DNAzyme 10-23 - 핵산 인식을 위한 기반 나노머신

요약

DNAzyme 기반 나노머신은 핵산의 매우 선택적이고 민감한 검출에 사용할 수 있습니다. 이 기사에서는 무료 소프트웨어를 사용하여 10-23 코어를 가진 DNAzyme 기반 나노머신을 설계하기 위한 자세한 프로토콜과 Epstein-Barr 바이러스 단편 검출에 대한 응용 프로그램에 대해 설명합니다.

초록

DNA 및 RNA 염기서열(분석물) 검출을 위한 DNAzyme 기반 나노머신(DNM)은 올리고뉴클레오티드로 만들어진 다기능 구조입니다. 이들의 기능에는 긴밀한 분석물 결합, 고도로 선택적인 분석물 인식, 형광 리포터 기판의 다중 촉매 절단에 의한 형광 신호 증폭, 센서 응답 증가를 위한 형광 기판 인력이 포함됩니다. 기능 단위는 협력 작용을 위해 공통 DNA 지지체에 부착됩니다. RNA 절단 10-23 DNM은 비촉매 혼성화 프로브에 비해 감도가 향상되었습니다. DNM의 안정성과 기질 인식의 증가된 기회는 이중 가닥 DNA 단편인 타일에 의해 제공됩니다. DNM은 접힌 RNA와 이중 가닥 DNA에서 단일 뉴클레오티드 차이로 두 개의 분석물을 구별할 수 있으며 다른 단백질이 없는 혼성화 프로브보다 ~1000배 낮은 농도의 분석물을 검출할 수 있습니다. 이 기사에서는 DNA-nanomachine 활성의 진단 잠재력에 대한 개념을 제시하고 핵산 검출 분석에서 DNM 설계, 조립 및 응용 분야에 대해 간략하게 설명합니다.

서문

핵산 검출을 위한 가장 초기의 방법 중 하나는 분석된 RNA 또는 DNA 염기서열에 대한 선택적 올리고뉴클레오티드의 상보적 결합입니다. 이 방법은 표적 DNA 또는 RNA 분석물¹과 Watson-Crick 염기쌍을 형성할 수 있는 핵산 단편(프로브)을 사용합니다. 그런 다음 복합체는 다양한 기법으로 분석물 및 결합되지 않은 프로브와 구별됩니다. Northern blotting, in situ hybridization 또는 qPCR과 같은 특정 방법은 complementary binding² 현상을 기반으로 합니다. 가장 일반적인 hybridization probe에는 두 가지 중요한 단점이 있습니다: 낮은 감도(마이크로몰에서 나노몰 수준에 도달할 수 있음)와 점 돌연변이를 포함한 단일 뉴클레오티드 변이(SNV)에 대한 낮은 선택성. 이 문제는 이러한 단점에 대한 해결책이 서로 충돌하기 때문에 정교한 접근 방식이 필요합니다³. 최상의 선택성을 제공하기 위해, 검출 올리고뉴클레오티드는 일치하지 않는 분석물질과 불안정한 하이브리드를 형성할 수 있을 만큼 충분히 짧게 유지되어야 합니다. 이러한 짧....

프로토콜

1. DNM 설계

1. 관심 게놈 내에서 고유한 영역을 선택합니다.
   참고: 이 작업은 위치 13972-14154(OR652423.1)의 엡스타인-바 바이러스(EBV) 게놈 영역을 사용합니다.
2. 예를 들어 Ugene²⁶에 내장된 Primer3 도구를 통해 선택한 단편의 증폭을 위한 프라이머 세트를 생성합니다.
3. UNAFold 웹 도구²⁷ ( 재료 표 참조)을 열고 선택한 영역을 삽입합니다. 접힘 온도를 55°C로, 이온 조건을 250mM의 1가 이온, 200mM의 Mg²⁺로 변경합니다.
   1. 생성된 ssDNA 단편의 2차 구조를 열고 안정적인 헤어핀을 선택합니다. DNA-나노머신의 결합 부위를 구조화되지 않은 영역 또는 헤어핀 구조의 루프에 위치시켜 표적의 더 강력한 결합을 달성합니다.
4. 표적 분석물 부위가 스템 루프 구조로 접혀 있는 경우 Arm 1과 2를 다음과 같이 배치합니다: Arm 2가 스템의 한쪽 면, 루프 및 두 번째 스템 면의 3-5nt와 결합하는....

토론

DNA 기계의 설계는 간단하지만 혼성화 프로브 또는 기능적 DNA 나노 구조를 설계하는 데 약간의 경험이 필요합니다. 분석물 단편을 가능한 한 짧게 유지하여 가능한 2차 구조의 수를 줄이고 2차 구조에 대한 DNM 침습을 단순화하는 것이 적절합니다. CG 함량은 안정적인 분자 내 구조를 피하기 위해 60% 미만인 것이 바람직합니다. DNM의 성공적인 조립은 느린 냉각 속도에서 달성.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tube	Biofil	CFT011015
100 bp+ DNA Ladder	Evrogen	NL002
100-1000 µL pipette	Kirgen	KG-Pro1000
10-100 µL pipette	Kirgen	KG-Pro100
1-10 µL pipette	Kirgen	KG-Pro10
20-200 µL pipette	Kirgen	KG-Pro200
2-20 µL pipette	Kirgen	KG-Pro20
4x Gel Loading Dye	Evrogen	PB020
Acrylamide 4K	AppliChem	A1090,0500
Ammonium persulfate	Carl Roth	2809447
Biorender	Biorender		https://www.biorender.com
Bisacrylamide	Molekula	22797959
Boric Acid	TechSnab	H-0202
ChemiDoc imaging system	BioRad	12003153
Costar 96-Well Black Polystyrene Plate	Corning	COS3915
DinaMelt	RNA Institute		http://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php
EDTA	Amresco	Am-O105
Ethidium bromide	BioLabMix	EtBr-10
HEPES	Amresco	Am-O485
Magnesium chloride	AppliChem	131396
Mini Protean Tetra Cell	BioRad	1658001EDU
pipette 10 µL tips	Kirgen	KG1111-L
pipette 1000 µL tips	Kirgen	KG1636
pipette 200 µL tips	Kirgen	KG1212-L
Pixelmator Pro	Pixelmator Team		https://www.pixelmator.com/pro/
Potassium chloride	Carl Roth	1782751
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050
RNAse/DNAse free water	Invitrogen	10977049
Sealing film for PCR plates	Sovtech	P-502
Sodium chloride	Vekton	HCh (0,1)
Spark multimode microplate reader	Tecan	Spark- 10M
T100 amplificator	BioRad	10014822
TEMED	Molekula	68604730
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Amresco	Am-O497
UNAFold	RNA Institute		http://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php
Water bath	LOIP	LB-140
Oligos used
Analyte:	Evrogen		direct order, standard desalting purification
GAGCACTTGGTCAGGCACACGG ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG CGGACTACGCCTTCGTTGC
Tile-Arm3:	Evrogen		direct order, standard desalting purification
CCG GGCTGCTGTGCCATTTT TTGCTGACTACTGTCACCTCT CTGCTAGTCT
Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC CGCTGACCACAACGAGAGGAA ACCTT	Evrogen		direct order, standard desalting purification
Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT GTCCGTGTGCCTGACCA	Evrogen		direct order, standard desalting purification
F-sub oligonucleotide: AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU CCCTGGGCA-BHQ1	DNA-Syntez		direct order, HPLC purification