Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Mevcut protokol, insan osteosarkom dokusu kullanılarak hasta kaynaklı bir ksenogreft (PDX) fare modeli oluşturma yöntemini açıklamaktadır.

Özet

Osteosarkom, çocuk ve adolesanlarda en sık görülen primer malign kemik tümörüdür. Son yıllarda yeni tedavi planlarının geliştirilmesine rağmen, osteosarkom hastalarının prognozu önemli ölçüde iyileşmemiştir. Bu nedenle, yüksek sadakate sahip sağlam bir klinik öncesi model oluşturmak çok önemlidir. Hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) modeli, her hasta için insan malignitelerinin genetik, epigenetik ve heterojen özelliklerini aslına uygun olarak korur. Sonuç olarak, PDX modelleri, dönüşüm çalışmalarında çeşitli kanserleri incelemek için otantik in vivo modeller olarak kabul edilir. Bu makale, insan osteosarkomunun morfolojik özelliklerini doğru bir şekilde yansıtan bir PDX fare modeli oluşturmak ve sürdürmek için kapsamlı bir protokol sunmaktadır. Bu, yeni rezeke edilmiş insan osteosarkom dokusunun immün sistemi baskılanmış farelere derhal nakledilmesini ve ardından ardışık pasajı içerir. Açıklanan model, osteosarkomun büyümesini, ilaç direncini, nüksetmesini ve metastazını incelemek için bir platform görevi görür. Ek olarak, hedef terapötiklerin taranmasına ve kişiselleştirilmiş tedavi şemalarının oluşturulmasına yardımcı olur.

Giriş

Osteosarkom, interosseöz lob hücrelerinden türetilen primer bir kemik malignitesidir ve en sık ergenlerde ve çocuklarda görülür. Sıklıkla uzun diyafizin epifizinde ortaya çıkar ve yüksek malignite, erken metastaz ve kötü prognoz ile karakterizedir 1,2. Akciğer metastazı, osteosarkom hastalarında ana ölüm nedenidir. Metastatik olmayan osteosarkomlu hastaların 5 yıllık sağkalım oranı %65-%70'tir3. Bununla birlikte, son 40 yılda, metastatik osteosarkomlu hastaların 5 yıllık sağkalım oranı (sadece% 20) önemli ölçüde iyileşmemiştir ve osteosarkom hastalarının% 25'inde tanı anında metastaz vardır4. Şu anda, osteosarkom tedavisi için birinci basamak ilaçlar bir fikir birliğine varmıştır, ancak kemoterapi rejimi ve tedavi süresinde hala önemli farklılıklar vardır5. Daha etkili kemoterapi rejimleri elde etmek için uygun hayvan modellerine dayalı klinik öncesi deneyler yapmak önemlidir.

Şu anda, osteosarkom klinik öncesi deneyler için yaygın olarak kullanılan modeller arasında hücre hattı bazlı in vitro hücre kültürü ve in vivo hücre kaynaklı ksenogreftler (CDX) ile hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX) bulunmaktadır6,7.

Hücre hatları, kültürleme ve in vitro çalışmalarda kullanım için veya CDX modelleri oluşturmak için immün yetmezliği olan farelere transplantasyon için uygundur8. Bununla birlikte, in vitro kültürlenen hücre hatları, tekrarlanan geçişler sırasında in vitro kültür ortamına uyum sağlamak için ortaya çıkan potansiyel mutasyonlar nedeniyle malignitelerin heterojenliğini ve hastaların bireysel özelliklerini doğru bir şekilde yansıtmayabilir. Ek olarak, in vivo olarak tümör büyümesi ve gelişimi için gerekli mikro çevre ve bağışıklık sisteminden yoksundurlar. CDX modelleri in vitro hücre kültürüne göre bazı avantajlar sunsa da, CDX modellerinden elde edilen tümör dokuları, in vitro9 kültürlenen hücre hatlarına kıyasla sınırlı intratümöral heterojenliğe ve bağışıklık sistemi temsiline sahip olmasına rağmen, osteosarkom hastalarının bireysel özelliklerini tam olarak yansıtmayabilir. Bu nedenle, yüksek sadakate sahip bir klinik öncesi model oluşturmak çok önemlidir.

PDX modelleri, yeni rezeke edilmiş insan kanser dokularının immün yetmezliği olan farelere derhal nakledilmesini içerir. Bu yöntem, farelerde ardışık geçişlerden sonra bile her hasta için insan malignitelerinin genetik, epigenetik ve heterojen özelliklerinin sadık bir şekilde korunmasına izin verir. Ayrıca, PDX modellerinin daha sonraki klinik sonuçları10 doğru bir şekilde tahmin ettiği bilinmektedir, bu da onları kişiselleştirilmiş tedaviler oluşturmak ve hassas tıp araştırmalarını ilerletmek için değerli araçlar haline getirir11.

Bu çalışma, insan osteosarkom dokusunu naklederek immün yetmezliği olan farelerde bir PDX modeli oluşturma prosedürünü açıklamaktadır. Bu tür modeller, osteosarkom için klinik öncesi deneyler yapmak için platformlar olarak hizmet eder.

Protokol

İnsan dokusunu içeren tüm çalışmalar, Şanghay Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi'ne (Şangay, Çin) bağlı Longhua Hastanesi Kurumsal Etik İnceleme Komitesi tarafından onaylanmış (2013LC52) ve Helsinki Deklarasyonu'na uygun olarak hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alınmıştır. Bu hayvan çalışması için IACUC numarası PZSHUTCM221017013'dir. Dört haftalık erkek CAnN.Cg-Foxn1nu / Crl farelerine çift aslan Işınlanmış Kemirgen Diyeti GB 14924.3 ve steril su sağlandı ve 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsü ile SPF koşulları altında, kafes başına beş fare ile IVC'lerin fare kafesine yerleştirildi. Malzeme Tablosu, bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve aletler hakkında ayrıntılı bilgi içerir.

1. İnsan osteosarkom dokusunun hazırlanması

NOT: Bu çalışmada, 15 yaşındaki osteosarkom hastasının kemoterapi öncesi femur lezyonundan12 adet insan osteosarkom dokusu rezeke edildi.

  1. Steril fizyolojik salin ile duruladıktan sonra osteosarkom hücre aktivasyonunun korunmasını en üst düzeye çıkarmak için yeni rezeke edilmiş osteosarkom dokusunu hemen doku koruyucu bir solüsyonda saklayın.
    NOT: Yeni rezeke edilmiş osteosarkom dokuları mümkün olan en kısa sürede farelere nakledilmelidir. Transplantasyondan önce en fazla 24 saat doku koruyucu solüsyon içinde saklanabilirler. Modelleme için kullanılan osteosarkom dokuları kemoterapi almamış hastalardan olmalıdır. Kemoterapi alan hastalardan alınan tümör hücrelerinin aktivitesi zayıf olacak, bu da model oluşturmanın başarısızlığına ve yüksek sadakat kaybına yol açacaktır.
  2. Doku koruyucu solüsyon içinde saklanan yeni çıkarılmış osteosarkom dokularını mümkün olan en kısa sürede laboratuvara aktarın.
  3. PDX modelini oluşturmak için deneysel araçlar ve materyaller hazırlayın: neşterler (Şekil 1A); oftalmik cımbız (Şekil 1B,C); oftalmik makas (Şekil 1D); sütür iğnesi (Şekil 1E); sütür hattı (Şekil 1F); düz iğne tutucu (Şekil 1G); işaretleme kalemi (Şekil 1H).
    NOT: Kullanmadan önce tüm cerrahi aletlerin otoklavlama ile sterilize edildiğinden emin olun.
  4. Osteosarkom dokularını steril bir başlıkta önceden soğutulmuş steril fizyolojik salin ile iki kez durulayın.
  5. Osteosarkom dokusunun kanama ve nekroz olan bölgelerini çıkarın.
  6. Temizlenmiş osteosarkom dokusunu önceden soğutulmuş steril serum fizyolojik içeren bir kültür kabında bistüri yardımıyla3 mm 3 parçaya kesin ve buz üzerinde bekletin.

2. Fare yan bölgesinde osteosarkom doku nakli ile PDX modellerinin oluşturulması

  1. Farelerde deri altı enjeksiyonu ile preoperatif meloksikam analjezisi (5 mg / kg / 24 saat) uygulayın ve çıplak fareleri steril cerrahi örtülere yerleştirin. Prosedür boyunca termal destek sağlayın.
  2. Farelerde% 3 izofluran ve% 97 oksijene maruz bırakarak anesteziyi indükleyin. Fareler tamamen uyuşturulduktan sonra, onları burun konisine aktarın ve% 1.5 izofluran ve% 98.5 oksijen ile anesteziyi sürdürün.
  3. Farelerin tamamen uyuşturulduğundan emin olmak için ayak parmaklarını sıkıştırın ve hala spazmlar veya konvülsif reaksiyonlar varsa daha uzun süre bekleyin.
    NOT: Tüm prosedürler steril bir başlıkta steril ekipman kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Anestezi sırasında gözlerine oftalmik merhem sürerek farelerin kuruluğunu önleyin.
  4. Fareyi yanal dekübit pozisyonunda sabitleyin (Şekil 2A). Osteosarkom doku nakli için fare yan bölgesinin bir tarafını alternatif povidon iyot ve% 70 etanol dezenfektan pamuk topları ile 3 kez dezenfekte edin.
    NOT: Cerrahi dezenfeksiyon, merkezden başlayıp dışa doğru spiral şeklinde dairesel bir şekilde gerçekleştirilir.
  5. Ciltteki cerrahi kesi bölgesini bir işaretleyici kalemle işaretleyin.
  6. Neşter ile ciltten cilt altı dokulara doğru 5 mm'lik bir kesi yapın (Şekil 2B).
  7. Sol elinizi kullanarak insizyon kenarının üst yan derisini oftalmik cımbızla kaldırın ve sağ elinizi kullanarak düz bir iğne tutucu ile farelerin dermisinin altında yukarı doğru künt diseksiyon yapın (Şekil 2C).
  8. Sol elinizi kullanarak oftalmik cımbızla insizyonun üst yan cildini tutun ve osteosarkom dokusunu nakletmek için sağ elinizi kullanarak osteosarkom dokusunu insizyon kenarının yaklaşık 5 mm yukarısına oftalmik cımbızla cilt altına yerleştirin (Şekil 2C).
    NOT: Osteosarkom dokusunun cildin dermisinin hemen altına nakledildiğinden emin olun. Künt diseksiyon, fare derisinin dermis tabakasını bulurken fare göğüs boşluğuna nüfuz etmemek için düz bir iğne tutucu gibi düz ve künt bir diseksiyon forseps ile yapılır.
  9. 5 mm'lik bir kesi için 2-3 dikişli emilebilir sütür kullanarak insizyonu dikin (Şekil 2D).
  10. Fareleri temiz kafeslere geri koyun ve anesteziden tamamen iyileşene kadar izleyin.
    NOT: İnsan osteosarkom dokusunun nakledilmesiyle kurulan PDX, pasaj 0 (P0) olarak adlandırılır, PDX dokusunun P0'da nakledilmesiyle kurulan PDX, pasaj 1 (P1) olarak adlandırılır, ardından P2 ve P3 gelir.

3. PDX tümör dokularının toplanması

  1. Tümör hacmini haftada bir kez ölçün. Tümör boyutu 1500 mm'yeulaştığında 3, CO2 inhalasyonundan sonra servikal çıkık yöntemini kullanarak farelere ötenazi yapın. İnsancıl uç noktalar, tümör ülseri veya ön ekstremite hareketliliği ile ilgili sorunları içerir.
    NOT: Bir kumpas kullanarak tümörün uzun çapını (a) ve kısa çapını (b) ölçün. Aşağıdaki formülü kullanarak tümör hacmini (V) hesaplayın: V = 1/2 × a × b2.
  2. Tümörü ortaya çıkarmak için fareyi yanlamasına konumlandırın ve tümör bölgesindeki cildi alkole batırılmış bir pamuk topuyla dezenfekte edin.
  3. Tüm tümörü ayırmak için oftalmik makas kullanın. Tümör kütlesini elektronik bir ölçek kullanarak tartın.

4. Primer klinik ve PDX tümör dokularının patolojik incelemesi

  1. Tümör dokularını13 24 saat boyunca 30 mL% 10 nötr tamponlu formalin çözeltisi içeren 50 mL'lik bir tüpe sabitleyin. Fiksatifi çıkarmak için tümör dokularını akan su ile iyice durulayın.
  2. Tümör dokularını kurutun ve parafin14'e gömün.
  3. Tümör dokularını dilimleyin ve rutin histolojik muayeneyi yapın15.

Sonuçlar

Bu protokol, farelerde yeni rezeke edilmiş insan osteosarkom dokusunun ve ardışık pasajların hemen transplantasyonundan sonra insan osteosarkomunun morfolojik özelliklerini koruyarak bir PDX fare modeli oluşturmak için ayrıntılı prosedürü açıklar. Burada, insan osteosarkom dokusu kullanılarak bir PDX fare modeli başarıyla kuruldu.

Şekil 3A , 15 yaşındaki bir hastadan femoral osteosarkom dokusunun transplantasy...

Tartışmalar

PDX modelleri, insan kanserlerinin özelliklerini simüle edebilir ve genetik ve genomik değişiklikler, histoloji, heterojenlik ve gen ekspresyon profili 16,17,18,19 dahil olmak üzere birincil tümör ile daha fazla benzerliği koruyabilir. Bu nedenle, kanser hastalarının moleküler fenotiplerini ve genotiplerini korurlar, biyoloji eğitimi ve potansiyel t...

Açıklamalar

Yazarlar rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, (1) Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81973877 ve 82174408); (2) Şanghay En Öncelikli Araştırma Merkezi inşaat projesi (2022ZZ01009); (3) Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2020YFE0201600); (4) Şanghay Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Bütçesi Bütçesi Kapsamında Hastane TCM Hazırlığının Endüstriyel Dönüşümü ve (5) Araştırma Projesi (2021LK047) Şanghay İşbirlikçi İnovasyon Merkezi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
10% formalin neutral solutionWuhan Saiweier Biotechnology Co., LtdG1101-500mlFix the tissues
AutoclaveJapan Hiryama CompanyHVE-50Sterilization surgical instruments
CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlShanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd./Animal
CaliperYantai Green Forest Tools Co., Ltd.034180AMeasure the tumor volume
Dish (60mm)Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd430166, CorningSample placment during transplantation
Disinfectant cotton ballsShanghai Honglong Industrial Co., Ltd.20230627Disinfect the skin of mice
Disposable sterile glovesGuilin Hengbao Health Protection Co., Ltd.YT21131Sterile operation
Double lion Irradiated Rodent DietSuzhou Shuangshi Experimental Animal Feed Technology Co., Ltd.GB 14924.3Animal feed
Electronic scaleShanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd1-2000Weigh the weight of the tumor
EosinShanghai Gengyun Biotechnology Co., LtdE4009-25GHematoxylin eosin stain
HematoxylinShanghai Gengyun Biotechnology Co., LtdH3136-25GHematoxylin eosin stain
IsofluraneShenzhen RWD Life Technology Co., LtdVETEASYMouse anesthesia 
IVCs mice cageSuzhou Monkey King Animal Experimental Equipment Technology Co., Ltd.HH-MMB-2Animal barrier
Mark penZebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd.YYST5Mark the surgical incision
Olympus Optical microscopeJapanese Olympus CompanyBH20Scan tissue slices
Ophthalmic ointmentShanghai Gengyun Biotechnology Co., LtdSOICOEYEGRLAvoid dry eyes of mice during anesthesia
Ophthalmic scissorsShanghai NianYue Biotechnology Co., LtdY00030 JZCut the skin
Ophthalmic tweezersShanghai NianYue Biotechnology Co., LtdBS-ZER-S-100 BiosharpHold osteosarcoma tissues during transplantation
ParaffinJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd.80200-0015Buried osteosarcoma tissue
Paraffin slicing machineLyca Microsystem (Shanghai) Trading Co., Ltd.RM2235Osteosarcoma tissue section
physiological salineGuangzhou Jinsheng Biotechnology Co., Ltd.605-004057Rinse and temporary storage of osteosarcoma tissue
ScalpelsSurgical Instrument Factory of Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd.J11010-10# JZSeparation of osteosarcoma tissue and making surgical incisions
Sterile hoodThermo Fisher Technology (China) Co., Ltd.ECO0.9Surgical operation table
sterile surgical drapesHenan Huayu Medical Equipment Co., Ltd.20160090Provide sterile surgery area
Straight needle holderShanghai Gengyun Biotechnology Co., LtdJ31050 JZSuture the wound
Suture lineShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LtdF3124Suture the wound
Suture needleShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LtdF3124Suture the wound
Tissue protective solutionNanjing Shenghang Biotechnology Co., LTDBC-CFM-03Maintain the activity of tissue cells
Tube (50 mL)Shanghai Baisai, Biotechnology Co., Ltd.BLD-BL2002500Install formalin fixation solution

Referanslar

  1. Saraf, A. J., Fenger, J. M., Roberts, R. D. Osteosarcoma: accelerating progress makes for a hopeful future. Front Oncol. 8, 4 (2018).
  2. Ligon, J. A., et al. Pathways of immune exclusion in metastatic osteosarcoma are associated with inferior patient outcomes. J Immunother Cancer. 9 (5), e001772 (2021).
  3. Miwa, S., et al. Current and emerging targets in immunotherapy for osteosarcoma. J Oncol. 2019, 7035045 (2019).
  4. Eaton, B. R., et al. Osteosarcoma. Pediatr Blood Cancer. 68 (2), e28352 (2021).
  5. Ritter, J. Osteosarcoma. Ann Oncol. 21, 320-325 (2010).
  6. Lowery, C. D., et al. Broad spectrum activity of the checkpoint kinase 1 inhibitor prexasertib as a single agent or chemo potentiator across a range of preclinical pediatric tumor models. Clin Cancer Res. 25 (7), 2278-2289 (2019).
  7. Hingorani, P., et al. Trastuzumab deruxtecan, antibody-drug conjugate targeting Her2, is effective in pediatric malignancies: a report by the pediatric preclinical testing consortium. Mol Cancer Ther. 21 (8), 1318-1325 (2022).
  8. Brennecke, P., et al. CXCR4 antibody treatment suppresses metastatic spread to the lung of intratibial human osteosarcoma xenografts in mice. Clin Exp Metastasis. 31 (3), 339-349 (2014).
  9. Pan, B., Wei, X., Xu, X. Patient-derived xenograft models in hepatopancreatobiliary cancer. Cancer Cell Int. 22 (1), 41 (2022).
  10. Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumor xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
  11. Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. J Hematol Oncol. 13 (1), 4 (2020).
  12. Stitzlein, R. N., Wojcik, J., Sebro, R. A., Balamuth, N. J., Weber, K. L. Team approach: Osteosarcoma of the distal part of the femur in adolescents. JBJS Rev. 5 (12), 5 (2017).
  13. Kai, K., et al. Formalin fixation on Her-2 and PD-l1 expression in gastric cancer: A pilot analysis using the same surgical specimens with different fixation times. World J Clin Cases. 7 (4), 419-430 (2019).
  14. Yang, T. S., et al. A practical protocol to prepare paraffin-embedded whole tick histology sections. Ticks Tick Borne Dis. 14 (4), 102162 (2023).
  15. Chang, J., et al. Matrine inhibits prostate cancer via activation of the unfolded protein response/endoplasmic reticulum stress signaling and reversal of epithelial to mesenchymal transition. Mol Med Rep. 18 (1), 945-957 (2018).
  16. de Alava, E. Ewing sarcoma, an update on molecular pathology with therapeutic implications. Surg Pathol Clin. 10 (3), 575-585 (2017).
  17. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: An emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
  18. Eoh, K. J., et al. Comparison of clinical features and outcomes in epithelial ovarian cancer according to tumorigenicity in patient-derived xenograft models. Cancer Res Treat. 50 (3), 956-963 (2018).
  19. Stewart, E. L., et al. Clinical utility of patient-derived xenografts to determine biomarkers of prognosis and map resistance pathways in EGFR-mutant lung adenocarcinoma. J Clin Oncol. 33 (22), 2472-2480 (2015).
  20. Kresse, S. H., Meza-Zepeda, L. A., Machado, I., Llombart-Bosch, A., Myklebost, O. Preclinical xenograft models of human sarcoma show nonrandom loss of aberrations. Cancer. 118 (2), 558-570 (2012).
  21. Dobrolecki, L. E., et al. Patient-derived xenograft (PDX) models in basic and translational breast cancer research. Cancer Metastasis Rev. 35 (4), 547-573 (2016).
  22. Abdolahi, S., et al. Patient-derived xenograft (PDX) models, applications and challenges in cancer research. J Transl Med. 20 (1), 206 (2022).
  23. Deng, N., et al. Deep whole-genome sequencing identifies recurrent genomic alterations in commonly used breast cancer cell lines and patient-derived xenograft models. Breast Cancer Res. 24 (1), 63 (2022).
  24. Chen, F., et al. Generation and characterization of patient-derived xenografts from patients with osteosarcoma. Tissue Cell. 79, 101911 (2022).
  25. Fortuna-Costa, A., et al. An association between successful engraftment of osteosarcoma patient-derived xenografts and clinicopathological findings. Histol Histopathol. 35 (11), 1295-1307 (2020).
  26. Beck, J., et al. Canine and murine models of osteosarcoma. Vet Pathol. 59 (3), 399-414 (2022).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Anahtar Kelimeler Hasta kaynakl ksenogreftPDXOsteosarkomKemik T m rPediatrik KanserPreklinik ModelT m r Heterojenitesila DirenciMetastazKi iselle tirilmi T p

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır