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요약

DNAzyme 기반 나노머신은 핵산의 매우 선택적이고 민감한 검출에 사용할 수 있습니다. 이 기사에서는 무료 소프트웨어를 사용하여 10-23 코어를 가진 DNAzyme 기반 나노머신을 설계하기 위한 자세한 프로토콜과 Epstein-Barr 바이러스 단편 검출에 대한 응용 프로그램에 대해 설명합니다.

초록

DNA 및 RNA 염기서열(분석물) 검출을 위한 DNAzyme 기반 나노머신(DNM)은 올리고뉴클레오티드로 만들어진 다기능 구조입니다. 이들의 기능에는 긴밀한 분석물 결합, 고도로 선택적인 분석물 인식, 형광 리포터 기판의 다중 촉매 절단에 의한 형광 신호 증폭, 센서 응답 증가를 위한 형광 기판 인력이 포함됩니다. 기능 단위는 협력 작용을 위해 공통 DNA 지지체에 부착됩니다. RNA 절단 10-23 DNM은 비촉매 혼성화 프로브에 비해 감도가 향상되었습니다. DNM의 안정성과 기질 인식의 증가된 기회는 이중 가닥 DNA 단편인 타일에 의해 제공됩니다. DNM은 접힌 RNA와 이중 가닥 DNA에서 단일 뉴클레오티드 차이로 두 개의 분석물을 구별할 수 있으며 다른 단백질이 없는 혼성화 프로브보다 ~1000배 낮은 농도의 분석물을 검출할 수 있습니다. 이 기사에서는 DNA-nanomachine 활성의 진단 잠재력에 대한 개념을 제시하고 핵산 검출 분석에서 DNM 설계, 조립 및 응용 분야에 대해 간략하게 설명합니다.

서문

핵산 검출을 위한 가장 초기의 방법 중 하나는 분석된 RNA 또는 DNA 염기서열에 대한 선택적 올리고뉴클레오티드의 상보적 결합입니다. 이 방법은 표적 DNA 또는 RNA 분석물1과 Watson-Crick 염기쌍을 형성할 수 있는 핵산 단편(프로브)을 사용합니다. 그런 다음 복합체는 다양한 기법으로 분석물 및 결합되지 않은 프로브와 구별됩니다. Northern blotting, in situ hybridization 또는 qPCR과 같은 특정 방법은 complementary binding2 현상을 기반으로 합니다. 가장 일반적인 hybridization probe에는 두 가지 중요한 단점이 있습니다: 낮은 감도(마이크로몰에서 나노몰 수준에 도달할 수 있음)와 점 돌연변이를 포함한 단일 뉴클레오티드 변이(SNV)에 대한 낮은 선택성. 이 문제는 이러한 단점에 대한 해결책이 서로 충돌하기 때문에 정교한 접근 방식이 필요합니다3. 최상의 선택성을 제공하기 위해, 검출 올리고뉴클레오티드는 일치하지 않는 분석물질과 불안정한 하이브리드를 형성할 수 있을 만큼 충분히 짧게 유지되어야 합니다. 이러한 짧은 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산을 단단히 결합하고 이들의 2차 구조를 풀어줄 수 없기 때문에 종종 검출 가능한 신호를 제공하지 못합니다. 생물학적 RNA 또는 이중 가닥 DNA(dsDNA)에서 CG가 풍부한 단편을 검출하는 것은 특히 어렵습니다. 반면에 긴 프로브는 SNV3에 둔감합니다. 교착 상태를 깨기 위해 바이너리 프로브의 개념이 개발되었습니다4.

바이너리 센서는 단일 검출 프로브를 두 조각으로 분할하고 그 조각을 전문화하여 그 중 하나가 헤어핀을 풀거나 dsDNA에 침입할 수 있도록 길게 유지합니다. 두 번째 바이너리 프로브 단편은 미스매치 염기에 민감하도록 짧게 유지되므로 SNV를 검출하기 위한 수단을 제공합니다. 두 개의 이진 센서 부품이 함께 결합되면 신호가 생성됩니다4. 전체 복합체는 FRET5, 분자 비콘 프로브 6,7 또는 과산화효소 유사 활성이 8,9,10인 G-quadruplexes 또는 RNA 절단 11,12,13 DNAzyme을 통해 시각화할 수 있습니다. 10-23 DNAzyme 코어가 있는 바이너리 센서에 대해 충분히 설명되었습니다. 이들은 합성적으로 생성된 단일-가닥 핵산 단편(11) 또는 단일-가닥 증폭 산물(14,15)을 검출하도록 조정되었다. 예를 들어, 세포 배양에서 추출된 16S rRNA의 경우, 이 분자가 세포(12,16)에 풍부하기 때문에 증폭 없는 검출도 가능합니다. 10-23 DNAzyme 코어가 있는 Binary 센서는 납 이온17과 같은 비핵산 검출에도 적용할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 낮은 감도는 여전히 바이너리 10-23 DNAzyme 센서의 주요 단점 중 하나로 간주되고 있으며, 이 문제를 해결하기 위해 캐스케이드(cascades)18 또는 대체 신호 향상 방법(alternative signal-enhancing methods)19을 포함한 다양한 접근법이 개발되었다. 불행히도 위의 기술은 센서 구성 요소의 비용과 불안정성을 크게 증가시켜 실용화되지 않았습니다.

이 연구에서 설명 된 실험은 DNA-nanomachines (DNM) 20,21이라고하는 10-23 개의 DNA 효소 기반 DNA-nanosensor를 사용합니다. 이러한 구조에는 바이너리 센서와 (1) 바이너리 프로브 측면에 위치하여 구조화된 영역을 풀고 이중 가닥 DNA로 침입하는 DNA 촉진자, (2) 모든 DNM 부품을 근접하게 유지하고 신호 형성 가능성을 높이는 DNA 타일이 포함됩니다(그림 1). 전체적으로, 10-23개의 DNAzyme-based DNM은 검출 한계(LOD)를 피코몰 범위(21)까지 감소시킵니다. 이들은 세포 용해물22에서 16rRNA를 검출하거나 증폭 없이 바이러스 RNA의 존재를 보고하는 데 사용할 수 있습니다23,24. 동시에 DNM은 SNV에 민감하게 유지되며 이형접합 유기체의 유전자형 대립유전자형에도 사용할 수 있습니다25. DNM 분석법은 선택성이 높은 복잡한 혼합물에서 제품을 식별하거나 제품을 시각화하기 위한 모든 증폭 유형에 대한 보완 기법으로 사용할 수 있습니다. DNM은 기존의 TaqMan 및 비콘 프로브와 달리 시료를 가열할 필요가 없으므로 종점 검출 프로토콜에 사용할 수 있어 전체 검출을 비용 효율적으로 수행할 수 있습니다.

이 기사에서는 DNM의 인실리코(in silico ) 개발에 대해 설명하고 DNM의 조립 및 기능 특성화 절차를 보여줍니다. 이 작업은 바이러스 DNA(OR652423.1)의 위치 13972-14154에 해당하는 엡스타인-바 바이러스(EBV)의 합성 단편을 사용하여 수행되었습니다( 재료 표 참조).

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프로토콜

1. DNM 설계

  1. 관심 게놈 내에서 고유한 영역을 선택합니다.
    참고: 이 작업은 위치 13972-14154(OR652423.1)의 엡스타인-바 바이러스(EBV) 게놈 영역을 사용합니다.
  2. 예를 들어 Ugene26에 내장된 Primer3 도구를 통해 선택한 단편의 증폭을 위한 프라이머 세트를 생성합니다.
  3. UNAFold 웹 도구27 ( 재료 표 참조)을 열고 선택한 영역을 삽입합니다. 접힘 온도를 55°C로, 이온 조건을 250mM의 1가 이온, 200mM의 Mg2+로 변경합니다.
    1. 생성된 ssDNA 단편의 2차 구조를 열고 안정적인 헤어핀을 선택합니다. DNA-나노머신의 결합 부위를 구조화되지 않은 영역 또는 헤어핀 구조의 루프에 위치시켜 표적의 더 강력한 결합을 달성합니다.
  4. 표적 분석물 부위가 스템 루프 구조로 접혀 있는 경우 Arm 1과 2를 다음과 같이 배치합니다: Arm 2가 스템의 한쪽 면, 루프 및 두 번째 스템 면의 3-5nt와 결합하는지 확인합니다. 암 1은 두 번째 줄기 쪽의 조각을 결합합니다.
  5. DinaMelt 도구28 ( 재료 표 참조)을 열고 팔의 서열과 이의 역보수 서열을 분석합니다. DinaMelt 도구를 사용하여 Arms 2 및 3의 Tm이 65°C 이상, 즉 분석 온도(55°C)보다 10°C 이상 높은지 확인합니다.
    1. 높은 인식 선택성을 달성하려면 Arm 1의 Tm을 반응 온도(55°C)보다 최소 1-3°C 높게 유지하십시오29.
  6. Arms 1 및 2 염기서열을 DNAzyme 코어의 절반 및 F-sub 결합 단편13과 결합합니다.
  7. UNAFold27을 사용하여 설계된 DNA 가닥의 2차 구조를 분석합니다.
    참고: 55°C(분석 온도), 200mM Mg2+, 250mM 1가 이온(HEPES, Na+, K+).
    1. 폴딩 ΔG가 -4kcal/mol 미만인 경우에만 디자인을 사용하십시오. CG가 풍부한 긴 시퀀스는 피하십시오. 2차 구조가 너무 안정되면 Arm에 돌연변이를 도입하여 접힘 ΔG30을 증가시킵니다. 대안적으로, Arm 3을 Arm 2에서 2-3 nt 떨어진 곳에 배치하는 것은 안정적인 분자간 구조를 피하기 위해 Arm 3 서열을 변경하는 또 다른 전략입니다.
  8. Arm 3만큼 긴 DNA 타일 조각에 대한 무작위 염기서열을 생성합니다. (dT)4-6 또는 에틸렌 글리콜(예: 트리에틸렌 글리콜(TEG) 또는 헥사에틸렌 글리콜(HEG))을 통해 Arm 3 서열을 DNA 타일 서열과 결합합니다. 실험에 제시된 DNM 버전은 (dT)6을 사용합니다.
  9. 링커를 통해 단계 1.8에서 선택된 DNA 타일 단편에 상보적인 서열과 Arm 2를 연결합니다.
  10. UNAFold 웹 앱을 사용하여 설계된 DNA 가닥의 2차 구조를 분석합니다. 각 DNA 가닥의 접힘 에너지가 55°C에서 4kJ/mol 이상인지 확인하고 긴 CG 농축 염기서열을 피하십시오. 바람직하게는, DNA 타일 서열을 변경하십시오.
  11. 사용 가능한 벡터 그래픽 소프트웨어를 사용하여 구조를 그립니다. 이 글에서는 시각화를 위해 Biorender와 Pixelmator Pro를 사용합니다( 재료 표 참조). 각 가닥에 대해 5'->3' 방향으로 정확도를 확인합니다.
    참고: 신뢰할 수 있는 상용 공급업체에서 시퀀스를 구하십시오.

2. DNM의 기능 테스트

  1. 완충액 및 시약의 준비
    1. 50mM HEPES(pH 7.5-7.8), 50mM NaCl, 150mM KCl 및 200mMMgCl2로 구성된 반응 완충액을 준비합니다. 최대 50mL의 탈이온수를 채웁니다.
    2. Dzb-Tile 및 Tile-Arm3 올리고뉴클레오티드의 10μM 부분 표본을 준비합니다. Dza의 1 μM 용액, 100 μM F-sub 및 1 nM, 10 nM, 100 nM 분석물을 RNase/유리수 또는 멸균 탈이온수에 준비합니다. 올리고뉴클레오티드 서열의 세부 사항은 재료 표에 나와 있습니다.
  2. DNM 어셈블리
    1. 사용하기 전에 올리고뉴클레오티드 용액을 완전히 해동하십시오. 두드려서 부드럽게 섞습니다(과도하게 소용돌이치지 않음). 마이크로 원심분리기를 사용하여 용액을 (몇 초 동안) 스핀 다운합니다.
    2. 0.5mL 미세 원심분리기 튜브의 반응 완충액 200μL에 Dzb-Tile과 Tile-Arm3 각각 1μM를 혼합합니다.
    3. 튜브를 부드럽게 섞고 용액을 회전시킵니다.
    4. 닫힌 튜브의 뚜껑을 파라핀 필름으로 감쌉니다. 또는 스크류 캡 튜브를 사용하십시오.
    5. 끓는 물과 함께 500mL 비커에 튜브를 2분 동안 배양한 다음 히터를 끄고 밤새 온도를 수동적으로 식힙니다.
    6. 12% 네이티브 PAGE 준비: 10х TBE 완충액 1mL, 40% AA:BA 3mL, 최대 10mL의 탈이온수, APS 50μL 및 TEMED 5μL를 혼합합니다( 재료 표 참조). 혼합물을 겔 카세트로 옮기고 중합시킵니다.
    7. 각 샘플 1μL, 즉 조립된 DNM, Dzb-Tile 및 Tile-arm3를 1μL의 4x 로딩 염료와 혼합하고 겔에 로드합니다.
    8. 카세트를 챔버에 넣고 1x TBE 버퍼로 채우고 겔을 80V에서 90분 동안 작동시킵니다.
    9. 겔을 에티듐 브로마이드로 염색하고 겔 문서화 시스템을 사용하여 시각화합니다( 재료 표 참조).
  3. LOD 어세이
    1. 반응 완충액에서 160μL의 200nM F-sub를 준비합니다. 이는 기판 안정성의 기본 배경을 평가하기 위해 수행됩니다.
    2. 반응 완충액에서 20nM의 DNM 및 Dza와 200nM의 F-sub 농도로 사전 조립된 DNM, F-sub 및 Dza 160μL의 7개 부분 표본을 준비합니다. 7개의 튜브 중 튜브 #1을 빈 배경으로 유지하여 DNAzyme 코어의 자발적 조립을 평가합니다.
    3. 1 pM, 10 pM, 100 pM, 200 pM, 500 pM 및 1000 pM의 최종 농도로 분석물을 튜브 #2-7에 추가합니다.
    4. 튜브를 부드럽게 혼합하고 회전시킨 다음 용액을 50μL 부분 3개로 분류하여 검은색 96웰 플레이트에 넣습니다. 광학적으로 투명한 필름으로 플레이트를 밀봉합니다.
    5. 플레이트를 55°C의 수조에서 1시간 동안 배양합니다. 접시를 아래로 돌립니다.
    6. 525nm(λex = 495nm)에서 형광을 측정합니다. 각 점의 평균과 표준 편차를 계산합니다.
    7. F-sub 및 DNM이 포함된 튜브의 신호를 F-sub만 포함된 튜브의 신호로 나누어 블랭크 대 기본 비율을 계산합니다. 비율이 1.1-1.5 범위 내에 있는지 확인합니다.
    8. F-sub, DNM 및 분석물을 포함하는 튜브의 신호를 F-sub 및 DNM만 포함하는 튜브의 신호로 나누어 신호 대 블랭크 비율을 계산합니다. 신호가 배경 평균에 3 표준편차를 더한 값보다 높으면 참양성으로 간주합니다.
    9. 실험을 두 번 반복하고 분석 반복 간의 표준 편차가 0.5 미만인지 확인합니다.

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결과

첫 번째 실험의 목적은 분석물의 합성 단편보다 먼저 DNM의 조립을 보여주는 것이었습니다. 모든 구성 DNM 가닥을 반응 완충액에 첨가하고 비커에 조립했습니다. 조립된 DNM 복합체는 네이티브 PAGE에 의해 정확한 크기와 균질성을 평가받았습니다. Native PAGE는 레인 1에 분석물질이 있는 조립된 DNM과 레인 2 및 4에 있는 두 개의 DNM 가닥을 보여줍니다. DNA nanomachine가 조립되지 않...

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토론

DNA 기계의 설계는 간단하지만 혼성화 프로브 또는 기능적 DNA 나노 구조를 설계하는 데 약간의 경험이 필요합니다. 분석물 단편을 가능한 한 짧게 유지하여 가능한 2차 구조의 수를 줄이고 2차 구조에 대한 DNM 침습을 단순화하는 것이 적절합니다. CG 함량은 안정적인 분자 내 구조를 피하기 위해 60% 미만인 것이 바람직합니다. DNM의 성공적인 조립은 느린 냉각 속도에서 달성...

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공개

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 말

저자들은 EBV의 gDNA를 친절하게 제공해 준 예카테리나 V. 니키티나(Ekaterina V. Nikitina)에게 감사를 표한다. 무한나드 아테이아(Muhannad Ateiah), 마리아 Y. 베레조프스카야(Maria Y. Berezovskaya), 마리아 S. 루벨(Maria S. Rubel)은 러시아 연방 교육과학부(Grant No FSER-2022-0009)와 Priority 2030 프로그램에 감사를 표합니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL tubeBiofilCFT011015
100 bp+ DNA LadderEvrogenNL002
100-1000 µL pipetteKirgenKG-Pro1000
10-100 µL pipetteKirgenKG-Pro100
1-10 µL pipetteKirgenKG-Pro10
20-200 µL pipetteKirgenKG-Pro200
2-20 µL pipetteKirgenKG-Pro20
4x Gel Loading DyeEvrogenPB020
Acrylamide 4KAppliChemA1090,0500
Ammonium persulfateCarl Roth2809447
BiorenderBiorenderhttps://www.biorender.com
BisacrylamideMolekula22797959
Boric AcidTechSnabH-0202
ChemiDoc imaging systemBioRad12003153
Costar 96-Well Black Polystyrene PlateCorningCOS3915
DinaMeltRNA Institutehttp://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php
EDTAAmrescoAm-O105
Ethidium bromideBioLabMixEtBr-10
HEPESAmrescoAm-O485
Magnesium chlorideAppliChem131396
Mini Protean Tetra CellBioRad1658001EDU
pipette 10 µL tipsKirgenKG1111-L
pipette 1000 µL tipsKirgenKG1636
pipette 200 µL tipsKirgenKG1212-L
Pixelmator ProPixelmator Teamhttps://www.pixelmator.com/pro/
Potassium chlorideCarl Roth1782751
PowerPac Basic Power SupplyBioRad1645050
RNAse/DNAse free waterInvitrogen10977049
Sealing film for PCR platesSovtechP-502
Sodium chlorideVektonHCh (0,1)
Spark multimode microplate readerTecanSpark- 10M
T100 amplificatorBioRad10014822
TEMEDMolekula68604730
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneAmrescoAm-O497
UNAFoldRNA Institutehttp://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php
Water bathLOIPLB-140
Oligos used
Analyte:Evrogendirect order, standard desalting purification
GAGCACTTGGTCAGGCACACGG
ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG
TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG
GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG
CGGACTACGCCTTCGTTGC
Tile-Arm3:Evrogendirect order, standard desalting purification
CCG GGCTGCTGTGCCATTTT
TTGCTGACTACTGTCACCTCT
CTGCTAGTCT
Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG
TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC
CGCTGACCACAACGAGAGGAA
ACCTT		Evrogendirect order, standard desalting purification
Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT
GTCCGTGTGCCTGACCA		Evrogendirect order, standard desalting purification
F-sub oligonucleotide: AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU
CCCTGGGCA-BHQ1		DNA-Syntezdirect order, HPLC purification

참고문헌

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