인간 골육종 조직을 이용한 환자 유래 이종이식 마우스 모델 구축

요약

본 프로토콜은 인간 골육종 조직을 이용하여 환자 유래 이종이식(PDX) 마우스 모델을 확립하는 방법을 설명한다.

초록

골육종은 소아와 청소년에서 가장 흔한 원발성 악성 골종양입니다. 최근 몇 년 동안 새로운 치료 계획이 개발되었음에도 불구하고 골육종 환자의 예후는 크게 개선되지 않았습니다. 따라서 충실도가 높은 강력한 전임상 모델을 구축하는 것이 중요합니다. PDX(Patient-derived xenograft) 모델은 각 환자에 대한 인간 악성 종양의 유전적, 후성유전적, 이질적 특성을 충실하게 보존합니다. 결과적으로, PDX 모델은 형질전환 연구에서 다양한 암을 연구하기 위한 진정한 in vivo 모델로 간주됩니다. 이 기사에서는 인간 골육종의 형태학적 특징을 정확하게 반영하는 PDX 마우스 모델을 만들고 유지하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 여기에는 갓 절제된 인간 골육종 조직을 면역력이 저하된 마우스에 즉시 이식한 후 연속적인 패스에이징이 포함됩니다. 설명된 모델은 골육종의 성장, 약물 내성, 재발 및 전이를 연구하기 위한 플랫폼 역할을 합니다. 또한 표적 치료제를 스크리닝하고 맞춤형 치료 계획을 수립하는 데 도움이 됩니다.

서문

골육종은 골간엽 세포에서 유래한 원발성 뼈 악성 종양으로 소아뿐만 아니라 청소년에게 가장 흔합니다. 장성질환의 골단(epiphysis)에서 자주 발생하며, 악성종양이 높고, 전이가 빠르며, 예후가 좋지 않은 것이 특징이다 ^1,2. 폐 전이는 골육종 환자의 주요 사망 원인입니다. 비전이성 골육종 환자의 5년 생존율은 65%-70%³입니다. 그러나 지난 40년간 전이성 골육종 환자의 5년 생존율은 20%에 불과하며, 골육종 환자의 25%는 진단 시점에 전이가 있는 것으로 나타났다⁴. 현재 골육종 치료를 위한 1차 약물은 합의에 도달했지만, 항암화학요법 요법과 치료 시간에는 여전히 상당한 차이가 있다⁵. 보다 효과적인 화학요법 요법을 얻기 위해 적절한 동물 모델을 기반으로 전임상 실험을 수행하는 것이 중요합니다.

현재 골육종 전임상 실험에 일반적으로 사용되는 모델에는 세포주 기반 in vitro 세포 배양 및 in vivo 세포 유래 이종이식(CDX) 및 환자 유래 이종이식(PDX^)이 포함됩니다^6,7.

세포주는 배양 및 체외 연구에 사용하거나, 면역 결핍 마우스에 이식하여 CDX 모델을 확립하는 데 편리하다⁸. 그러나 in vitro에서 배양된 세포주는 반복적인 passage 동안 in vitro 배양 환경에 적응하기 위해 발생할 수 있는 잠재적인 돌연변이로 인해 악성 종양의 이질성과 환자의 개별 특성을 정확하게 반영하지 못할 수 있습니다. 또한 생체 내에서 종양 성장 및 발달에 필요한 미세환경과 면역 체계가 부족합니다. CDX 모델은 in vitro 세포 배양에 비해 몇 가지 이점을 제공하지만, CDX 모델에서 얻은 종양 조직은 in vitro 9에서 배양된 세포주에 비해 종양 내 이질성과 면역 체계 표현이 제한적이지만 여전히 골육종 환자의 개별 특성을 완전히 반영하지 못할 수 ^{있습니다.} 따라서 충실도가 높은 전임상 모델을 구축하는 것이 중요합니다.

PDX 모델은 갓 절제된 인간 암 조직을 면역 결핍 마우스에 즉시 이식하는 것을 포함합니다. 이 방법을 사용하면 각 환자에 대해 인간 악성 종양의 유전적, 후성유전적, 이질적인 특성을 충실하게 보존할 수 있으며, 심지어 마우스에서 연속적인 통로를 거친 후에도 가능합니다. 또한, PDX 모델은 이후의 임상 결과를 정확하게 예측하는 것으로 알려져 있어¹⁰ 개별화된 치료법을 개발하고 정밀 의학 연구를 발전시키는 데 유용한 도구가 되고 있다¹¹.

이 연구는 인간 골육종 조직을 이식하여 면역결핍 마우스에서 PDX 모델을 확립하는 절차를 설명합니다. 이러한 모델은 골육종에 대한 전임상 실험을 수행하기 위한 플랫폼 역할을 합니다.

프로토콜

인체 조직과 관련된 모든 연구는 중국 상하이 전통 의학 대학(중국 상하이)과 연계된 Longhua Hospital의 기관 윤리 검토 위원회(2013LC52)의 승인을 받았으며, 헬싱키 선언에 따라 환자로부터 서면 동의를 받았습니다. 이 동물 연구에 대한 IACUC 번호는 PZSHUTCM221017013입니다. 4주령 수컷 CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl 마우스에게 이중 사자 방사선 조사 설치류 식단 GB 14924.3 및 멸균수를 제공하고, 12시간 라이트/다크 사이클의 SPF 조건 하에서 케이지당 5마리의 마우스가 있는 IVC 마우스 케이지에 수용했습니다. 재료 표 에는 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 시약 및 기기에 대한 자세한 정보가 포함되어 있습니다.

1. 인간 골육종 조직의 제조

참고: 이 연구에서 인간 골육종 조직은 화학 요법 전에 15세 골육종 환자의 대퇴골 병변에서¹² 를 절제했습니다.

1. 멸균 생리식염수로 헹군 후 골육종 세포 활성화의 보존을 극대화하기 위해 갓 절제된 골육종 조직을 조직 보호 용액에 즉시 보관하십시오.
   참고: 갓 절제된 골육종 조직은 가능한 한 빨리 마우스에 이식해야 합니다. 이식 전 최대 24시간 동안 조직 보호 용액에 보관할 수 있습니다. 모델링에 사용되는 골육종 조직은 화학 요법을 받지 않은 환자의 것이어야 합니다. 화학요법을 받은 환자의 종양 세포의 활성이 불량하여 모델 구축에 실패하고 높은 충실도를 잃게 됩니다.
2. 조직 보호 용액에 저장된 갓 절제된 골육종 조직을 가능한 한 빨리 실험실로 옮깁니다.
3. PDX 모델을 확립하기 위한 실험 도구 및 재료를 준비합니다: 메스(그림 1A); 안과용 핀셋(그림 1B,C); 안과 가위(그림 1D); 봉합사 바늘 (그림 1E); 봉합선(그림 1F); 직선 바늘 홀더 (그림 1G); 마킹 펜(그림 1H).
   알림: 모든 수술 기구가 사용하기 전에 고압멸균으로 멸균되었는지 확인하십시오.
4. 멸균 후드에서 사전 냉각된 멸균 생리식염수로 골육종 조직을 두 번 헹굽니다.
5. 출혈과 괴사가 있는 골육종 조직 부위를 제거합니다.
6. 세척한 골육종 조직을 미리 냉각된 멸균 생리식염수가 들어있는 배양 접시에 메스로 3mm³ 조각으로 자르고 얼음 위에 보관합니다.

2. 마우스 옆구리 부위에 골육종 조직 이식을 통한 PDX 모델 구축

1. 생쥐에 멜록시캄(5mg/kg/24시간)의 수술 전 진통제를 투여하고 누드 생쥐를 멸균 수술용 커튼에 놓습니다. 절차 전반에 걸쳐 열 지원을 제공합니다.
2. 쥐를 3% 이소플루란과 97% 산소에 노출시켜 마취를 유도합니다. 마우스를 완전히 마취한 후 콧방울로 옮기고 1.5% 이소플루란과 98.5% 산소로 마취를 유지합니다.
3. 발가락을 꼬집어 쥐가 완전히 마취되었는지 확인하고 여전히 경련이나 경련 반응이 있으면 더 오래 기다립니다.
   알림: 모든 절차는 멸균 후드의 멸균 장비를 사용하여 수행해야 합니다. 마취 중 쥐의 눈에 안과 연고를 바르는 것이 건조하지 않도록 하십시오.
4. 마우스를 측면 욕창 위치에 고정합니다(그림 2A). 골육종 조직 이식을 위해 마우스 옆구리 부위의 한쪽을 포비돈 요오드와 70% 에탄올 소독제 면봉을 번갈아 가며 3번 소독합니다.
   알림: 외과적 소독은 중앙에서 시작하여 바깥쪽으로 나선형으로 원형 패턴으로 수행됩니다.
5. 수술 절개 부위를 마커 펜으로 피부에 표시하십시오.
6. 메스로 피부에서 피하 조직까지 5mm를 절개합니다(그림 2B).
7. 왼손으로 안과용 핀셋으로 절개 가장자리의 위쪽 피부를 들어 올리고 오른손을 사용하여 직선 바늘 홀더로 마우스의 진피 아래 위쪽으로 둔기 절개를 수행합니다(그림 2C).
8. 왼손으로 안과용 핀셋으로 절개 부위의 위쪽 피부를 잡고 오른손으로 안과용 핀셋으로 절개 가장자리에서 약 5mm 위에 골육종 조직을 피부 아래에 놓습니다(그림 2C).
   알림: 골육종 조직이 피부 진피 바로 아래에 이식되었는지 확인하십시오. 둔기 절개는 생쥐 피부의 진피층을 찾는 동안 생쥐 흉강을 관통하지 않도록 직선 바늘 홀더와 같은 직선 및 무딘 절개 겸자를 사용하여 수행됩니다.
9. 5mm 절개를 위해 2-3바늘의 흡수성 봉합사를 사용하여 절개 부위를 봉합합니다(그림 2D).
10. 쥐를 깨끗한 케이지로 돌려보내고 마취에서 완전히 회복될 때까지 모니터링합니다.
    참고: 인간 골육종 조직을 이식하여 확립된 PDX는 통로 0(P0)으로 지정되고, PDX 조직을 P0에 이식하여 확립된 PDX는 통로 1(P1)로 지정되며, 그 다음으로 P2 및 P3로 지정됩니다.

3. PDX 종양 조직 수집

1. 일주일에 한 번 종양 부피를 측정합니다. 종양 크기가 1500^mm3에 도달하면_CO2 흡입 후 자궁경부 탈구법을 사용하여 마우스를 안락사시킨다. 인도적 평가변수에는 종양 궤양 또는 앞다리 이동성 문제가 포함됩니다.
   참고: 캘리퍼스를 사용하여 종양의 긴 직경(a)과 짧은 직경(b)을 측정합니다. V = 1/2 × a × b² 공식을 사용하여 종양 부피(V)를 계산합니다.
2. 마우스를 옆으로 위치시켜 종양이 노출되도록 하고 알코올을 적신 면봉으로 종양 부위의 피부를 소독합니다.
3. 안과 가위를 사용하여 전체 종양을 분리하십시오. 전자 저울을 사용하여 종양 종괴의 무게를 잰다.

4. 1차 임상 및 PDX 종양 조직의 병리학적 검사

1. 30mL의 10% 중성 완충 포르말린 용액이 들어 있는 50mL 튜브에 종양 조직¹³ 을 24시간 동안 고정합니다. 흐르는 물로 종양 조직을 철저히 헹구어 정착제를 제거합니다.
2. 종양 조직을 탈수하고 파라핀¹⁴에 매립합니다.
3. 종양 조직을 절개하고 정기 조직학적 검사를 실시한다¹⁵.

결과

이 프로토콜은 PDX 마우스 모델을 구축하기 위한 자세한 절차를 설명하며, 갓 절제된 인간 골육종 조직을 즉시 이식하고 마우스에서 연속적인 통로를 삽입한 후 인간 골육종의 형태학적 특징을 보존합니다. 여기에서 인간 골육종 조직을 사용하여 PDX 마우스 모델을 성공적으로 확립했습니다.

그림 3A 는 15세 환자로부터 대퇴 골육...

토론

PDX 모델은 인간 암의 특성을 시뮬레이션하고 유전 및 게놈 변경, 조직학, 이질성 및 유전자 발현 프로파일을 포함하여 원발성 종양과 더 많은 유사성을 유지할 수 있습니다 16,17,18,19. 따라서 암 환자의 분자 표현형과 유전자형을 보존하여 생물학을 연구하고 잠재적인 치료법?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% formalin neutral solution	Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd	G1101-500ml	Fix the tissues
Autoclave	Japan Hiryama Company	HVE-50	Sterilization surgical instruments
CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.	/	Animal
Caliper	Yantai Green Forest Tools Co., Ltd.	034180A	Measure the tumor volume
Dish (60mm)	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	430166, Corning	Sample placment during transplantation
Disinfectant cotton balls	Shanghai Honglong Industrial Co., Ltd.	20230627	Disinfect the skin of mice
Disposable sterile gloves	Guilin Hengbao Health Protection Co., Ltd.	YT21131	Sterile operation
Double lion Irradiated Rodent Diet	Suzhou Shuangshi Experimental Animal Feed Technology Co., Ltd.	GB 14924.3	Animal feed
Electronic scale	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	1-2000	Weigh the weight of the tumor
Eosin	Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd	E4009-25G	Hematoxylin eosin stain
Hematoxylin	Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd	H3136-25G	Hematoxylin eosin stain
Isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	VETEASY	Mouse anesthesia
IVCs mice cage	Suzhou Monkey King Animal Experimental Equipment Technology Co., Ltd.	HH-MMB-2	Animal barrier
Mark pen	Zebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd.	YYST5	Mark the surgical incision
Olympus Optical microscope	Japanese Olympus Company	BH20	Scan tissue slices
Ophthalmic ointment	Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd	SOICOEYEGRL	Avoid dry eyes of mice during anesthesia
Ophthalmic scissors	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	Y00030 JZ	Cut the skin
Ophthalmic tweezers	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	BS-ZER-S-100 Biosharp	Hold osteosarcoma tissues during transplantation
Paraffin	Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd.	80200-0015	Buried osteosarcoma tissue
Paraffin slicing machine	Lyca Microsystem (Shanghai) Trading Co., Ltd.	RM2235	Osteosarcoma tissue section
physiological saline	Guangzhou Jinsheng Biotechnology Co., Ltd.	605-004057	Rinse and temporary storage of osteosarcoma tissue
Scalpels	Surgical Instrument Factory of Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd.	J11010-10# JZ	Separation of osteosarcoma tissue and making surgical incisions
Sterile hood	Thermo Fisher Technology (China) Co., Ltd.	ECO0.9	Surgical operation table
sterile surgical drapes	Henan Huayu Medical Equipment Co., Ltd.	20160090	Provide sterile surgery area
Straight needle holder	Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd	J31050 JZ	Suture the wound
Suture line	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd	F3124	Suture the wound
Suture needle	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd	F3124	Suture the wound
Tissue protective solution	Nanjing Shenghang Biotechnology Co., LTD	BC-CFM-03	Maintain the activity of tissue cells
Tube (50 mL)	Shanghai Baisai, Biotechnology Co., Ltd.	BLD-BL2002500	Install formalin fixation solution