N. J. Fluorescent hybridization probes for sensitive and selective DNA and RNA detection. Acc Chem Res. 40 (6), 402-409 (2007).
  6. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Detection of bacterial 16S rRNA using a molecular beacon-based X sensor. Biosens.Bioelectron. 41, 386-390 (2013).
  7. Dark, P., et al. Accuracy of LightCycler Septi Fast for the detection and identification of pathogens in the blood of patients with suspected sepsis: a systematic review and meta-analysis. Intensive Care Med. 41, 21-33 (2015).
  8. Maltzeva, Y. I., Gorbenko, D. A., Nikitina, E. V., Rubel, M. S., Kolpashchikov, D. M. Visual Detection of Stem-Loop Primer Amplification (SPA) products without denaturation using peroxidase-like DNA machines (PxDM). Int J Mol Sc. 24 (9), 7812 (2023).
  9. Gorbenko, D. A., et al. DNA nanomachine for visual detection of structured RNA and double stranded DNA. Chem Comm. 58 (35), 5395-5398 (2022).
  10. Roembke, B. T., Nakayama, S., Sintim, H. O. Nucleic acid detection using G-quadruplex amplification methodologies. Methods. 64 (3), 185-198 (2013).
  11. Mokany, E., Bone, S. M., Young, P. E., Doan, T. B., Todd, A. V. MNAzymes, a versatile new class of nucleic acid enzymes that can function as biosensors and molecular switches. JACS. 132 (3), 1051-1059 (2010).
  12. Gerasimova, Y. V., Cornett, E., Kolpashchikov, D. M. RNA cleaving deoxyribozyme sensor for nucleic acid analysis: the limit of detection. Chem Bio Chem. 11, 811-817 (2010).
  13. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Folding 16S RNA in a signal-producing structure for detection of bacteria. Angew Chem Int Ed. 52, 10586-10588 (2013).
  14. Hu, M., et al. Allosteric DNAzyme-based encoder for molecular information transfer. Chin. Chem Let. , 109232 (2023).
  15. Peeters, B., et al. Solid-phase PCR-amplified DNAzyme activity for real-time FO-SPR detection of the MCR-2 gene. Anal Chem. 92 (15), 10783-10791 (2020).
  16. Wood, H. N., et al. Species typing of nontuberculous Mycobacteria by use of deoxyribozyme sensors. Clin Chem. 65 (2), 333-341 (2019).
  17. Yan, T., et al. Ultralow background one-pot detection of Lead (II) using a non-enzymatic double-cycle system mediated by a hairpin-involved DNAzyme. Biosen Bioelectron. 237, 115534 (2023).
  18. Hasick, N. J., Radhika, R., Todd, A. V. Subzymes: Regulating DNAzymes for point of care nucleic acid sensing. Sens. Act. B: Chem. 297, 126704 (2019).
  19. Safdar, S., et al. DNA-only, microwell-based bioassay for multiplex nucleic acid detection with single base-pair resolution using MNAzymes. Biosen Bioelectron. 152, 112017 (2020).
  20. Cox, A. J., Bengtson, H. N., Gerasimova, Y. V., Rohde, K. H., Kolpashchikov, D. M. DNA antenna tile-associated deoxyribozyme sensor with improved sensitivity. Chem Bio Chem. 17 (21), 2038-2041 (2016).
  21. Lyalina, T. A., Goncharova, E. A., Prokofeva, N. Y., Voroshilina, E. S., Kolpashchikov, D. M. A DNA minimachine for selective and sensitive detection of DNA. Analyst. 144 (2), 416-420 (2019).
  22. Ateiah, M., Gandalipov, E. R., Rubel, A. A., Rubel, M. S., Kolpashchikov, D. M. DNA Nanomachine (DNM) Biplex Assay for Differentiating Bacillus cereus Species. Int J Mol Sc. 24 (5), 4473 (2023).
  23. El-Deeb, A. A., et al. Toward a home test for COVID-19 diagnosis: DNA machine for amplification-free SARS-CoV-2 detection in clinical samples. Chem Med Chem. 17 (20), 202200382 (2022).
  24. Kirichenko, A., Bryushkova, E., Dedkov, V., Dolgova, A. A Novel DNAzyme-based fluorescent biosensor for detection of RNA-containing Nipah henipavirus. Biosensors. 13 (2), 252 (2023).
  25. Akhmetova, M. M., Rubel, M. S., Afanasenko, O. S., Kolpashchikov, D. M. Barley haplotyping using biplex deoxyribozyme nanomachine. Sens Act Rep. 4, 100132 (2022).
  26. Okonechnikov, K., et al. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics. 28, 1166-1167 (2012).
  27. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
  28. Markham, N. R., Zuker, M. DINAMelt web server for nucleic acid melting prediction. Nucleic Acids Res. 33, W577-W581 (2005).
  29. Stancescu, M., Fedotova, T. A., Hooyberghs, J., Balaeff, A., Kolpashchikov, D. M. Nonequilibrium hybridization enables discrimination of a point mutation within 5-40 C. JACS. 138 (41), 13465-13468 (2016).
  30. Dong, J., Ouyang, Y., Wang, J., O'Hagan, M. P., Willner, I. Assembly of dynamic gated and cascaded transient DNAzyme networks. ACS Nano. 16 (4), 6153-6164 (2022).
  31. Montserrat Pagès, A., Hertog, M., Nicolaï, B., Spasic, D., Lammertyn, J. Unraveling the kinetics of the 10-23 RNA-cleaving DNAzyme. Int J Mol Sc. 24 (18), 13686 (2023).
  32. Nguyen, C., Grimes, J., Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Molecular-beacon-based tricomponent probe for SNP analysis in folded nucleic acids. Chem-eur J. 17 (46), 13052-13058 (2011).
  33. MacDougall, D., Crummett, W. B. Guidelines for data acquisition and data quality evaluation in environmental chemistry. Anal Chem. 52 (14), 2242-2249 (1980).
  34. Gerasimova, Y. V., Yakovchuk, P., Dedkova, L. M., Hecht, S. M., Kolpashchikov, D. M. Expedited quantification of genetically modified ribosomal RNA by binary deoxyribozyme sensors. RNA. 10, 1834-1843 (2015).
  35. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Folding 16S RNA in a signal-producing structure for detection of bacteria. Angew Chem Int Ed. 52, 10586-10588 (2013).
  36. . GC Content Calculator Available from: https://www.biologicscorp.com/tools/GCContent/#.ZEfxPiyOHYU (2023)
  37. Hussein, Z., et al. DNAzyme nanomachine with fluorogenic substrate delivery function: advancing sensitivity in nucleic acid detection. Anal Chem. 95 (51), 18667-18672 (2023).
  38. Safdar, S., et al. DNA-only, microwell-based bioassay for multiplex nucleic acid detection with single base-pair resolution using MNAzymes. Biosen Bioelectron. 152, 112017 (2020).
  39. Gerasimova, Y. V., et al. Deoxyribozyme cascade for visual detection of bacterial RNA. Chem Bio Chem. 14, 2087-2090 (2013).
  40. Eckert, K. A., Kunkel, T. A. DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction. Gen Res. 1 (1), 17-24 (1991).
  41. Pandya, K., Jagani, D., Singh, N. CRISPR-Cas systems: Programmable nuclease revolutionizing the molecular diagnosis. Mol Biotech. , (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

DNA10 23 DNAzymeRNA DNADNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved