Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف البروتوكول الحالي طريقة إنشاء نموذج فأر xenograft (PDX) مشتق من المريض باستخدام أنسجة الساركوما العظمية البشرية.

Abstract

الساركوما العظمية هي أكثر أورام العظام الخبيثة الأولية شيوعا لدى الأطفال والمراهقين. على الرغم من وضع خطط علاجية جديدة في السنوات الأخيرة ، إلا أن تشخيص مرضى الساركوما العظمية لم يتحسن بشكل ملحوظ. لذلك ، من الأهمية بمكان إنشاء نموذج قوي قبل السريري بدقة عالية. يحافظ نموذج xenograft المشتق من المريض (PDX) بأمانة على الخصائص الجينية واللاجينية وغير المتجانسة للأورام الخبيثة البشرية لكل مريض. وبالتالي ، تعتبر نماذج PDX أصلية في نماذج الجسم الحي لدراسة أنواع السرطان المختلفة في دراسات التحول. تقدم هذه المقالة بروتوكولا شاملا لإنشاء وصيانة نموذج ماوس PDX يعكس بدقة السمات المورفولوجية للساركوما العظمية البشرية. وهذا ينطوي على الزرع الفوري لأنسجة الساركوما العظمية البشرية التي تم استئصالها حديثا في الفئران التي تعاني من نقص المناعة ، تليها عمليات تمرير متتالية. يعمل النموذج الموصوف كمنصة لدراسة نمو الساركوما العظمية ومقاومتها للأدوية والانتكاس وورم خبيث. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يساعد في فحص العلاجات المستهدفة وإنشاء خطط علاج شخصية.

Introduction

الساركوما العظمية هي ورم خبيث عظمي أولي مشتق من خلايا الفص بين العظام وهو أكثر شيوعا عند المراهقين وكذلك الأطفال. غالبا ما يحدث في المشاش للحاجز الطويل ويتميز بورم خبيث مرتفع ، ورم خبيث مبكر ، وسوء التشخيص 1,2. ورم خبيث في الرئة هو السبب الرئيسي للوفاة في مرضى الساركوما العظمية. معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات للمرضى الذين يعانون من الساركوما العظمية غير النقيلي هو 65٪ -70٪ 3. ومع ذلك ، على مدى السنوات ال 40 الماضية ، لم يتحسن معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات (20 ٪ فقط) من المرضى الذين يعانون من الساركوما العظمية النقيلي بشكل ملحوظ ، و 25 ٪ من مرضى الساركوما العظمية لديهم نقائل في وقت التشخيص4. حاليا ، توصلت أدوية الخط الأول لعلاج الساركوما العظمية إلى توافق في الآراء ، ولكن لا تزال هناك اختلافات كبيرة في نظام العلاج الكيميائي ووقت العلاج5. من المهم إجراء تجارب قبل السريرية بناء على النماذج الحيوانية المناسبة للحصول على أنظمة علاج كيميائي أكثر فعالية.

حاليا ، تشمل النماذج المستخدمة بشكل شائع في التجارب قبل السريرية للساركوما العظمية زراعة الخلايا في المختبر القائمة على خط الخلية وفي الطعوم الخارجية المشتقة من الخلايا الحية (CDX) ، بالإضافة إلى الطعوم الخارجية المشتقة من المريض (PDX) 6,7.

خطوط الخلايا ملائمة للزراعة وللاستخدام في الدراسات المختبرية ، أو للزرع في الفئران التي تعاني من نقص المناعة لإنشاء نماذجCDX 8. ومع ذلك ، قد لا تعكس خطوط الخلايا المزروعة في المختبر بدقة عدم تجانس الأورام الخبيثة والخصائص الفردية للمرضى بسبب الطفرات المحتملة التي تحدث للتكيف مع بيئة الثقافة في المختبر أثناء الممرات المتكررة. بالإضافة إلى ذلك ، فإنها تفتقر إلى البيئة المكروية والجهاز المناعي اللازم لنمو الورم وتطوره في الجسم الحي. في حين أن نماذج CDX تقدم بعض المزايا مقارنة بزراعة الخلايا في المختبر ، إلا أنها قد لا تعكس بشكل كامل الخصائص الفردية لمرضى الساركوما العظمية ، على الرغم من أن أنسجة الورم التي تم الحصول عليها من نماذج CDX لها عدم تجانس محدود داخل الورم وتمثيل الجهاز المناعي مقارنة بخطوط الخلايا المزروعة في المختبر9. لذلك ، فإن إنشاء نموذج قبل سريري بدقة عالية أمر بالغ الأهمية.

تتضمن نماذج PDX الزرع الفوري لأنسجة السرطان البشرية التي تم استئصالها حديثا في الفئران التي تعاني من نقص المناعة. تسمح هذه الطريقة بالحفاظ المخلص على الخصائص الوراثية واللاجينية وغير المتجانسة للأورام الخبيثة البشرية لكل مريض ، حتى بعد الممرات المتتالية في الفئران. علاوة على ذلك ، من المعروف أن نماذج PDX تتنبأ بدقة بالنتائج السريرية اللاحقة10 ، مما يجعلها أدوات قيمة لإنشاء علاجات فردية وتطوير أبحاث الطب الدقيق11.

يصف هذا العمل الإجراء الخاص بإنشاء نموذج PDX في الفئران التي تعاني من نقص المناعة عن طريق زرع أنسجة الساركوما العظمية البشرية. تعمل هذه النماذج كمنصات لإجراء التجارب قبل السريرية للساركوما العظمية.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الدراسات التي تنطوي على الأنسجة البشرية من قبل لجنة مراجعة الأخلاقيات المؤسسية لمستشفى لونغهوا ، التابعة لجامعة شنغهاي للطب الصيني التقليدي (شنغهاي ، الصين) (2013LC52) ، وتم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من المرضى وفقا لإعلان هلسنكي. رقم IACUC لهذه الدراسة على هو PZSHUTCM221017013. تم تزويد ذكور الفئران البالغة من العمر أربعة أسابيع CAnN.Cg-Foxn1nu / Crl بأسد مزدوج حمية القوارض المشععة GB 14924.3 ومياه معقمة ، وتم إيواؤها في قفص الفئران IVCs مع خمسة فئران لكل قفص ، في ظل ظروف SPF مع دورة ضوء / مظلمة لمدة 12 ساعة. يتضمن جدول المواد معلومات مفصلة حول جميع المواد والكواشف والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. إعداد أنسجة الساركوما العظمية البشرية

ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استئصال أنسجة الساركوما العظمية البشرية12 من آفة عظم الفخذ لمريض ساركوما عظمية يبلغ من العمر 15 عاما قبل العلاج الكيميائي.

  1. قم على الفور بتخزين أنسجة الساركوما العظمية التي تم استئصالها حديثا في محلول واقي للأنسجة لزيادة الحفاظ على تنشيط خلايا الساركوما العظمية بعد الشطف بمحلول ملحي فسيولوجي معقم.
    ملاحظة: يجب زرع أنسجة الساركوما العظمية التي تم استئصالها حديثا في الفئران في أسرع وقت ممكن. يمكن تخزينها في محلول واقي الأنسجة لمدة أقصاها 24 ساعة قبل الزرع. يجب أن تكون أنسجة الساركوما العظمية المستخدمة في النمذجة من المرضى الذين لم يتلقوا العلاج الكيميائي. سيكون نشاط الخلايا السرطانية من المرضى الذين تلقوا العلاج الكيميائي ضعيفا ، مما يؤدي إلى فشل إنشاء النموذج وفقدان الدقة العالية.
  2. انقل أنسجة الساركوما العظمية التي تم استئصالها حديثا والمخزنة في المحلول الواقي للأنسجة إلى المختبر في أسرع وقت ممكن.
  3. إعداد الأدوات والمواد التجريبية لإنشاء نموذج PDX: المشارط (الشكل 1 أ) ؛ ملاقط العيون (الشكل 1B ، C) ؛ مقص العيون (الشكل 1 د) ؛ إبرة خياطة (الشكل 1E) ؛ خط خياطة (الشكل 1F) ؛ حامل إبرة مستقيم (الشكل 1 ز) ؛ قلم الوسم (الشكل 1H).
    ملاحظة: تأكد من تعقيم جميع الأدوات الجراحية عن طريق التعقيم قبل الاستخدام.
  4. شطف أنسجة الساركوما العظمية مرتين مع محلول ملحي فسيولوجي معقم مبرد مسبقا في غطاء معقم.
  5. إزالة مناطق من أنسجة الساركوما العظمية مع النزيف والنخر.
  6. قطع أنسجة الساركوما العظمية التي تم تنظيفها إلى 3 مم3 قطع بمشرط في طبق مزرعة يحتوي على محلول ملحي فسيولوجي معقم مبرد مسبقا واحتفظ به على الجليد.

2. إنشاء نماذج PDX عن طريق زرع أنسجة الساركوما العظمية في منطقة جناح الفأر

  1. يجب تطبيق تسكين ميلوكسيكام قبل الجراحة (5 ملغ/كغ/24 ساعة) عن طريق الحقن تحت الجلد في الفئران ووضع الفئران العارية على ستائر جراحية معقمة. توفير الدعم الحراري طوال العملية.
  2. تحفيز التخدير في الفئران عن طريق تعريضها ل 3٪ إيزوفلوران و 97٪ أكسجين. بعد تخدير الفئران تماما ، قم بنقلها إلى مخروط الأنف والحفاظ على التخدير بنسبة 1.5٪ إيزوفلوران و 98.5٪ أكسجين.
  3. اضغط على أصابع القدم للتأكد من تخدير الفئران تماما ، وانتظر لفترة أطول إذا كانت لا تزال هناك تشنجات أو ردود فعل متشنجة.
    ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الإجراءات باستخدام معدات معقمة في غطاء معقم. تجنب جفاف الفئران أثناء التخدير عن طريق تطبيق مرهم العيون على عيونهم.
  4. تأمين الماوس في وضع الاستلقاء الجانبي (الشكل 2 أ). تطهير جانب واحد من منطقة جناح الفأر لزراعة أنسجة الساركوما العظمية 3 مرات مع جولات متناوبة من البوفيدون اليود و 70٪ كرات القطن المطهرة من الإيثانول.
    ملاحظة: يتم إجراء التطهير الجراحي في نمط دائري ، يبدأ من المركز ويتصاعد إلى الخارج.
  5. ضع علامة على موقع الشق الجراحي على الجلد بقلم تحديد.
  6. قم بعمل شق 5 مم من الجلد إلى الأنسجة تحت الجلد بمشرط (الشكل 2 ب).
  7. ارفع الجلد الجانبي العلوي من هامش الشق باستخدام ملاقط العيون باستخدام اليد اليسرى ، وقم بإجراء تشريح حاد لأعلى تحت أدمة الفئران باستخدام حامل إبرة مستقيم باستخدام اليد اليمنى (الشكل 2C).
  8. امسك جلد الجانب العلوي من الشق بملاقط العيون باستخدام اليد اليسرى ، وضع أنسجة الساركوما العظمية تحت الجلد حوالي 5 مم فوق هامش الشق باستخدام ملاقط العيون باستخدام اليد اليمنى لزرع أنسجة الساركوما العظمية (الشكل 2 ج).
    ملاحظة: تأكد من زرع أنسجة الساركوما العظمية أسفل أدمة الجلد مباشرة. يتم إجراء تشريح حاد باستخدام ملقط تشريح مستقيم وغير حاد ، مثل حامل إبرة مستقيم ، لتجنب اختراق التجويف الصدري للفأر أثناء العثور على طبقة الأدمة من جلد الفأر.
  9. خيط الشق باستخدام خياطة قابلة للامتصاص مع 2-3 غرز لشق 5 مم (الشكل 2 د).
  10. أعد الفئران إلى أقفاص نظيفة وراقبها حتى تتعافى تماما من التخدير.
    ملاحظة: تم تعيين PDX الذي تم إنشاؤه عن طريق زرع أنسجة الساركوما العظمية البشرية على أنه الممر 0 (P0) ، تم تعيين PDX الذي تم إنشاؤه عن طريق زرع نسيج PDX في P0 على أنه الممر 1 (P1) ، متبوعا ب P2 و P3.

3. جمع أنسجة الورم PDX

  1. قياس حجم الورم مرة واحدة في الأسبوع. عندما يصل حجم الورم إلى 1500 مم3 ، القتل الرحيم للفئران باستخدام طريقة خلع عنق الرحم بعد استنشاق CO2 . تشمل نقاط النهاية الإنسانية تقرح الورم أو مشاكل في حركة الأطراف الأمامية.
    ملاحظة: قم بقياس القطر الطويل (أ) والقطر القصير (ب) للورم باستخدام الفرجار. احسب حجم الورم (V) باستخدام الصيغة: V = 1/2 × a × b2.
  2. ضع الماوس بشكل جانبي لكشف الورم ، وقم بتطهير الجلد في موقع الورم باستخدام كرة قطنية مبللة بالكحول.
  3. استخدم مقص العيون لفصل الورم بأكمله. وزن كتلة الورم باستخدام ميزان إلكتروني.

4. الفحص المرضي لأنسجة الورم السريرية الأولية و PDX

  1. ثبت أنسجة الورم13 في أنبوب سعة 50 مل يحتوي على 30 مل من محلول الفورمالين المخزن المحايد بنسبة 10٪ لمدة 24 ساعة. شطف أنسجة الورم جيدا بالماء المتدفق لإزالة المثبت.
  2. تجفيف وتضمين أنسجة الورم في البارافين14.
  3. شريحة أنسجة الورم وإجراء الفحص النسيجي الروتيني15.

النتائج

يصف هذا البروتوكول الإجراء التفصيلي لإنشاء نموذج فأر PDX ، مع الحفاظ على السمات المورفولوجية للساركوما العظمية البشرية بعد الزرع الفوري لأنسجة الساركوما العظمية البشرية التي تم استئصالها حديثا والممرات المتتالية في الفئران. هنا ، تم إنشاء نموذج فأر PDX بنجاح باستخدام أن?...

Discussion

يمكن لنماذج PDX محاكاة خصائص السرطانات البشرية والاحتفاظ بمزيد من التشابه مع الورم الرئيسي ، بما في ذلك التغيرات الجينية والجينومية ، والأنسجة ، وعدم التجانس ، وملف تعريف التعبير الجيني16،17،18،19. لذلك ?...

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

يتم دعم هذا العمل بمنح من (1) المؤسسة الوطنية لعلوم الطبيعة (81973877 و 82174408) ؛ (2) مشروع بناء مركز شنغهاي للأبحاث ذات الأولوية القصوى (2022ZZ01009) ؛ (3) البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2020YFE0201600) ؛ (4) مركز شنغهاي للابتكار التعاوني للتحول الصناعي لإعداد الطب الصيني التقليدي في المستشفى و (5) مشاريع بحثية ضمن ميزانية جامعة شنغهاي للطب الصيني التقليدي (2021LK047).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10% formalin neutral solutionWuhan Saiweier Biotechnology Co., LtdG1101-500mlFix the tissues
AutoclaveJapan Hiryama CompanyHVE-50Sterilization surgical instruments
CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlShanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd./Animal
CaliperYantai Green Forest Tools Co., Ltd.034180AMeasure the tumor volume
Dish (60mm)Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd430166, CorningSample placment during transplantation
Disinfectant cotton ballsShanghai Honglong Industrial Co., Ltd.20230627Disinfect the skin of mice
Disposable sterile glovesGuilin Hengbao Health Protection Co., Ltd.YT21131Sterile operation
Double lion Irradiated Rodent DietSuzhou Shuangshi Experimental Animal Feed Technology Co., Ltd.GB 14924.3Animal feed
Electronic scaleShanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd1-2000Weigh the weight of the tumor
EosinShanghai Gengyun Biotechnology Co., LtdE4009-25GHematoxylin eosin stain
HematoxylinShanghai Gengyun Biotechnology Co., LtdH3136-25GHematoxylin eosin stain
IsofluraneShenzhen RWD Life Technology Co., LtdVETEASYMouse anesthesia 
IVCs mice cageSuzhou Monkey King Animal Experimental Equipment Technology Co., Ltd.HH-MMB-2Animal barrier
Mark penZebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd.YYST5Mark the surgical incision
Olympus Optical microscopeJapanese Olympus CompanyBH20Scan tissue slices
Ophthalmic ointmentShanghai Gengyun Biotechnology Co., LtdSOICOEYEGRLAvoid dry eyes of mice during anesthesia
Ophthalmic scissorsShanghai NianYue Biotechnology Co., LtdY00030 JZCut the skin
Ophthalmic tweezersShanghai NianYue Biotechnology Co., LtdBS-ZER-S-100 BiosharpHold osteosarcoma tissues during transplantation
ParaffinJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd.80200-0015Buried osteosarcoma tissue
Paraffin slicing machineLyca Microsystem (Shanghai) Trading Co., Ltd.RM2235Osteosarcoma tissue section
physiological salineGuangzhou Jinsheng Biotechnology Co., Ltd.605-004057Rinse and temporary storage of osteosarcoma tissue
ScalpelsSurgical Instrument Factory of Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd.J11010-10# JZSeparation of osteosarcoma tissue and making surgical incisions
Sterile hoodThermo Fisher Technology (China) Co., Ltd.ECO0.9Surgical operation table
sterile surgical drapesHenan Huayu Medical Equipment Co., Ltd.20160090Provide sterile surgery area
Straight needle holderShanghai Gengyun Biotechnology Co., LtdJ31050 JZSuture the wound
Suture lineShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LtdF3124Suture the wound
Suture needleShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LtdF3124Suture the wound
Tissue protective solutionNanjing Shenghang Biotechnology Co., LTDBC-CFM-03Maintain the activity of tissue cells
Tube (50 mL)Shanghai Baisai, Biotechnology Co., Ltd.BLD-BL2002500Install formalin fixation solution

References

  1. Saraf, A. J., Fenger, J. M., Roberts, R. D. Osteosarcoma: accelerating progress makes for a hopeful future. Front Oncol. 8, 4 (2018).
  2. Ligon, J. A., et al. Pathways of immune exclusion in metastatic osteosarcoma are associated with inferior patient outcomes. J Immunother Cancer. 9 (5), e001772 (2021).
  3. Miwa, S., et al. Current and emerging targets in immunotherapy for osteosarcoma. J Oncol. 2019, 7035045 (2019).
  4. Eaton, B. R., et al. Osteosarcoma. Pediatr Blood Cancer. 68 (2), e28352 (2021).
  5. Ritter, J. Osteosarcoma. Ann Oncol. 21, 320-325 (2010).
  6. Lowery, C. D., et al. Broad spectrum activity of the checkpoint kinase 1 inhibitor prexasertib as a single agent or chemo potentiator across a range of preclinical pediatric tumor models. Clin Cancer Res. 25 (7), 2278-2289 (2019).
  7. Hingorani, P., et al. Trastuzumab deruxtecan, antibody-drug conjugate targeting Her2, is effective in pediatric malignancies: a report by the pediatric preclinical testing consortium. Mol Cancer Ther. 21 (8), 1318-1325 (2022).
  8. Brennecke, P., et al. CXCR4 antibody treatment suppresses metastatic spread to the lung of intratibial human osteosarcoma xenografts in mice. Clin Exp Metastasis. 31 (3), 339-349 (2014).
  9. Pan, B., Wei, X., Xu, X. Patient-derived xenograft models in hepatopancreatobiliary cancer. Cancer Cell Int. 22 (1), 41 (2022).
  10. Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumor xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
  11. Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. J Hematol Oncol. 13 (1), 4 (2020).
  12. Stitzlein, R. N., Wojcik, J., Sebro, R. A., Balamuth, N. J., Weber, K. L. Team approach: Osteosarcoma of the distal part of the femur in adolescents. JBJS Rev. 5 (12), 5 (2017).
  13. Kai, K., et al. Formalin fixation on Her-2 and PD-l1 expression in gastric cancer: A pilot analysis using the same surgical specimens with different fixation times. World J Clin Cases. 7 (4), 419-430 (2019).
  14. Yang, T. S., et al. A practical protocol to prepare paraffin-embedded whole tick histology sections. Ticks Tick Borne Dis. 14 (4), 102162 (2023).
  15. Chang, J., et al. Matrine inhibits prostate cancer via activation of the unfolded protein response/endoplasmic reticulum stress signaling and reversal of epithelial to mesenchymal transition. Mol Med Rep. 18 (1), 945-957 (2018).
  16. de Alava, E. Ewing sarcoma, an update on molecular pathology with therapeutic implications. Surg Pathol Clin. 10 (3), 575-585 (2017).
  17. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: An emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
  18. Eoh, K. J., et al. Comparison of clinical features and outcomes in epithelial ovarian cancer according to tumorigenicity in patient-derived xenograft models. Cancer Res Treat. 50 (3), 956-963 (2018).
  19. Stewart, E. L., et al. Clinical utility of patient-derived xenografts to determine biomarkers of prognosis and map resistance pathways in EGFR-mutant lung adenocarcinoma. J Clin Oncol. 33 (22), 2472-2480 (2015).
  20. Kresse, S. H., Meza-Zepeda, L. A., Machado, I., Llombart-Bosch, A., Myklebost, O. Preclinical xenograft models of human sarcoma show nonrandom loss of aberrations. Cancer. 118 (2), 558-570 (2012).
  21. Dobrolecki, L. E., et al. Patient-derived xenograft (PDX) models in basic and translational breast cancer research. Cancer Metastasis Rev. 35 (4), 547-573 (2016).
  22. Abdolahi, S., et al. Patient-derived xenograft (PDX) models, applications and challenges in cancer research. J Transl Med. 20 (1), 206 (2022).
  23. Deng, N., et al. Deep whole-genome sequencing identifies recurrent genomic alterations in commonly used breast cancer cell lines and patient-derived xenograft models. Breast Cancer Res. 24 (1), 63 (2022).
  24. Chen, F., et al. Generation and characterization of patient-derived xenografts from patients with osteosarcoma. Tissue Cell. 79, 101911 (2022).
  25. Fortuna-Costa, A., et al. An association between successful engraftment of osteosarcoma patient-derived xenografts and clinicopathological findings. Histol Histopathol. 35 (11), 1295-1307 (2020).
  26. Beck, J., et al. Canine and murine models of osteosarcoma. Vet Pathol. 59 (3), 399-414 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Xenograft PDX

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved