JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השיטה לביסוס מודל עכבר קסנוגרפט (PDX) הנגזר ממטופל באמצעות רקמת אוסטאוסרקומה אנושית.

Abstract

אוסטאוסרקומה היא גידול העצם הממאיר הראשוני השכיח ביותר בקרב ילדים ובני נוער. למרות פיתוח תוכניות טיפול חדשות בשנים האחרונות, הפרוגנוזה של חולי אוסטאוסרקומה לא השתפרה באופן משמעותי. לכן, חיוני לבסס מודל פרה-קליני חזק עם נאמנות גבוהה. מודל הקסנוגרפט הנגזר מהמטופל (PDX) משמר נאמנה את המאפיינים הגנטיים, האפיגנטיים וההטרוגניים של ממאירויות אנושיות עבור כל מטופל. כתוצאה מכך, מודלים של PDX נחשבים למודלים אותנטיים in vivo לחקר סוגי סרטן שונים במחקרי טרנספורמציה. מאמר זה מציג פרוטוקול מקיף ליצירה ותחזוקה של מודל עכבר PDX המשקף במדויק את התכונות המורפולוגיות של אוסטאוסרקומה אנושית. זה כרוך בהשתלה מיידית של רקמת אוסטאוסרקומה אנושית שזה עתה נכרתה בעכברים מדוכאי חיסון, ואחריה עוברים רצופים. המודל המתואר משמש פלטפורמה לחקר הגידול, העמידות לתרופות, הישנות וגרורות של אוסטאוסרקומה. בנוסף, הוא מסייע בסינון טיפולי היעד ובהקמת תוכניות טיפול מותאמות אישית.

Introduction

אוסטאוסרקומה היא ממאירות עצם ראשונית שמקורה בתאי אונה אינטרוסוסית והיא שכיחה ביותר בקרב מתבגרים כמו גם ילדים. זה קורה לעתים קרובות באפיפיזה של דיאפיזה ארוכה ומאופיין ממאירות גבוהה, גרורות מוקדמות, פרוגנוזה ירודה 1,2. גרורות ריאה הן סיבת המוות העיקרית בחולי אוסטאוסרקומה. שיעור ההישרדות ל-5 שנים של חולים עם אוסטאוסרקומה לא גרורתית הוא 65%-70%3. עם זאת, במהלך 40 השנים האחרונות, שיעור ההישרדות של 5 שנים (רק 20%) מהחולים עם אוסטאוסרקומה גרורתית לא השתפר באופן משמעותי, ול -25% מחולי אוסטאוסרקומה יש גרורות בזמן האבחנה4. נכון לעכשיו, תרופות הקו הראשון לטיפול באוסטאוסרקומה הגיעו לקונצנזוס, אך עדיין קיימים הבדלים משמעותיים במשטר הכימותרפיה ובזמן הטיפול5. חשוב לבצע ניסויים פרה-קליניים המבוססים על מודלים מתאימים של בעלי חיים כדי להשיג משטרי כימותרפיה יעילים יותר.

כיום, מודלים המשמשים בדרך כלל לניסויים פרה-קליניים של אוסטאוסרקומה כוללים תרבית תאים מבוססת קו תאים במבחנה וקסנוגרפטים הנגזרים מתאי in vivo (CDX), כמו גם xenografts שמקורם במטופל (PDX)6,7.

קווי התאים נוחים לתרבית ולשימוש במחקרי מבחנה , או להשתלה בעכברים מדוכאי חיסון כדי לבסס מודלים של CDX8. עם זאת, קווי תאים בתרבית במבחנה עשויים שלא לשקף במדויק את ההטרוגניות של ממאירויות ואת המאפיינים האישיים של חולים עקב מוטציות פוטנציאליות המתרחשות כדי להסתגל לסביבת תרבית החוץ גופית במהלך מעברים חוזרים. בנוסף, הם חסרים את המיקרו-סביבה ואת מערכת החיסון הדרושים לצמיחת הגידול ולהתפתחותו in vivo. בעוד מודלים CDX מציעים כמה יתרונות על פני תרבית תאים במבחנה , הם עדיין לא משקפים באופן מלא את המאפיינים האישיים של חולי אוסטאוסרקומה, אם כי רקמות הגידול שהתקבלו מודלים CDX יש הטרוגניות intratumoral מוגבלת ייצוג המערכת החיסונית בהשוואה קווי תאים בתרבית במבחנה9. לכן, הקמת מודל פרה-קליני עם נאמנות גבוהה היא קריטית.

מודלים של PDX כוללים השתלה מיידית של רקמות סרטניות אנושיות שזה עתה נכרתו בעכברים מדוכאי חיסון. שיטה זו מאפשרת שימור נאמן של מאפיינים גנטיים, אפיגנטיים והטרוגניים של ממאירויות אנושיות לכל חולה, גם לאחר מעברים רצופים בעכברים. יתר על כן, מודלים של PDX ידועים כמנבאים במדויק תוצאות קליניות מאוחרות יותר10, מה שהופך אותם לכלים רבי ערך ליצירת טיפולים מותאמים אישית ולקידום מחקר רפואה מדויקת11.

עבודה זו מתארת את ההליך לביסוס מודל PDX בעכברים מדוכאי חיסון על ידי השתלת רקמת אוסטאוסרקומה אנושית. מודלים כאלה משמשים פלטפורמות לביצוע ניסויים פרה-קליניים לאוסטאוסרקומה.

Protocol

כל המחקרים המערבים רקמות אנושיות אושרו על ידי ועדת האתיקה המוסדית של בית החולים Longhua, המסונף לאוניברסיטת שנגחאי לרפואה סינית מסורתית (שנחאי, סין) (2013LC52), והתקבלה הסכמה מדעת בכתב מהמטופלים בהתאם להצהרת הלסינקי. מספר IACUC עבור מחקר זה בבעלי חיים הוא PZSHUTCM221017013. עכברי CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl זכרים בני ארבעה שבועות קיבלו דיאטת מכרסמים מוקרנת כפולה GB 14924.3 ומים סטריליים, ושוכנו בכלוב עכברי IVC עם חמישה עכברים בכל כלוב, בתנאי SPF עם מחזור אור/חושך של 12 שעות. טבלת החומרים כוללת מידע מפורט על כל החומרים, הריאגנטים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הכנת רקמת אוסטאוסרקומה אנושית

הערה: במחקר זה, רקמת אוסטאוסרקומה אנושית נכרתה12 מנגע עצם הירך של חולה אוסטאוסרקומה בן 15 לפני כימותרפיה.

  1. יש לאחסן מיד את רקמת האוסטאוסרקומה שזה עתה נכרתה בתמיסה המגנה על הרקמה כדי למקסם את שימור הפעלת תאי אוסטאוסרקומה לאחר שטיפה במי מלח פיזיולוגיים סטריליים.
    הערה: רקמות אוסטאוסרקומה שזה עתה נכרתו חייבות להיות מושתלות בעכברים בהקדם האפשרי. ניתן לאחסן אותם בתמיסת מגן הרקמה למשך 24 שעות לכל היותר לפני ההשתלה. רקמות אוסטאוסרקומה המשמשות לדוגמנות חייבות להיות מחולים שלא קיבלו כימותרפיה. פעילות תאי הגידול מחולים שקיבלו כימותרפיה תהיה ירודה, מה שיוביל לכישלון הקמת המודל ולאובדן נאמנות גבוהה.
  2. העבר את רקמות האוסטאוסרקומה הטריות המאוחסנות בתמיסת מגן הרקמה למעבדה בהקדם האפשרי.
  3. הכינו מכשירים וחומרים ניסיוניים לביסוס מודל PDX: אזמלים (איור 1A); פינצטה אופתלמית (איור 1B,C); מספריים אופתלמיים (איור 1D); מחט תפר (איור 1E); קו התפר (איור 1F); מחזיק מחט ישר (איור 1G); עט סימון (איור 1H).
    הערה: ודא שכל כלי הניתוח מעוקרים על ידי autoclaving לפני השימוש.
  4. שטפו את רקמות האוסטאוסרקומה פעמיים במי מלח פיזיולוגיים סטריליים מקוררים מראש במכסה מנוע סטרילי.
  5. הסר אזורים של רקמת אוסטאוסרקומה עם דימום ונמק.
  6. חותכים את רקמת האוסטאוסרקומה המנוקה ל-3 מ"מ3 חתיכות בעזרת אזמל בצלחת תרבית המכילה מלח פיזיולוגי סטרילי מקורר מראש ושומרים אותו על קרח.

2. הקמת מודלים של PDX על ידי השתלת רקמת אוסטאוסרקומה באזור אגף העכבר

  1. ניהול שיכוך כאבים טרום ניתוחי של meloxicam (5 מ"ג / ק"ג / 24 שעות) על ידי הזרקה תת עורית בעכברים ומניחים את העכברים העירומים על וילונות כירורגיים סטריליים. לספק תמיכה תרמית לאורך כל ההליך.
  2. השראת הרדמה בעכברים על ידי חשיפתם ל-3% איזופלורן ו-97% חמצן. לאחר שהעכברים מורדמים לחלוטין, מעבירים אותם לקונוס האף ושומרים על הרדמה עם 1.5% איזופלורן ו-98.5% חמצן.
  3. צבטו את אצבעות הרגליים כדי לוודא שהעכברים מורדמים לחלוטין, והמתינו זמן רב יותר אם עדיין יש עוויתות או תגובות עוויתיות.
    הערה: כל ההליכים חייבים להתבצע באמצעות ציוד סטרילי במכסה מנוע סטרילי. הימנע מיובש של עכברים במהלך הרדמה על ידי מריחת משחה אופתלמית על עיניהם.
  4. אבטחו את העכבר בתנוחת דקוביטוס צידית (איור 2A). יש לחטא צד אחד של אזור אגף העכבר להשתלת רקמת אוסטאוסרקומה 3 פעמים עם סבבים מתחלפים של יוד פובידון וכדורי צמר גפן מחטאים אתנול 70%.
    הערה: חיטוי כירורגי מתבצע בתבנית מעגלית, המתחילה במרכז ומסתחררת כלפי חוץ.
  5. סמן את אתר החתך הניתוחי על העור בעט טוש.
  6. בצעו חתך בקוטר 5 מ"מ מהעור לרקמות התת עוריות בעזרת אזמל (איור 2B).
  7. הרימו את העור הצדדי העליון של שולי החתך בעזרת פינצטה אופתלמית באמצעות יד שמאל, ובצעו דיסקציה קהה כלפי מעלה מתחת לדרמיס של העכברים עם מחזיק מחט ישר באמצעות יד ימין (איור 2C).
  8. החזיקו את העור הצדדי העליון של החתך עם הפינצטה האופתלמית באמצעות יד שמאל, והניחו את רקמת האוסטאוסרקומה מתחת לעור כ-5 מ"מ מעל שולי החתך בעזרת פינצטה אופתלמית באמצעות יד ימין להשתלת רקמת אוסטאוסרקומה (איור 2C).
    הערה: ודא שרקמת האוסטאוסרקומה מושתלת ממש מתחת לדרמיס של העור. דיסקציה קהה מבוצעת באמצעות מלקחיים ישרים וקהים, כגון מחזיק מחט ישר, כדי למנוע חדירה לחלל בית החזה של העכבר תוך מציאת שכבת הדרמיס של עור העכבר.
  9. תפרו את החתך באמצעות תפר נספג עם 2-3 תפרים לחתך של 5 מ"מ (איור 2D).
  10. החזירו את העכברים לכלובים נקיים והשגיחו עליהם עד שיתאוששו לחלוטין מההרדמה.
    הערה: PDX שנוצר על ידי השתלת רקמת אוסטאוסרקומה אנושית מסומן כמעבר 0 (P0), PDX שהוקם על ידי השתלת רקמת PDX ב-P0 מסומן כמעבר 1 (P1), ואחריו P2 ו-P3.

3. איסוף רקמות גידול PDX

  1. למדוד את נפח הגידול פעם בשבוע. כאשר גודל הגידול מגיע ל 1500 מ"מ3, הרדימו את העכברים בשיטת פריקת צוואר הרחם לאחר שאיפתCO2 . נקודות קצה אנושיות כוללות כיב גידול או בעיות בניידות הגפיים הקדמיות.
    הערה: מדוד את הקוטר הארוך (a) והקוטר הקצר (b) של הגידול באמצעות קליפר. חשב את נפח הגידול (V) באמצעות הנוסחה: V = 1/2 × a × b2.
  2. מקם את העכבר לרוחב כדי לחשוף את הגידול, ולחטא את העור באתר הגידול עם כדור צמר גפן ספוג אלכוהול.
  3. השתמש מספריים אופתלמיים כדי להפריד את הגידול כולו. שוקלים את מסת הגידול באמצעות סולם אלקטרוני.

4. בדיקה פתולוגית של רקמות גידול ראשוניות קליניות ו- PDX

  1. תקן את רקמות הגידול13 בצינור 50 מ"ל המכיל 30 מ"ל של תמיסת פורמלין חוצצת ניטרלית 10% למשך 24 שעות. שטפו היטב את רקמות הגידול במים זורמים כדי להסיר את הקיבוע.
  2. לייבש ולהטמיע את רקמות הגידול בפרפין14.
  3. פורסים את רקמות הגידול ומבצעים בדיקה היסטולוגית שגרתית15.

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר את ההליך המפורט לביסוס מודל עכבר PDX, המשמר את התכונות המורפולוגיות של אוסטאוסרקומה אנושית לאחר השתלה מיידית של רקמת אוסטאוסרקומה אנושית שזה עתה נכרתה ומעברים עוקבים בעכברים. כאן, מודל עכבר PDX הוקם בהצלחה באמצעות רקמת אוסטאוסרקומה אנושית.

...

Discussion

מודלי PDX יכולים לדמות את המאפיינים של סרטן אנושי ולשמור על דמיון רב יותר עם הגידול הראשוני, כולל שינויים גנטיים וגנומיים, היסטולוגיה, הטרוגניות ופרופיל ביטוי גנים 16,17,18,19. לכן, הם משמרים את הפנוטיפים המ...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מ (1) הקרן הלאומית למדעי הטבע (81973877 ו -82174408); (2) פרויקט הבנייה של מרכז המחקר בעדיפות עליונה בשנחאי (2022ZZ01009); (3) תוכנית המו"פ הלאומית של סין (2020YFE0201600); (4) מרכז שנגחאי לחדשנות שיתופית של טרנספורמציה תעשייתית של הכנת TCM בבית חולים ו (5) פרויקטי מחקר במסגרת התקציב של אוניברסיטת שנגחאי לרפואה סינית מסורתית (2021LK047).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10% formalin neutral solutionWuhan Saiweier Biotechnology Co., LtdG1101-500mlFix the tissues
AutoclaveJapan Hiryama CompanyHVE-50Sterilization surgical instruments
CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlShanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd./Animal
CaliperYantai Green Forest Tools Co., Ltd.034180AMeasure the tumor volume
Dish (60mm)Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd430166, CorningSample placment during transplantation
Disinfectant cotton ballsShanghai Honglong Industrial Co., Ltd.20230627Disinfect the skin of mice
Disposable sterile glovesGuilin Hengbao Health Protection Co., Ltd.YT21131Sterile operation
Double lion Irradiated Rodent DietSuzhou Shuangshi Experimental Animal Feed Technology Co., Ltd.GB 14924.3Animal feed
Electronic scaleShanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd1-2000Weigh the weight of the tumor
EosinShanghai Gengyun Biotechnology Co., LtdE4009-25GHematoxylin eosin stain
HematoxylinShanghai Gengyun Biotechnology Co., LtdH3136-25GHematoxylin eosin stain
IsofluraneShenzhen RWD Life Technology Co., LtdVETEASYMouse anesthesia 
IVCs mice cageSuzhou Monkey King Animal Experimental Equipment Technology Co., Ltd.HH-MMB-2Animal barrier
Mark penZebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd.YYST5Mark the surgical incision
Olympus Optical microscopeJapanese Olympus CompanyBH20Scan tissue slices
Ophthalmic ointmentShanghai Gengyun Biotechnology Co., LtdSOICOEYEGRLAvoid dry eyes of mice during anesthesia
Ophthalmic scissorsShanghai NianYue Biotechnology Co., LtdY00030 JZCut the skin
Ophthalmic tweezersShanghai NianYue Biotechnology Co., LtdBS-ZER-S-100 BiosharpHold osteosarcoma tissues during transplantation
ParaffinJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd.80200-0015Buried osteosarcoma tissue
Paraffin slicing machineLyca Microsystem (Shanghai) Trading Co., Ltd.RM2235Osteosarcoma tissue section
physiological salineGuangzhou Jinsheng Biotechnology Co., Ltd.605-004057Rinse and temporary storage of osteosarcoma tissue
ScalpelsSurgical Instrument Factory of Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd.J11010-10# JZSeparation of osteosarcoma tissue and making surgical incisions
Sterile hoodThermo Fisher Technology (China) Co., Ltd.ECO0.9Surgical operation table
sterile surgical drapesHenan Huayu Medical Equipment Co., Ltd.20160090Provide sterile surgery area
Straight needle holderShanghai Gengyun Biotechnology Co., LtdJ31050 JZSuture the wound
Suture lineShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LtdF3124Suture the wound
Suture needleShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LtdF3124Suture the wound
Tissue protective solutionNanjing Shenghang Biotechnology Co., LTDBC-CFM-03Maintain the activity of tissue cells
Tube (50 mL)Shanghai Baisai, Biotechnology Co., Ltd.BLD-BL2002500Install formalin fixation solution

References

  1. Saraf, A. J., Fenger, J. M., Roberts, R. D. Osteosarcoma: accelerating progress makes for a hopeful future. Front Oncol. 8, 4 (2018).
  2. Ligon, J. A., et al. Pathways of immune exclusion in metastatic osteosarcoma are associated with inferior patient outcomes. J Immunother Cancer. 9 (5), e001772 (2021).
  3. Miwa, S., et al. Current and emerging targets in immunotherapy for osteosarcoma. J Oncol. 2019, 7035045 (2019).
  4. Eaton, B. R., et al. Osteosarcoma. Pediatr Blood Cancer. 68 (2), e28352 (2021).
  5. Ritter, J. Osteosarcoma. Ann Oncol. 21, 320-325 (2010).
  6. Lowery, C. D., et al. Broad spectrum activity of the checkpoint kinase 1 inhibitor prexasertib as a single agent or chemo potentiator across a range of preclinical pediatric tumor models. Clin Cancer Res. 25 (7), 2278-2289 (2019).
  7. Hingorani, P., et al. Trastuzumab deruxtecan, antibody-drug conjugate targeting Her2, is effective in pediatric malignancies: a report by the pediatric preclinical testing consortium. Mol Cancer Ther. 21 (8), 1318-1325 (2022).
  8. Brennecke, P., et al. CXCR4 antibody treatment suppresses metastatic spread to the lung of intratibial human osteosarcoma xenografts in mice. Clin Exp Metastasis. 31 (3), 339-349 (2014).
  9. Pan, B., Wei, X., Xu, X. Patient-derived xenograft models in hepatopancreatobiliary cancer. Cancer Cell Int. 22 (1), 41 (2022).
  10. Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumor xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
  11. Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. J Hematol Oncol. 13 (1), 4 (2020).
  12. Stitzlein, R. N., Wojcik, J., Sebro, R. A., Balamuth, N. J., Weber, K. L. Team approach: Osteosarcoma of the distal part of the femur in adolescents. JBJS Rev. 5 (12), 5 (2017).
  13. Kai, K., et al. Formalin fixation on Her-2 and PD-l1 expression in gastric cancer: A pilot analysis using the same surgical specimens with different fixation times. World J Clin Cases. 7 (4), 419-430 (2019).
  14. Yang, T. S., et al. A practical protocol to prepare paraffin-embedded whole tick histology sections. Ticks Tick Borne Dis. 14 (4), 102162 (2023).
  15. Chang, J., et al. Matrine inhibits prostate cancer via activation of the unfolded protein response/endoplasmic reticulum stress signaling and reversal of epithelial to mesenchymal transition. Mol Med Rep. 18 (1), 945-957 (2018).
  16. de Alava, E. Ewing sarcoma, an update on molecular pathology with therapeutic implications. Surg Pathol Clin. 10 (3), 575-585 (2017).
  17. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: An emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
  18. Eoh, K. J., et al. Comparison of clinical features and outcomes in epithelial ovarian cancer according to tumorigenicity in patient-derived xenograft models. Cancer Res Treat. 50 (3), 956-963 (2018).
  19. Stewart, E. L., et al. Clinical utility of patient-derived xenografts to determine biomarkers of prognosis and map resistance pathways in EGFR-mutant lung adenocarcinoma. J Clin Oncol. 33 (22), 2472-2480 (2015).
  20. Kresse, S. H., Meza-Zepeda, L. A., Machado, I., Llombart-Bosch, A., Myklebost, O. Preclinical xenograft models of human sarcoma show nonrandom loss of aberrations. Cancer. 118 (2), 558-570 (2012).
  21. Dobrolecki, L. E., et al. Patient-derived xenograft (PDX) models in basic and translational breast cancer research. Cancer Metastasis Rev. 35 (4), 547-573 (2016).
  22. Abdolahi, S., et al. Patient-derived xenograft (PDX) models, applications and challenges in cancer research. J Transl Med. 20 (1), 206 (2022).
  23. Deng, N., et al. Deep whole-genome sequencing identifies recurrent genomic alterations in commonly used breast cancer cell lines and patient-derived xenograft models. Breast Cancer Res. 24 (1), 63 (2022).
  24. Chen, F., et al. Generation and characterization of patient-derived xenografts from patients with osteosarcoma. Tissue Cell. 79, 101911 (2022).
  25. Fortuna-Costa, A., et al. An association between successful engraftment of osteosarcoma patient-derived xenografts and clinicopathological findings. Histol Histopathol. 35 (11), 1295-1307 (2020).
  26. Beck, J., et al. Canine and murine models of osteosarcoma. Vet Pathol. 59 (3), 399-414 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

PDX

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved