DNAzyme 10-23 - Nükleik Asit Tanıma için Tabanlı Nanomakineler

Özet

DNAzyme tabanlı nanomakineler, nükleik asitlerin son derece seçici ve hassas tespiti için kullanılabilir. Bu makale, özgür yazılım kullanılarak 10-23 çekirdekli DNAzyme tabanlı nanomakinelerin tasarımı için ayrıntılı bir protokolü ve örnek olarak bir Epstein-Barr virüs parçasının tespitinde uygulanmasını açıklamaktadır.

Özet

DNA ve RNA dizilerinin (analitler) tespiti için DNAzyme tabanlı nanomakineler (DNM), oligonükleotidlerden yapılmış çok işlevli yapılardır. İşlevleri arasında sıkı analit bağlanması, yüksek derecede seçici analit tanıma, florojenik bir raportör substratın çoklu katalitik bölünmeleri ile floresan sinyal amplifikasyonu ve sensör tepkisinde bir artış için florojenik substrat çekimi yer alır. Fonksiyonel birimler, işbirlikçi eylemleri için ortak bir DNA iskelesine bağlanır. RNA parçalayan 10-23 DNM'ler, katalitik olmayan hibridizasyon problarına kıyasla geliştirilmiş hassasiyete sahiptir. DNM'nin stabilitesi ve substrat tanıma şansının artması, çift sarmallı bir DNA fragmanı, bir karo tarafından sağlanır. DNM, katlanmış bir RNA'da tek bir nükleotid farkı ve çift sarmallı bir DNA'da iki analiti ayırt edebilir ve diğer protein içermeyen hibridizasyon problarından ~ 1000 kat daha düşük konsantrasyonlarda analitleri tespit edebilir. Bu makale, DNA-nanomakine aktivitesinin tanısal potansiyelinin arkasındaki konsepti sunar ve nükleik asit tespit deneylerinde DNM tasarımını, montajını ve uygulamasını gözden geçirir.

Giriş

Nükleik asit tespiti için en eski yöntemlerden biri, seçici oligonükleotidlerin analiz edilen RNA veya DNA dizilerine tamamlayıcı bağlanmasıdır. Bu yöntem, hedeflenen bir DNA veya RNA analiti¹ ile Watson-Crick baz çiftleri oluşturabilen nükleik asit fragmanları (problar) kullanır. Kompleks daha sonra çeşitli tekniklerle analit ve bağlanmamış probdan ayırt edilir. Northern blotlama, in situ hibridizasyon veya qPCR gibi bazı yöntemler, tamamlayıcı bağlanma² olgusuna dayanmaktadır. En yaygın hibridizasyon problarının iki önemli dezavantajı vardır: düşük hassasiyet (mikromolar ila n....

Protokol

1. DNM tasarımı

1. İlgilenilen genom içinde benzersiz bir bölge seçin.
   NOT: Bu çalışma, 13972-14154 (OR652423.1) pozisyonlarında Epstein-Barr virüsü (EBV) genomunun bir bölgesini kullanmaktadır.
2. Seçilen parçanın amplifikasyonu için bir astar seti oluşturun, örneğin, Ugene^26'ya gömülü Primer3 aracı aracılığıyla.
3. UNAFold web aracını²⁷ açın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve seçilen bölgeyi ekleyin. Katlama sıcaklığını 55 °C'ye ve iyonik koşulları 250 mM monovalent iyonlara ve 200 mM Mg^{2 +} 'ya değiştirin.
   1. ....

Tartışmalar

DNA makinelerinin tasarımı basittir ancak hibridizasyon probları veya fonksiyonel DNA nanoyapıları tasarlama konusunda biraz deneyim gerektirir. Olası ikincil yapıların sayısını azaltmak ve ikincil yapıya DNM invazyonunu basitleştirmek için analit fragmanını mümkün olduğunca kısa tutmak uygundur. Stabil molekül içi yapılardan kaçınmak için CG içeriği tercihen %60'ın altında olmalıdır. DNM'nin başarılı bir şekilde monte edilmesi, yavaş soğutma hızlar.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tube	Biofil	CFT011015
100 bp+ DNA Ladder	Evrogen	NL002
100-1000 µL pipette	Kirgen	KG-Pro1000
10-100 µL pipette	Kirgen	KG-Pro100
1-10 µL pipette	Kirgen	KG-Pro10
20-200 µL pipette	Kirgen	KG-Pro200
2-20 µL pipette	Kirgen	KG-Pro20
4x Gel Loading Dye	Evrogen	PB020
Acrylamide 4K	AppliChem	A1090,0500
Ammonium persulfate	Carl Roth	2809447
Biorender	Biorender		https://www.biorender.com
Bisacrylamide	Molekula	22797959
Boric Acid	TechSnab	H-0202
ChemiDoc imaging system	BioRad	12003153
Costar 96-Well Black Polystyrene Plate	Corning	COS3915
DinaMelt	RNA Institute		http://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php
EDTA	Amresco	Am-O105
Ethidium bromide	BioLabMix	EtBr-10
HEPES	Amresco	Am-O485
Magnesium chloride	AppliChem	131396
Mini Protean Tetra Cell	BioRad	1658001EDU
pipette 10 µL tips	Kirgen	KG1111-L
pipette 1000 µL tips	Kirgen	KG1636
pipette 200 µL tips	Kirgen	KG1212-L
Pixelmator Pro	Pixelmator Team		https://www.pixelmator.com/pro/
Potassium chloride	Carl Roth	1782751
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050
RNAse/DNAse free water	Invitrogen	10977049
Sealing film for PCR plates	Sovtech	P-502
Sodium chloride	Vekton	HCh (0,1)
Spark multimode microplate reader	Tecan	Spark- 10M
T100 amplificator	BioRad	10014822
TEMED	Molekula	68604730
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Amresco	Am-O497
UNAFold	RNA Institute		http://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php
Water bath	LOIP	LB-140
Oligos used
Analyte:	Evrogen		direct order, standard desalting purification
GAGCACTTGGTCAGGCACACGG ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG CGGACTACGCCTTCGTTGC
Tile-Arm3:	Evrogen		direct order, standard desalting purification
CCG GGCTGCTGTGCCATTTT TTGCTGACTACTGTCACCTCT CTGCTAGTCT
Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC CGCTGACCACAACGAGAGGAA ACCTT	Evrogen		direct order, standard desalting purification
Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT GTCCGTGTGCCTGACCA	Evrogen		direct order, standard desalting purification
F-sub oligonucleotide: AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU CCCTGGGCA-BHQ1	DNA-Syntez		direct order, HPLC purification