Establecimiento de un modelo de ratón de xenoinjerto derivado de un paciente con tejidos de osteosarcoma humano

Resumen

El presente protocolo describe el método para establecer un modelo de ratón de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) utilizando tejido de osteosarcoma humano.

Resumen

El osteosarcoma es el tumor óseo maligno primario más común en niños y adolescentes. A pesar del desarrollo de nuevos planes de tratamiento en los últimos años, el pronóstico de los pacientes con osteosarcoma no ha mejorado significativamente. Por lo tanto, es crucial establecer un modelo preclínico robusto y de alta fidelidad. El modelo de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) conserva fielmente las características genéticas, epigenéticas y heterogéneas de las neoplasias malignas humanas para cada paciente. En consecuencia, los modelos PDX se consideran auténticos modelos in vivo para el estudio de diversos cánceres en estudios de transformación. En este artículo se presenta un protocolo completo para crear y mantener un modelo de ratón PDX que refleje con precisión las características morfológicas del osteosarcoma humano. Esto implica el trasplante inmediato de tejido de osteosarcoma humano recién resecado a ratones inmunocomprometidos, seguido de un paso sucesivo. El modelo descrito sirve como plataforma para estudiar el crecimiento, la resistencia a los medicamentos, la recaída y la metástasis del osteosarcoma. Además, ayuda a seleccionar las terapias objetivo y a establecer esquemas de tratamiento personalizados.

Introducción

El osteosarcoma es una neoplasia maligna ósea primaria derivada de las células del lóbulo interóseo y es más común tanto en adolescentes como en niños. A menudo ocurre en la epífisis de la diáfisis larga y se caracteriza por una alta malignidad, metástasis tempranas y mal pronóstico ^1,2. La metástasis pulmonar es la principal causa de muerte en los pacientes con osteosarcoma. La tasa de supervivencia a 5 años de los pacientes con osteosarcoma no metastásico es del 65%-70%³. Sin embargo, en los últimos 40 años, la tasa de supervivencia a 5 años (solo 20%) de los pacientes con osteosarcoma metastásico no ha mejorado significativamente, y el 25% de los pacientes con osteosarcoma tienen metástasis en el momento del diagnóstico⁴. En la actualidad, los fármacos de primera línea para el tratamiento del osteosarcoma han alcanzado un consenso, pero aún existen diferencias significativas en el régimen de quimioterapia y el tiempo de tratamiento⁵. Es importante realizar experimentos preclínicos basados en modelos animales apropiados para obtener regímenes de quimioterapia más efectivos.

En la actualidad, los modelos comúnmente utilizados para los experimentos preclínicos de osteosarcoma incluyen el cultivo celular in vitro basado en líneas celulares y los xenoinjertos derivados de células (CDX) in vivo, así como los xenoinjertos derivados de pacientes (PDX)^6,7.

Las líneas celulares son convenientes para el cultivo y para su uso en estudios in vitro , o para el trasplante en ratones inmunodeficientes para establecer modelos CDX⁸. Sin embargo, es posible que las líneas celulares cultivadas in vitro no reflejen con precisión la heterogeneidad de las neoplasias malignas y las características individuales de los pacientes debido a las posibles mutaciones que se producen para adaptarse al entorno de cultivo in vitro durante los pasos repetidos. Además, carecen del microambiente y el sistema inmunitario necesarios para el crecimiento y desarrollo tumoral in vivo. Si bien los modelos CDX ofrecen algunas ventajas sobre el cultivo celular in vitro , es posible que aún no reflejen completamente las características individuales de los pacientes con osteosarcoma, aunque los tejidos tumorales obtenidos a partir de modelos CDX tienen una heterogeneidad intratumoral y una representación del sistema inmunitario limitadas en comparación con las líneas celulares cultivadas in vitro⁹. Por lo tanto, establecer un modelo preclínico con alta fidelidad es crucial.

Los modelos PDX implican el trasplante inmediato de tejidos cancerosos humanos recién resecados en ratones inmunodeficientes. Este método permite la preservación fiel de las características genéticas, epigenéticas y heterogéneas de las neoplasias malignas humanas para cada paciente, incluso después de pases sucesivos en ratones. Además, se sabe que los modelos PDX predicen con precisión los resultados clínicos posteriores¹⁰, lo que los convierte en herramientas valiosas para crear tratamientos individualizados y avanzar en la investigación de medicina de precisión¹¹.

En este trabajo se describe el procedimiento para establecer un modelo de PDX en ratones inmunodeficientes mediante el trasplante de tejido de osteosarcoma humano. Estos modelos sirven como plataformas para llevar a cabo experimentos preclínicos para el osteosarcoma.

Protocolo

Todos los estudios con tejidos humanos han sido aprobados por el Comité de Revisión de Ética Institucional del Hospital Longhua, afiliado a la Universidad de Medicina Tradicional China de Shanghái (Shanghái, China) (2013LC52), y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los pacientes de acuerdo con la Declaración de Helsinki. El número de IACUC para este estudio en animales es PZSHUTCM221017013. Ratones machos CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl de cuatro semanas de edad recibieron doble dieta para roedores irradiados con león GB 14924.3 y agua estéril, y se alojaron en la jaula de ratones IVC con cinco ratones por jaula, en condiciones de SPF con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. La Tabla de Materiales incluye información detallada sobre todos los materiales, reactivos e instrumentos utilizados en este protocolo.

1. Preparación del tejido de osteosarcoma humano

NOTA: En este estudio, se resecó el tejido de osteosarcoma humano¹² de la lesión del fémur de un paciente con osteosarcoma de 15 años antes de la quimioterapia.

1. Almacene inmediatamente el tejido de osteosarcoma recién resecado en una solución protectora de tejidos para maximizar la preservación de la activación de las células del osteosarcoma después del enjuague con solución salina fisiológica estéril.
   NOTA: Los tejidos de osteosarcoma recién resecados deben trasplantarse a ratones lo antes posible. Pueden almacenarse en la solución protectora de tejidos durante un máximo de 24 horas antes del trasplante. Los tejidos de osteosarcoma que se usan para modelar deben provenir de pacientes que no hayan recibido quimioterapia. La actividad de las células tumorales de los pacientes que recibieron quimioterapia será deficiente, lo que llevará al fracaso del establecimiento del modelo y a la pérdida de la alta fidelidad.
2. Transfiera los tejidos de osteosarcoma recién resecados almacenados en la solución protectora de tejidos al laboratorio lo antes posible.
3. Preparar instrumentos y materiales experimentales para establecer el modelo PDX: bisturíes (Figura 1A); pinzas oftálmicas (Figura 1B,C); tijera oftálmica (Figura 1D); aguja de sutura (Figura 1E); línea de sutura (Figura 1F); portaagujas recto (Figura 1G); rotulador (Figura 1H).
   NOTA: Asegúrese de que todos los instrumentos quirúrgicos se esterilizen en autoclave antes de usarlos.
4. Enjuague los tejidos del osteosarcoma dos veces con solución salina fisiológica estéril preenfriada en una capucha estéril.
5. Extirpar áreas del tejido del osteosarcoma con sangrado y necrosis.
6. Cortar el tejido limpio del osteosarcoma en trozos de 3 mm y³ con un bisturí en una placa de cultivo que contenga solución salina fisiológica estéril preenfriada y mantenerla en hielo.

2. Establecimiento de modelos PDX mediante trasplante de tejido de osteosarcoma en la región del flanco del ratón

1. Administrar analgesia preoperatoria de meloxicam (5 mg/kg/24 h) mediante inyección subcutánea en ratones y colocar a los ratones desnudos en paños quirúrgicos estériles. Proporcionar soporte térmico durante todo el procedimiento.
2. Inducir la anestesia en ratones exponiéndolos a un 3% de isoflurano y un 97% de oxígeno. Después de que los ratones estén completamente anestesiados, transfiéralos al cono de la nariz y mantenga la anestesia con 1,5% de isoflurano y 98,5% de oxígeno.
3. Pellizque los dedos de los pies para asegurarse de que los ratones estén completamente anestesiados y espere más tiempo si todavía hay espasmos o reacciones convulsivas.
   NOTA: Todos los procedimientos deben llevarse a cabo utilizando equipo estéril en una capucha estéril. Evite la sequedad de los ratones durante la anestesia aplicando ungüento oftálmico en sus ojos.
4. Asegure el mouse en una posición de decúbito lateral (Figura 2A). Desinfecte un lado de la región del flanco del ratón para el trasplante de tejido de osteosarcoma 3 veces con rondas alternas de povidona yodada y bolas de algodón desinfectante con etanol al 70%.
   NOTA: La desinfección quirúrgica se realiza en un patrón circular, comenzando en el centro y en espiral hacia afuera.
5. Marque el sitio de la incisión quirúrgica en la piel con un rotulador.
6. Realice una incisión de 5 mm desde la piel hasta los tejidos subcutáneos con un bisturí (Figura 2B).
7. Levantar la piel de la parte superior del margen de la incisión con pinzas oftálmicas con la mano izquierda y realizar una disección roma hacia arriba por debajo de la dermis de los ratones con un soporte de aguja recto con la mano derecha (Figura 2C).
8. Sujete la piel de la parte superior de la incisión con las pinzas oftálmicas con la mano izquierda y coloque el tejido del osteosarcoma debajo de la piel aproximadamente 5 mm por encima del margen de la incisión con pinzas oftálmicas con la mano derecha para trasplantar el tejido del osteosarcoma (Figura 2C).
   NOTA: Asegúrese de que el tejido del osteosarcoma se trasplante justo debajo de la dermis de la piel. La disección roma se realiza con unas pinzas de disección rectas y romas, como un portaagujas recto, para evitar penetrar en la cavidad torácica del ratón mientras se encuentra la capa dérmica de la piel del ratón.
9. Suturar la incisión con sutura reabsorbible con 2-3 puntos para una incisión de 5 mm (Figura 2D).
10. Regrese a los ratones a jaulas limpias y vigílelos hasta que se recuperen por completo de la anestesia.
    NOTA: La PDX establecida por el trasplante de tejido de osteosarcoma humano se designa como pasaje 0 (P0), la PDX establecida por el trasplante del tejido PDX en P0 se designa como pasaje 1 (P1), seguido de P2 y P3.

3. Recolección de tejidos tumorales PDX

1. Mida el volumen del tumor una vez a la semana. Cuando el tamaño del tumor alcanza los 1500^mm3, se practica la eutanasia a los ratones utilizando el método de dislocación cervical después de la inhalación de CO₂ . Los criterios de valoración humanitarios incluyen la ulceración tumoral o problemas con la movilidad de las extremidades delanteras.
   NOTA: Mida el diámetro largo (a) y el diámetro corto (b) del tumor con un calibrador. Calcule el volumen tumoral (V) mediante la fórmula: V = 1/2 × a ×^{b 2}.
2. Coloque el ratón lateralmente para exponer el tumor y desinfecte la piel en el sitio del tumor con una bola de algodón empapada en alcohol.
3. Use tijeras oftálmicas para separar todo el tumor. Pesar la masa tumoral con una báscula electrónica.

4. Examen anatomopatológico de los tejidos tumorales clínicos primarios y PDX

1. Fijar los tejidos tumorales¹³ en un tubo de 50 mL que contenga 30 mL de solución de formalina tamponada neutra al 10% durante 24 h. Enjuague bien los tejidos tumorales con agua corriente para eliminar el fijador.
2. Deshidratar e incrustar los tejidos tumorales en parafina¹⁴.
3. Cortar los tejidos tumorales y realizar el examen histológico de rutina¹⁵.

Resultados

Este protocolo describe el procedimiento detallado para establecer un modelo de ratón PDX, que conserva las características morfológicas del osteosarcoma humano después del trasplante inmediato de tejido de osteosarcoma humano recién resecado y los pasajes sucesivos en ratones. Aquí, se estableció con éxito un modelo de ratón PDX utilizando tejido de osteosarcoma humano.

La figura 3A muestra un ratón representativo de PD...

Discusión

Los modelos PDX pueden simular las características de los cánceres humanos y conservar más similitud con el tumor primario, incluyendo alteraciones genéticas y genómicas, histología, heterogeneidad y perfil de expresión génica 16,17,18,19. Por lo tanto, preservan los fenotipos moleculares y genotipos de los pacientes con cáncer, proporcionando enfoques...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% formalin neutral solution	Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd	G1101-500ml	Fix the tissues
Autoclave	Japan Hiryama Company	HVE-50	Sterilization surgical instruments
CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.	/	Animal
Caliper	Yantai Green Forest Tools Co., Ltd.	034180A	Measure the tumor volume
Dish (60mm)	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	430166, Corning	Sample placment during transplantation
Disinfectant cotton balls	Shanghai Honglong Industrial Co., Ltd.	20230627	Disinfect the skin of mice
Disposable sterile gloves	Guilin Hengbao Health Protection Co., Ltd.	YT21131	Sterile operation
Double lion Irradiated Rodent Diet	Suzhou Shuangshi Experimental Animal Feed Technology Co., Ltd.	GB 14924.3	Animal feed
Electronic scale	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	1-2000	Weigh the weight of the tumor
Eosin	Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd	E4009-25G	Hematoxylin eosin stain
Hematoxylin	Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd	H3136-25G	Hematoxylin eosin stain
Isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	VETEASY	Mouse anesthesia
IVCs mice cage	Suzhou Monkey King Animal Experimental Equipment Technology Co., Ltd.	HH-MMB-2	Animal barrier
Mark pen	Zebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd.	YYST5	Mark the surgical incision
Olympus Optical microscope	Japanese Olympus Company	BH20	Scan tissue slices
Ophthalmic ointment	Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd	SOICOEYEGRL	Avoid dry eyes of mice during anesthesia
Ophthalmic scissors	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	Y00030 JZ	Cut the skin
Ophthalmic tweezers	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	BS-ZER-S-100 Biosharp	Hold osteosarcoma tissues during transplantation
Paraffin	Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd.	80200-0015	Buried osteosarcoma tissue
Paraffin slicing machine	Lyca Microsystem (Shanghai) Trading Co., Ltd.	RM2235	Osteosarcoma tissue section
physiological saline	Guangzhou Jinsheng Biotechnology Co., Ltd.	605-004057	Rinse and temporary storage of osteosarcoma tissue
Scalpels	Surgical Instrument Factory of Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd.	J11010-10# JZ	Separation of osteosarcoma tissue and making surgical incisions
Sterile hood	Thermo Fisher Technology (China) Co., Ltd.	ECO0.9	Surgical operation table
sterile surgical drapes	Henan Huayu Medical Equipment Co., Ltd.	20160090	Provide sterile surgery area
Straight needle holder	Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd	J31050 JZ	Suture the wound
Suture line	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd	F3124	Suture the wound
Suture needle	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd	F3124	Suture the wound
Tissue protective solution	Nanjing Shenghang Biotechnology Co., LTD	BC-CFM-03	Maintain the activity of tissue cells
Tube (50 mL)	Shanghai Baisai, Biotechnology Co., Ltd.	BLD-BL2002500	Install formalin fixation solution