Etablierung eines patienteneigenen Xenotransplantat-Mausmodells mit humanem Osteosarkomgewebe

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt das Verfahren zur Etablierung eines patientenabgeleiteten Xenotransplantat-Mausmodells (PDX) unter Verwendung von humanem Osteosarkomgewebe.

Zusammenfassung

Das Osteosarkom ist der häufigste primäre bösartige Knochentumor bei Kindern und Jugendlichen. Trotz der Entwicklung neuer Behandlungspläne in den letzten Jahren hat sich die Prognose für Osteosarkom-Patienten nicht wesentlich verbessert. Daher ist es entscheidend, ein robustes präklinisches Modell mit hoher Wiedergabetreue zu etablieren. Das patienteneigene Xenotransplantat-Modell (PDX) bewahrt die genetischen, epigenetischen und heterogenen Merkmale menschlicher Malignome für jeden Patienten originalgetreu. Folglich gelten PDX-Modelle als authentische in vivo-Modelle für die Untersuchung verschiedener Krebsarten in Transformationsstudien. In diesem Artikel wird ein umfassendes Protokoll für die Erstellung und Pflege eines PDX-Mausmodells vorgestellt, das die morphologischen Merkmale des menschlichen Osteosarkoms genau widerspiegelt. Dabei handelt es sich um die sofortige Transplantation von frisch reseziertem humanem Osteosarkomgewebe in immungeschwächte Mäuse, gefolgt von einer sukzessiven Passage. Das beschriebene Modell dient als Plattform für die Untersuchung des Wachstums, der Arzneimittelresistenz, des Rückfalls und der Metastasierung des Osteosarkoms. Darüber hinaus hilft es beim Screening der Zieltherapeutika und bei der Etablierung personalisierter Behandlungsschemata.

Einleitung

Das Osteosarkom ist eine primäre bösartige Knochenerkrankung, die von Zellen des interossären Lappens abgeleitet wird und sowohl bei Jugendlichen als auch bei Kindern am häufigsten auftritt. Sie tritt häufig in der Epiphyse der langen Diaphyse auf und ist gekennzeichnet durch hohe Malignität, frühe Metastasierung und schlechte Prognose ^1,2. Lungenmetastasen sind die Haupttodesursache bei Osteosarkompatienten. Die 5-Jahres-Überlebensrate von Patienten mit nicht-metastasiertem Osteosarkom beträgt 65 %-70 %³. In den letzten 40 Jahren hat sich die 5-Jahres-Überlebensrate (nur 20 %) der Patienten mit metastasiertem Osteosarkom jedoch nicht signifikant verbessert, und 25 % der Osteosarkompatienten haben zum Zeitpunkt der Diagnose Metastasen⁴. Derzeit haben die Erstlinienmedikamente für die Behandlung von Osteosarkomen einen Konsens erreicht, aber es gibt immer noch signifikante Unterschiede im Chemotherapieschema und in der Behandlungszeit⁵. Es ist wichtig, präklinische Experimente auf der Grundlage geeigneter Tiermodelle durchzuführen, um effektivere Chemotherapien zu erhalten.

Zu den Modellen, die derzeit häufig für präklinische Experimente mit Osteosarkomen verwendet werden, gehören zelllinienbasierte In-vitro-Zellkulturen und in vivo zellabgeleitete Xenotransplantate (CDX) sowie patientenabgeleitete Xenotransplantate (PDX)^6,7.

Die Zelllinien eignen sich hervorragend für die Kultivierung und Verwendung in In-vitro-Studien oder für die Transplantation in immundefiziente Mäuse zur Etablierung von CDX-Modellen⁸. In vitro kultivierte Zelllinien spiegeln jedoch möglicherweise nicht genau die Heterogenität der Malignome und die individuellen Merkmale der Patienten wider, da potenzielle Mutationen auftreten, um sich bei wiederholten Passagen an die In-vitro-Kulturumgebung anzupassen. Darüber hinaus fehlen ihnen die Mikroumgebung und das Immunsystem, die für das Wachstum und die Entwicklung von Tumoren in vivo erforderlich sind. Obwohl CDX-Modelle einige Vorteile gegenüber In-vitro-Zellkulturen bieten, spiegeln sie möglicherweise immer noch nicht vollständig die individuellen Merkmale von Osteosarkom-Patienten wider, obwohl Tumorgewebe, die aus CDX-Modellen gewonnen wurden, im Vergleich zu in vitro kultivierten Zelllinien eine begrenzte intratumorale Heterogenität und Repräsentation des Immunsystems aufweisen ⁹. Daher ist die Etablierung eines präklinischen Modells mit hoher Wiedergabetreue von entscheidender Bedeutung.

PDX-Modelle beinhalten die sofortige Transplantation von frisch reseziertem menschlichem Krebsgewebe in immundefiziente Mäuse. Diese Methode ermöglicht die getreue Erhaltung genetisches, epigenetischer und heterogener Merkmale menschlicher Malignome für jeden Patienten, auch nach aufeinanderfolgenden Passagen bei Mäusen. Darüber hinaus ist bekannt, dass PDX-Modelle spätere klinische Ergebnisse genau vorhersagen^{können 10}, was sie zu wertvollen Werkzeugen für die Entwicklung individualisierter Behandlungen und die Förderung der Forschung in der Präzisionsmedizin^{macht 11}.

Diese Arbeit beschreibt das Verfahren zur Etablierung eines PDX-Modells in immundefizienten Mäusen durch Transplantation von humanem Osteosarkomgewebe. Solche Modelle dienen als Plattformen für die Durchführung präklinischer Experimente zum Osteosarkom.

Protokoll

Alle Studien mit menschlichem Gewebe wurden vom Institutional Ethics Review Committee des Longhua Hospitals genehmigt, das der Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (Shanghai, China) angegliedert ist (2013LC52), und es wurde eine schriftliche Einverständniserklärung der Patienten in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki eingeholt. Die IACUC-Nummer für diese Tierstudie lautet PZSHUTCM221017013. Vier Wochen alte männliche CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl-Mäuse erhielten die Doppellöwen-Bestrahlungsdiät GB 14924.3 und steriles Wasser und wurden in einem IVC-Mäusekäfig mit fünf Mäusen pro Käfig unter Lichtschutzfaktor und einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus untergebracht. Die Materialtabelle enthält detaillierte Informationen über alle Materialien, Reagenzien und Instrumente, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Aufbereitung von menschlichem Osteosarkomgewebe

HINWEIS: In dieser Studie wurde das menschliche Osteosarkomgewebe¹² aus der Femurläsion eines 15-jährigen Osteosarkompatienten vor der Chemotherapie reseziert.

1. Lagern Sie das frisch resezierte Osteosarkomgewebe sofort in einer gewebeschützenden Lösung, um den Erhalt der Osteosarkomzellaktivierung nach dem Spülen mit steriler physiologischer Kochsalzlösung zu maximieren.
   HINWEIS: Frisch reseziertes Osteosarkomgewebe muss so schnell wie möglich in Mäuse transplantiert werden. Sie können vor der Transplantation maximal 24 h in der Gewebeschutzlösung gelagert werden. Osteosarkomgewebe, das für die Modellierung verwendet wird, muss von Patienten stammen, die keine Chemotherapie erhalten haben. Die Aktivität von Tumorzellen von Patienten, die eine Chemotherapie erhielten, ist gering, was zum Scheitern der Modelletablierung und zum Verlust der hohen Genauigkeit führt.
2. Übertragen Sie das frisch resezierte Osteosarkomgewebe, das in der Gewebeschutzlösung gelagert ist, so schnell wie möglich ins Labor.
3. Bereiten Sie experimentelle Instrumente und Materialien für die Etablierung des PDX-Modells vor: Skalpelle (Abbildung 1A); Augenpinzette (Abbildung 1B, C); Augenschere (Abbildung 1D); Nahtnadel (Abbildung 1E); Nahtlinie (Abbildung 1F); gerader Nadelhalter (Abbildung 1G); Markierungsstift (Abbildung 1H).
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle chirurgischen Instrumente vor der Verwendung durch Autoklavieren sterilisiert werden.
4. Spülen Sie das Osteosarkomgewebe zweimal mit vorgekühlter steriler physiologischer Kochsalzlösung in einer sterilen Haube.
5. Entfernen Sie Bereiche des Osteosarkomgewebes mit Blutungen und Nekrosen.
6. Schneiden Sie das gereinigte Osteosarkomgewebe mit einem Skalpell in eine Kulturschale mit vorgekühlter steriler physiologischer Kochsalzlösung in 3 mm³ Stücke und legen Sie es auf Eis.

2. Etablierung von PDX-Modellen durch Osteosarkom-Gewebetransplantation in der Flankenregion der Maus

1. Verabreichen Sie die präoperative Analgesie von Meloxicam (5 mg/kg/24 h) durch subkutane Injektion bei Mäusen und legen Sie die Nacktmäuse auf sterile OP-Abdeckungen. Bieten Sie während des gesamten Eingriffs thermische Unterstützung.
2. Induzieren Sie eine Anästhesie bei Mäusen, indem Sie sie 3 % Isofluran und 97 % Sauerstoff aussetzen. Nachdem die Mäuse vollständig betäubt sind, übertragen Sie sie in den Nasenkegel und halten Sie die Narkose mit 1,5 % Isofluran und 98,5 % Sauerstoff aufrecht.
3. Kneifen Sie die Zehen zusammen, um sicherzustellen, dass die Mäuse vollständig betäubt sind, und warten Sie länger, wenn es immer noch Krämpfe oder Krampfreaktionen gibt.
   HINWEIS: Alle Eingriffe müssen mit sterilen Geräten in einer sterilen Haube durchgeführt werden. Vermeiden Sie Trockenheit von Mäusen während der Anästhesie, indem Sie Augensalbe auf ihre Augen auftragen.
4. Sichern Sie die Maus in einer seitlichen Dekubitusposition (Abbildung 2A). Desinfizieren Sie eine Seite der Mausflankenregion für die Osteosarkom-Gewebetransplantation 3 Mal mit abwechselnden Runden von Povidon, Jod und 70% Ethanol Desinfektionsmittel Wattebällchen.
   HINWEIS: Die chirurgische Desinfektion wird in einem kreisförmigen Muster durchgeführt, das in der Mitte beginnt und spiralförmig nach außen verläuft.
5. Markieren Sie die chirurgische Schnittstelle auf der Haut mit einem Markierungsstift.
6. Machen Sie mit einem Skalpell einen 5 mm großen Schnitt von der Haut bis zum Unterhautgewebe (Abbildung 2B).
7. Heben Sie die obere Seitenhaut des Inzisionsrandes mit einer Augenpinzette mit der linken Hand an und führen Sie mit der rechten Hand eine stumpfe Dissektion nach oben unter der Dermis der Mäuse mit einem geraden Nadelhalter durch (Abbildung 2C).
8. Halten Sie die obere Seitenhaut des Schnittes mit der Augenpinzette mit der linken Hand fest und platzieren Sie das Osteosarkomgewebe mit einer Augenpinzette mit der rechten Hand unter der Haut, um das Osteosarkomgewebe zu transplantieren (Abbildung 2C).
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Osteosarkomgewebe direkt unter die Dermis der Haut transplantiert wird. Die stumpfe Dissektion wird mit einer geraden und einer stumpfen Dissektionszange, wie z. B. einem geraden Nadelhalter, durchgeführt, um ein Eindringen in die Brusthöhle der Maus zu vermeiden, während die Dermisschicht der Maushaut gefunden wird.
9. Nähen Sie den Schnitt mit resorbierbarem Naht mit 2-3 Stichen für einen 5-mm-Schnitt (Abbildung 2D).
10. Bringen Sie die Mäuse in saubere Käfige zurück und überwachen Sie sie, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt haben.
    HINWEIS: PDX, das durch Transplantation des menschlichen Osteosarkomgewebes gebildet wird, wird als Passage 0 (P0) bezeichnet, PDX, das durch Transplantation des PDX-Gewebes bei P0 gebildet wird, wird als Passage 1 (P1) bezeichnet, gefolgt von P2 und P3.

3. Entnahme von PDX-Tumorgewebe

1. Messen Sie das Tumorvolumen einmal pro Woche. Wenn die Tumorgröße 1500 mm³ erreicht, euthanasieren Sie die Mäuse nach der CO₂ -Inhalation mit der Methode der Gebärmutterhalsdislokation. Zu den humanen Endpunkten gehören Tumorgeschwüre oder Probleme mit der Beweglichkeit der vorderen Gliedmaßen.
   HINWEIS: Messen Sie den langen Durchmesser (a) und den kurzen Durchmesser (b) des Tumors mit einem Messschieber. Berechnen Sie das Tumorvolumen (V) mit der Formel: V = 1/2 × a × b².
2. Positionieren Sie die Maus seitlich, um den Tumor freizulegen, und desinfizieren Sie die Haut an der Tumorstelle mit einem alkoholgetränkten Wattebausch.
3. Verwenden Sie eine Augenschere, um den gesamten Tumor zu trennen. Wiegen Sie die Tumormasse mit einer elektronischen Waage.

4. Pathologische Untersuchung des primären klinischen und PDX-Tumorgewebes

1. Das Tumorgewebe¹³ wird 24 h lang in einem 50-ml-Röhrchen fixiert, das 30 ml 10%ige neutrale gepufferte Formalinlösung enthält. Spülen Sie das Tumorgewebe gründlich mit fließendem Wasser ab, um das Fixiermittel zu entfernen.
2. Dehydrieren Sie das Tumorgewebe und betten Sie es in Paraffin^{ein 14}.
3. Schneiden Sie das Tumorgewebe in Scheiben und führen Sie die histologische Routineuntersuchung^{durch 15}.

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt das detaillierte Verfahren zur Etablierung eines PDX-Mausmodells, bei dem die morphologischen Merkmale des menschlichen Osteosarkoms nach sofortiger Transplantation von frisch reseziertem humanem Osteosarkomgewebe und nachfolgenden Passagen bei Mäusen erhalten bleiben. Hier wurde erfolgreich ein PDX-Mausmodell mit humanem Osteosarkomgewebe etabliert.

Abbildung 3A zeigt eine repräsentative Maus von PDX...

Diskussion

Die PDX-Modelle können die Merkmale menschlicher Krebserkrankungen simulieren und eine größere Ähnlichkeit mit dem Primärtumor beibehalten, einschließlich genetischer und genomischer Veränderungen, Histologie, Heterogenität und Genexpressionsprofil 16,17,18,19. Daher bewahren sie die molekularen Phänotypen und Genotypen von Krebspatienten und bieten in...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% formalin neutral solution	Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd	G1101-500ml	Fix the tissues
Autoclave	Japan Hiryama Company	HVE-50	Sterilization surgical instruments
CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.	/	Animal
Caliper	Yantai Green Forest Tools Co., Ltd.	034180A	Measure the tumor volume
Dish (60mm)	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	430166, Corning	Sample placment during transplantation
Disinfectant cotton balls	Shanghai Honglong Industrial Co., Ltd.	20230627	Disinfect the skin of mice
Disposable sterile gloves	Guilin Hengbao Health Protection Co., Ltd.	YT21131	Sterile operation
Double lion Irradiated Rodent Diet	Suzhou Shuangshi Experimental Animal Feed Technology Co., Ltd.	GB 14924.3	Animal feed
Electronic scale	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	1-2000	Weigh the weight of the tumor
Eosin	Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd	E4009-25G	Hematoxylin eosin stain
Hematoxylin	Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd	H3136-25G	Hematoxylin eosin stain
Isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	VETEASY	Mouse anesthesia
IVCs mice cage	Suzhou Monkey King Animal Experimental Equipment Technology Co., Ltd.	HH-MMB-2	Animal barrier
Mark pen	Zebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd.	YYST5	Mark the surgical incision
Olympus Optical microscope	Japanese Olympus Company	BH20	Scan tissue slices
Ophthalmic ointment	Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd	SOICOEYEGRL	Avoid dry eyes of mice during anesthesia
Ophthalmic scissors	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	Y00030 JZ	Cut the skin
Ophthalmic tweezers	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	BS-ZER-S-100 Biosharp	Hold osteosarcoma tissues during transplantation
Paraffin	Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd.	80200-0015	Buried osteosarcoma tissue
Paraffin slicing machine	Lyca Microsystem (Shanghai) Trading Co., Ltd.	RM2235	Osteosarcoma tissue section
physiological saline	Guangzhou Jinsheng Biotechnology Co., Ltd.	605-004057	Rinse and temporary storage of osteosarcoma tissue
Scalpels	Surgical Instrument Factory of Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd.	J11010-10# JZ	Separation of osteosarcoma tissue and making surgical incisions
Sterile hood	Thermo Fisher Technology (China) Co., Ltd.	ECO0.9	Surgical operation table
sterile surgical drapes	Henan Huayu Medical Equipment Co., Ltd.	20160090	Provide sterile surgery area
Straight needle holder	Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd	J31050 JZ	Suture the wound
Suture line	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd	F3124	Suture the wound
Suture needle	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd	F3124	Suture the wound
Tissue protective solution	Nanjing Shenghang Biotechnology Co., LTD	BC-CFM-03	Maintain the activity of tissue cells
Tube (50 mL)	Shanghai Baisai, Biotechnology Co., Ltd.	BLD-BL2002500	Install formalin fixation solution