Estabelecimento de modelo de camundongo xenoenxerto derivado de pacientes com tecidos de osteossarcoma humano

Resumo

O presente protocolo descreve o método para estabelecer um modelo de camundongo xenoenxerto derivado do paciente (PDX) usando tecido de osteossarcoma humano.

Resumo

O osteossarcoma é o tumor ósseo maligno primário mais comum em crianças e adolescentes. Apesar do desenvolvimento de novos planos de tratamento nos últimos anos, o prognóstico para pacientes com osteossarcoma não melhorou significativamente. Portanto, é crucial estabelecer um modelo pré-clínico robusto com alta fidelidade. O modelo de xenoenxerto derivado do paciente (PDX) preserva fielmente as características genéticas, epigenéticas e heterogêneas das malignidades humanas para cada paciente. Consequentemente, os modelos PDX são considerados modelos in vivo autênticos para estudar vários tipos de câncer em estudos de transformação. Este artigo apresenta um protocolo abrangente para criar e manter um modelo de camundongo PDX que espelha com precisão as características morfológicas do osteossarcoma humano. Isso envolve o transplante imediato de tecido de osteossarcoma humano recém-ressecado em camundongos imunocomprometidos, seguido de passagem sucessiva. O modelo descrito serve como uma plataforma para estudar o crescimento, resistência a drogas, recidiva e metástase do osteossarcoma. Além disso, auxilia na triagem da terapêutica alvo e no estabelecimento de esquemas de tratamento personalizados.

Introdução

O osteossarcoma é uma malignidade óssea primária derivada de células do lobo interósseo e é mais comum em adolescentes e crianças. Ocorre frequentemente na epífise da diáfise longa e é caracterizada por alta malignidade, metástase precoce e mau prognóstico ^1,2. A metástase pulmonar é a principal causa de morte em pacientes com osteossarcoma. A taxa de sobrevida em 5 anos de pacientes com osteossarcoma não metastático é de 65% a 70%³. No entanto, nos últimos 40 anos, a taxa de sobrevida em 5 anos (apenas 20%) dos pacientes com osteossarcoma metastático não melhorou significativamente, e 25% dos pacientes com osteossarcoma apresentam metástases no momento do diagnóstico⁴. Atualmente, as drogas de primeira linha para o tratamento do osteossarcoma chegaram a um consenso, mas ainda existem diferenças significativas no esquema quimioterápico e no tempo de tratamento⁵. É importante realizar experimentos pré-clínicos baseados em modelos animais apropriados para obter regimes de quimioterapia mais eficazes.

Atualmente, os modelos comumente usados para experimentos pré-clínicos de osteossarcoma incluem cultura de células in vitro baseada em linhagem celular e xenoenxertos derivados de células in vivo (CDX), bem como xenoenxertos derivados de pacientes (PDX)^6,7.

As linhagens celulares são convenientes para cultura e uso em estudos in vitro , ou para transplante em camundongos imunodeficientes para estabelecer modelos de CDX⁸. No entanto, as linhagens celulares cultivadas in vitro podem não refletir com precisão a heterogeneidade das malignidades e as características individuais dos pacientes devido a possíveis mutações que ocorrem para se adaptar ao ambiente de cultura in vitro durante passagens repetidas. Além disso, eles não possuem o microambiente e o sistema imunológico necessários para o crescimento e desenvolvimento do tumor in vivo. Embora os modelos de CDX ofereçam algumas vantagens sobre a cultura de células in vitro , eles ainda podem não refletir totalmente as características individuais dos pacientes com osteossarcoma, embora os tecidos tumorais obtidos a partir de modelos de CDX tenham heterogeneidade intratumoral e representação do sistema imunológico limitadas em comparação com as linhagens celulares cultivadas in vitro⁹. Portanto, estabelecer um modelo pré-clínico com alta fidelidade é crucial.

Os modelos PDX envolvem o transplante imediato de tecidos cancerígenos humanos recém-ressecados em camundongos imunodeficientes. Esse método permite a preservação fiel das características genéticas, epigenéticas e heterogêneas das neoplasias malignas humanas para cada paciente, mesmo após passagens sucessivas em camundongos. Além disso, os modelos PDX são conhecidos por prever com precisão resultados clínicos posteriores¹⁰, tornando-os ferramentas valiosas para a criação de tratamentos individualizados e o avanço da pesquisa em medicina de precisão¹¹.

Este trabalho descreve o procedimento para estabelecer um modelo PDX em camundongos imunodeficientes por meio do transplante de tecido de osteossarcoma humano. Esses modelos servem como plataformas para a realização de experimentos pré-clínicos para osteossarcoma.

Protocolo

Todos os estudos envolvendo tecidos humanos foram aprovados pelo Comitê de Revisão de Ética Institucional do Hospital Longhua, afiliado à Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai (Xangai, China) (2013LC52), e o consentimento informado por escrito foi obtido dos pacientes de acordo com a Declaração de Helsinque. O número IACUC para este estudo em animais é PZSHUTCM221017013. Camundongos CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl machos com quatro semanas de idade receberam dieta para roedores irradiados com leão duplo GB 14924.3 e água estéril, e foram alojados em gaiolas de camundongos IVCs com cinco camundongos por gaiola, sob condições de FPS com um ciclo claro/escuro de 12 horas. A Tabela de Materiais inclui informações detalhadas sobre todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo.

1. Preparação do tecido de osteossarcoma humano

NOTA: Neste estudo, o tecido do osteossarcoma humano foi ressecado¹² da lesão do fêmur de um paciente com osteossarcoma de 15 anos antes da quimioterapia.

1. Armazene imediatamente o tecido de osteossarcoma recém-ressecado em uma solução protetora de tecido para maximizar a preservação da ativação das células do osteossarcoma após o enxágue com solução salina fisiológica estéril.
   NOTA: Os tecidos de osteossarcoma recém-ressecados devem ser transplantados para camundongos o mais rápido possível. Eles podem ser armazenados na solução protetora tecidual por no máximo 24 horas antes do transplante. Os tecidos de osteossarcoma usados para modelagem devem ser de pacientes que não receberam quimioterapia. A atividade das células tumorais de pacientes que receberam quimioterapia será pobre, levando à falha no estabelecimento do modelo e perda de alta fidelidade.
2. Transfira os tecidos de osteossarcoma recém-ressecados armazenados na solução protetora tecidual para o laboratório o mais rápido possível.
3. Preparar instrumentos e materiais experimentais para o estabelecimento do modelo PDX: bisturis (Figura 1A); pinça oftálmica (Figura 1B,C); tesoura oftálmica (Figura 1D); agulha de sutura (Figura 1E); linha de sutura (Figura 1F); porta-agulha reto (Figura 1G); caneta de marcação (Figura 1H).
   NOTA: Certifique-se de que todos os instrumentos cirúrgicos sejam esterilizados em autoclavagem antes do uso.
4. Enxágue os tecidos do osteossarcoma duas vezes com soro fisiológico estéril pré-resfriado em um capuz estéril.
5. Remova áreas do tecido osteossarcoma com sangramento e necrose.
6. Corte o tecido de osteossarcoma limpo em 3 mm³ pedaços com um bisturi em uma placa de cultura contendo solução salina fisiológica estéril pré-resfriada e mantenha-o no gelo.

2. Estabelecimento de modelos PDX por transplante de tecido de osteossarcoma na região do flanco de camundongos

1. Administrar analgesia pré-operatória de meloxicam (5 mg/kg/24 h) por injeção subcutânea em ratinhos e colocar os ratinhos nus em campos cirúrgicos estéreis. Forneça suporte térmico durante todo o procedimento.
2. Induza a anestesia em camundongos, expondo-os a 3% de isoflurano e 97% de oxigênio. Depois que os camundongos estiverem completamente anestesiados, transfira-os para o cone do nariz e mantenha a anestesia com isoflurano a 1,5% e oxigênio a 98,5%.
3. Aperte os dedos dos pés para garantir que os ratos estejam completamente anestesiados e espere mais tempo se ainda houver espasmos ou reações convulsivas.
   NOTA: Todos os procedimentos devem ser realizados com equipamento estéril em capuz estéril. Evite o ressecamento dos camundongos durante a anestesia, aplicando pomada oftálmica nos olhos.
4. Prenda o mouse em decúbito lateral (Figura 2A). Desinfete um lado da região do flanco do camundongo para transplante de tecido de osteossarcoma 3 vezes com rodadas alternadas de iodopovidona e bolas de algodão desinfetante com etanol a 70%.
   NOTA: A desinfecção cirúrgica é realizada em um padrão circular, começando no centro e espiralando para fora.
5. Marque o local da incisão cirúrgica na pele com um marcador.
6. Faça uma incisão de 5 mm da pele aos tecidos subcutâneos com bisturi (Figura 2B).
7. Levante a pele do lado superior da margem da incisão com uma pinça oftálmica usando a mão esquerda e faça a dissecção romba para cima sob a derme dos camundongos com um porta-agulha reto usando a mão direita (Figura 2C).
8. Segure a pele da parte superior da incisão com a pinça oftálmica usando a mão esquerda e coloque o tecido do osteossarcoma sob a pele aproximadamente 5 mm acima da margem da incisão com uma pinça oftálmica usando a mão direita para transplantar o tecido do osteossarcoma (Figura 2C).
   NOTA: Certifique-se de que o tecido do osteossarcoma seja transplantado logo abaixo da derme da pele. A dissecção romba é realizada com uma pinça de dissecção reta e romba, como um porta-agulha reto, para evitar penetrar na cavidade torácica do camundongo enquanto encontra a camada dérmica da pele do camundongo.
9. Suturar a incisão com sutura absorvível com 2-3 pontos para uma incisão de 5 mm (Figura 2D).
10. Retorne os camundongos para gaiolas limpas e monitore-os até que se recuperem completamente da anestesia.
    NOTA: O PDX estabelecido pelo transplante do tecido do osteossarcoma humano é designado como passagem 0 (P0), o PDX estabelecido pelo transplante do tecido PDX em P0 é designado como passagem 1 (P1), seguido por P2 e P3.

3. Coleta de tecidos tumorais PDX

1. Meça o volume do tumor uma vez por semana. Quando o tamanho do tumor atingir 1500 mm³, eutanasiar os camundongos usando o método de luxação cervical após a inalação de CO₂ . Os desfechos humanos incluem ulceração tumoral ou problemas com a mobilidade dos membros anteriores.
   NOTA: Meça o diâmetro longo (a) e o diâmetro curto (b) do tumor usando um paquímetro. Calcule o volume do tumor (V) usando a fórmula: V = 1/2 × a × b².
2. Posicione o camundongo lateralmente para expor o tumor e desinfete a pele no local do tumor com uma bola de algodão embebida em álcool.
3. Use uma tesoura oftálmica para separar todo o tumor. Pese a massa tumoral usando uma balança eletrônica.

4. Exame patológico de tecidos clínicos primários e tumorais PDX

1. Fixe os tecidos tumorais¹³ em um tubo de 50 mL contendo 30 mL de solução de formalina tamponada neutra a 10% por 24 h. Enxágue bem os tecidos tumorais com água corrente para remover o fixador.
2. Desidrate e incorpore os tecidos tumorais em parafina¹⁴.
3. Corte os tecidos tumorais e faça o exame histológico de rotina¹⁵.

Resultados

Este protocolo descreve o procedimento detalhado para estabelecer um modelo de camundongo PDX, preservando as características morfológicas do osteossarcoma humano após o transplante imediato de tecido de osteossarcoma humano recém-ressecado e passagens sucessivas em camundongos. Aqui, um modelo de camundongo PDX foi estabelecido com sucesso usando tecido de osteossarcoma humano.

A Figura 3A mostra um camundongo representativo ...

Discussão

Os modelos PDX podem simular as características dos cânceres humanos e manter mais semelhança com o tumor primário, incluindo alterações genéticas e genômicas, histologia, heterogeneidade e perfil de expressão gênica 16,17,18,19. Portanto, eles preservam os fenótipos moleculares e genótipos de pacientes com câncer, fornecendo abordagens inovadoras ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% formalin neutral solution	Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd	G1101-500ml	Fix the tissues
Autoclave	Japan Hiryama Company	HVE-50	Sterilization surgical instruments
CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.	/	Animal
Caliper	Yantai Green Forest Tools Co., Ltd.	034180A	Measure the tumor volume
Dish (60mm)	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	430166, Corning	Sample placment during transplantation
Disinfectant cotton balls	Shanghai Honglong Industrial Co., Ltd.	20230627	Disinfect the skin of mice
Disposable sterile gloves	Guilin Hengbao Health Protection Co., Ltd.	YT21131	Sterile operation
Double lion Irradiated Rodent Diet	Suzhou Shuangshi Experimental Animal Feed Technology Co., Ltd.	GB 14924.3	Animal feed
Electronic scale	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	1-2000	Weigh the weight of the tumor
Eosin	Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd	E4009-25G	Hematoxylin eosin stain
Hematoxylin	Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd	H3136-25G	Hematoxylin eosin stain
Isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	VETEASY	Mouse anesthesia
IVCs mice cage	Suzhou Monkey King Animal Experimental Equipment Technology Co., Ltd.	HH-MMB-2	Animal barrier
Mark pen	Zebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd.	YYST5	Mark the surgical incision
Olympus Optical microscope	Japanese Olympus Company	BH20	Scan tissue slices
Ophthalmic ointment	Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd	SOICOEYEGRL	Avoid dry eyes of mice during anesthesia
Ophthalmic scissors	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	Y00030 JZ	Cut the skin
Ophthalmic tweezers	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	BS-ZER-S-100 Biosharp	Hold osteosarcoma tissues during transplantation
Paraffin	Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd.	80200-0015	Buried osteosarcoma tissue
Paraffin slicing machine	Lyca Microsystem (Shanghai) Trading Co., Ltd.	RM2235	Osteosarcoma tissue section
physiological saline	Guangzhou Jinsheng Biotechnology Co., Ltd.	605-004057	Rinse and temporary storage of osteosarcoma tissue
Scalpels	Surgical Instrument Factory of Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd.	J11010-10# JZ	Separation of osteosarcoma tissue and making surgical incisions
Sterile hood	Thermo Fisher Technology (China) Co., Ltd.	ECO0.9	Surgical operation table
sterile surgical drapes	Henan Huayu Medical Equipment Co., Ltd.	20160090	Provide sterile surgery area
Straight needle holder	Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd	J31050 JZ	Suture the wound
Suture line	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd	F3124	Suture the wound
Suture needle	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd	F3124	Suture the wound
Tissue protective solution	Nanjing Shenghang Biotechnology Co., LTD	BC-CFM-03	Maintain the activity of tissue cells
Tube (50 mL)	Shanghai Baisai, Biotechnology Co., Ltd.	BLD-BL2002500	Install formalin fixation solution