АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В настоящем протоколе описан метод создания мышиной модели ксенотрансплантата (PDX), полученной от пациента, с использованием ткани остеосаркомы человека.

Аннотация

Остеосаркома является наиболее распространенной первичной злокачественной опухолью костей у детей и подростков. Несмотря на разработку новых планов лечения в последние годы, прогноз для пациентов с остеосаркомой существенно не улучшился. Поэтому крайне важно создать надежную доклиническую модель с высокой точностью. Модель ксенотрансплантата (PDX), полученная от пациента, точно сохраняет генетические, эпигенетические и гетерогенные характеристики злокачественных новообразований человека для каждого пациента. Следовательно, PDX-модели считаются аутентичными моделями in vivo для изучения различных видов рака в трансформационных исследованиях. В данной статье представлен комплексный протокол создания и поддержания мышиной модели PDX, которая точно отражает морфологические особенности остеосаркомы человека. Это включает в себя немедленную трансплантацию свежерезецированной ткани остеосаркомы человека мышам с ослабленным иммунитетом с последующим последующим пассажированием. Описанная модель служит платформой для изучения роста, лекарственной устойчивости, рецидива и метастазирования остеосаркомы. Кроме того, он помогает в скрининге целевых терапевтических средств и создании персонализированных схем лечения.

Введение

Остеосаркома является первичным злокачественным новообразованием костей, происходящим из межкостных долевых клеток, и чаще всего встречается у подростков, а также у детей. Часто возникает в эпифизе длинного диафиза и характеризуется высокой злокачественностью, ранним метастазированием, плохим прогнозом 1,2. Метастазирование в легкие является основной причиной смерти у пациентов с остеосаркомой. 5-летняя выживаемость пациентов с неметастатической остеосаркомой составляет 65%-70%3. Однако за последние 40 лет 5-летняя выживаемость (только у 20%) пациентов с метастатической остеосаркомой существенно не улучшилась, а у 25% пациентов с остеосаркомой метастазы на момент постановки диагноза4. В настоящее время достигнут консенсус в отношении препаратов первой линии для лечения остеосаркомы, но все еще существуют значительные различия в схеме химиотерапии и времени лечения. Важно проводить доклинические эксперименты на основе соответствующих животных моделей для получения более эффективных схем химиотерапии.

В настоящее время модели, обычно используемые для доклинических экспериментов по остеосаркоме, включают клеточную культуру на основе клеточной линии in vitro и ксенотрансплантаты in vivo (CDX), а также ксенотрансплантаты, полученные от пациента (PDX)6,7.

Клеточные линии удобны для культивирования и использования в исследованиях in vitro, а также для трансплантации иммунодефицитным мышам для создания моделей CDX8. Тем не менее, клеточные линии, культивируемые in vitro, могут неточно отражать гетерогенность злокачественных новообразований и индивидуальные особенности пациентов из-за потенциальных мутаций, которые возникают для адаптации к среде культивирования in vitro во время повторных пассажей. Кроме того, у них отсутствует микроокружение и иммунная система, необходимые для роста и развития опухоли in vivo. Несмотря на то, что модели CDX имеют некоторые преимущества по сравнению с культурами клеток in vitro, они все же могут не полностью отражать индивидуальные особенности пациентов с остеосаркомой, хотя опухолевые ткани, полученные с помощью моделей CDX, имеют ограниченную внутриопухолевую гетерогенность и представительство иммунной системы по сравнению с клеточными линиями, культивируемыми in vitro 9. Поэтому создание доклинической модели с высокой точностью имеет решающее значение.

Модели PDX предполагают немедленную трансплантацию свежерезецированных раковых тканей человека мышам с иммунодефицитом. Этот метод позволяет достоверно сохранить генетические, эпигенетические и гетерогенные характеристики злокачественных новообразований человека у каждого пациента, даже после последовательных пассажей у мышей. Кроме того, известно, что модели PDX позволяют точно предсказывать последующие клиническиеисходы10, что делает их ценными инструментами для создания индивидуализированных методов лечения и продвижения исследований в области точной медицины11.

В данной работе описана процедура создания модели PDX у иммунодефицитных мышей путем трансплантации ткани остеосаркомы человека. Такие модели служат платформами для проведения доклинических экспериментов по остеосаркоме.

протокол

Все исследования, связанные с человеческими тканями, были одобрены Комитетом по обзору институциональной этики больницы Лунхуа, аффилированной с Шанхайским университетом традиционной китайской медицины (Шанхай, Китай) (2013LC52), и было получено письменное информированное согласие пациентов в соответствии с Хельсинкской декларацией. Номер IACUC для этого исследования на животных — PZSHUTCM221017013. Четырехнедельные самцы мышей CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl получали облученную диету для грызунов с двойным львом GB 14924.3 и стерильную воду, а также помещали в клетку для мышей IVC по пять мышей в клетке в условиях SPF с 12-часовым циклом свет/темнота. Таблица материалов содержит подробную информацию обо всех материалах, реактивах и инструментах, используемых в данном протоколе.

1. Подготовка тканей при остеосаркоме человека

Примечание: В этом исследовании ткань остеосаркомы человека была резецирована12 из поражения бедренной кости 15-летнего пациента с остеосаркомой перед химиотерапией.

  1. Немедленно храните только что резецированную ткань остеосаркомы в тканезащитном растворе для максимального сохранения активации клеток остеосаркомы после полоскания стерильным физиологическим раствором.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Свежерезецированные ткани остеосаркомы должны быть пересажены мышам как можно скорее. Они могут храниться в тканевом защитном растворе не более 24 часов до трансплантации. Ткани остеосаркомы, используемые для моделирования, должны быть получены от пациентов, которые не получали химиотерапию. Активность опухолевых клеток у пациентов, получавших химиотерапию, будет слабой, что приведет к сбою создания модели и потере высокой точности.
  2. Как можно скорее перенесите свежерезецированные ткани остеосаркомы, хранящиеся в тканевом защитном растворе, в лабораторию.
  3. Подготовка экспериментальных приборов и материалов для создания модели PDX: скальпелей (рис. 1А); офтальмологический пинцет (рис. 1B,C); офтальмологические ножницы (Рисунок 1D); игла для наложения швов (рисунок 1E); линия наложения швов (рисунок 1F); прямой иглодержатель (рисунок 1G); маркерное перо (рисунок 1H).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием убедитесь, что все хирургические инструменты стерилизованы автоклавированием.
  4. Дважды промойте ткани остеосаркомы предварительно охлажденным стерильным физиологическим раствором в стерильном капюшоне.
  5. Удаляют участки тканей остеосаркомы с кровотечением и некрозом.
  6. Очищенную ткань остеосаркомы разрежьте скальпелем на 3 мм по3 части в чашке для культуры, содержащей предварительно охлажденный стерильный физиологический раствор, и держите ее на льду.

2. Создание PDX-моделей методом трансплантации ткани остеосаркомы в области фланга мыши

  1. Провести предоперационную анальгезию мелоксикамом (5 мг/кг/24 ч) путем подкожной инъекции мышам и поместить обнаженных мышей на стерильные хирургические простыни. Обеспечьте тепловую поддержку на протяжении всей процедуры.
  2. Вызывайте анестезию у мышей, подвергая их воздействию 3% изофлурана и 97% кислорода. После того, как мыши будут полностью обезболены, перенесите их в носовой конус и поддерживайте анестезию 1,5% изофлураном и 98,5% кислородом.
  3. Сожмите пальцы ног, чтобы убедиться, что мыши полностью обезболились, и подождите дольше, если спазмы или судорожные реакции все еще присутствуют.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры должны проводиться с использованием стерильного оборудования в стерильном капюшоне. Избегайте сухости мышей во время анестезии, нанося на их глаза офтальмологическую мазь.
  4. Закрепите мышь в боковом положении пролежня (рисунок 2A). Продезинфицируйте одну сторону области бока мыши для трансплантации ткани при остеосаркоме 3 раза, чередуя циклы ватных шариков с повидон-йодом и дезинфицирующим средством 70% этанола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургическая дезинфекция проводится по кругу, начиная от центра и по спирали наружу.
  5. Отметьте место хирургического разреза на коже маркером.
  6. Сделайте скальпелем разрез 5 мм от кожи до подкожных тканей (рисунок 2Б).
  7. Поднимите верхнюю сторону кожи края разреза офтальмологическим пинцетом с помощью левой руки, а правой рукой выполните тупое рассечение вверх под дермой мышей прямым иглодержателем (рисунок 2В).
  8. Удерживайте верхнюю сторону кожи разреза офтальмологическим пинцетом левой рукой и поместите ткань остеосаркомы под кожу примерно на 5 мм выше края разреза с помощью офтальмологического пинцета, используя правую руку, чтобы пересадить ткань остеосаркомы (рис. 2C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ткань остеосаркомы пересажена чуть ниже дермы кожи. Тупое рассечение выполняется с помощью прямых и тупых щипцов для рассечения, таких как прямой иглодержатель, чтобы избежать проникновения в грудную полость мыши при нахождении дермального слоя кожи мыши.
  9. Зашить разрез рассасывающимся швом 2-3 швами для разреза 5 мм (Рисунок 2D).
  10. Верните мышей в чистые клетки и наблюдайте за ними до тех пор, пока они полностью не оправятся от наркоза.
    PDX, установленный путем трансплантации ткани остеосаркомы человека, обозначается как пассаж 0 (P0), PDX, установленный путем трансплантации ткани PDX в P0, обозначается как пассаж 1 (P1), за которым следуют P2 и P3.

3. Забор опухолевых тканей PDX

  1. Измеряйте объем опухоли раз в неделю. Когда размер опухоли достигнет 1500мм3, усыпить мышей методом шейного вывиха после ингаляцииСО2 . Гуманные конечные точки включают изъязвление опухоли или проблемы с подвижностью передних конечностей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте длинный диаметр (a) и короткий диаметр (b) опухоли с помощью штангенциркуля. Рассчитайте объем опухоли (V) по формуле: V = 1/2 × a × b2.
  2. Расположите мышь сбоку, чтобы обнажить опухоль, и продезинфицируйте кожу в месте опухоли ватным тампоном, смоченным в спирте.
  3. Используйте офтальмологические ножницы, чтобы отделить всю опухоль. Взвесьте опухолевую массу с помощью электронных весов.

4. Патологоанатомическое исследование первичных клинических и PDX опухолевых тканей

  1. Зафиксируйте опухолевую ткань 13 в пробирке объемом50 мл, содержащей 30 мл 10% нейтрального буферизованного раствора формалина в течение 24 ч. Тщательно промойте ткани опухоли проточной водой, чтобы удалить фиксатор.
  2. Обезвоживайте и встраивайте опухолевые ткани в парафин14.
  3. Срез тканей опухоли и проведение планового гистологического исследования15.

Результаты

В этом протоколе подробно описана процедура создания мышиной модели PDX с сохранением морфологических особенностей остеосаркомы человека после немедленной трансплантации свежерезецированной ткани остеосаркомы человека и последующих пассажей у мышей. Здесь была ус...

Обсуждение

Модели PDX могут имитировать характеристики рака человека и сохранять большее сходство с первичной опухолью, включая генетические и геномные изменения, гистологию, гетерогенность и профиль экспрессии генов 16,17,18,19....

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа поддерживается грантами от (1) Национального фонда естественных наук (81973877 и 82174408); (2) Проект строительства Шанхайского высокоприоритетного исследовательского центра (2022ZZ01009); (3) Национальная программа ключевых исследований и разработок Китая (2020YFE0201600); (4) Шанхайский центр совместных инноваций по промышленной трансформации подготовки к ТКМ в больницах и (5) исследовательские проекты в рамках бюджета Шанхайского университета традиционной китайской медицины (2021LK047).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
10% formalin neutral solutionWuhan Saiweier Biotechnology Co., LtdG1101-500mlFix the tissues
AutoclaveJapan Hiryama CompanyHVE-50Sterilization surgical instruments
CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlShanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd./Animal
CaliperYantai Green Forest Tools Co., Ltd.034180AMeasure the tumor volume
Dish (60mm)Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd430166, CorningSample placment during transplantation
Disinfectant cotton ballsShanghai Honglong Industrial Co., Ltd.20230627Disinfect the skin of mice
Disposable sterile glovesGuilin Hengbao Health Protection Co., Ltd.YT21131Sterile operation
Double lion Irradiated Rodent DietSuzhou Shuangshi Experimental Animal Feed Technology Co., Ltd.GB 14924.3Animal feed
Electronic scaleShanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd1-2000Weigh the weight of the tumor
EosinShanghai Gengyun Biotechnology Co., LtdE4009-25GHematoxylin eosin stain
HematoxylinShanghai Gengyun Biotechnology Co., LtdH3136-25GHematoxylin eosin stain
IsofluraneShenzhen RWD Life Technology Co., LtdVETEASYMouse anesthesia 
IVCs mice cageSuzhou Monkey King Animal Experimental Equipment Technology Co., Ltd.HH-MMB-2Animal barrier
Mark penZebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd.YYST5Mark the surgical incision
Olympus Optical microscopeJapanese Olympus CompanyBH20Scan tissue slices
Ophthalmic ointmentShanghai Gengyun Biotechnology Co., LtdSOICOEYEGRLAvoid dry eyes of mice during anesthesia
Ophthalmic scissorsShanghai NianYue Biotechnology Co., LtdY00030 JZCut the skin
Ophthalmic tweezersShanghai NianYue Biotechnology Co., LtdBS-ZER-S-100 BiosharpHold osteosarcoma tissues during transplantation
ParaffinJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd.80200-0015Buried osteosarcoma tissue
Paraffin slicing machineLyca Microsystem (Shanghai) Trading Co., Ltd.RM2235Osteosarcoma tissue section
physiological salineGuangzhou Jinsheng Biotechnology Co., Ltd.605-004057Rinse and temporary storage of osteosarcoma tissue
ScalpelsSurgical Instrument Factory of Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd.J11010-10# JZSeparation of osteosarcoma tissue and making surgical incisions
Sterile hoodThermo Fisher Technology (China) Co., Ltd.ECO0.9Surgical operation table
sterile surgical drapesHenan Huayu Medical Equipment Co., Ltd.20160090Provide sterile surgery area
Straight needle holderShanghai Gengyun Biotechnology Co., LtdJ31050 JZSuture the wound
Suture lineShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LtdF3124Suture the wound
Suture needleShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LtdF3124Suture the wound
Tissue protective solutionNanjing Shenghang Biotechnology Co., LTDBC-CFM-03Maintain the activity of tissue cells
Tube (50 mL)Shanghai Baisai, Biotechnology Co., Ltd.BLD-BL2002500Install formalin fixation solution

Ссылки

  1. Saraf, A. J., Fenger, J. M., Roberts, R. D. Osteosarcoma: accelerating progress makes for a hopeful future. Front Oncol. 8, 4 (2018).
  2. Ligon, J. A., et al. Pathways of immune exclusion in metastatic osteosarcoma are associated with inferior patient outcomes. J Immunother Cancer. 9 (5), e001772 (2021).
  3. Miwa, S., et al. Current and emerging targets in immunotherapy for osteosarcoma. J Oncol. 2019, 7035045 (2019).
  4. Eaton, B. R., et al. Osteosarcoma. Pediatr Blood Cancer. 68 (2), e28352 (2021).
  5. Ritter, J. Osteosarcoma. Ann Oncol. 21, 320-325 (2010).
  6. Lowery, C. D., et al. Broad spectrum activity of the checkpoint kinase 1 inhibitor prexasertib as a single agent or chemo potentiator across a range of preclinical pediatric tumor models. Clin Cancer Res. 25 (7), 2278-2289 (2019).
  7. Hingorani, P., et al. Trastuzumab deruxtecan, antibody-drug conjugate targeting Her2, is effective in pediatric malignancies: a report by the pediatric preclinical testing consortium. Mol Cancer Ther. 21 (8), 1318-1325 (2022).
  8. Brennecke, P., et al. CXCR4 antibody treatment suppresses metastatic spread to the lung of intratibial human osteosarcoma xenografts in mice. Clin Exp Metastasis. 31 (3), 339-349 (2014).
  9. Pan, B., Wei, X., Xu, X. Patient-derived xenograft models in hepatopancreatobiliary cancer. Cancer Cell Int. 22 (1), 41 (2022).
  10. Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumor xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
  11. Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. J Hematol Oncol. 13 (1), 4 (2020).
  12. Stitzlein, R. N., Wojcik, J., Sebro, R. A., Balamuth, N. J., Weber, K. L. Team approach: Osteosarcoma of the distal part of the femur in adolescents. JBJS Rev. 5 (12), 5 (2017).
  13. Kai, K., et al. Formalin fixation on Her-2 and PD-l1 expression in gastric cancer: A pilot analysis using the same surgical specimens with different fixation times. World J Clin Cases. 7 (4), 419-430 (2019).
  14. Yang, T. S., et al. A practical protocol to prepare paraffin-embedded whole tick histology sections. Ticks Tick Borne Dis. 14 (4), 102162 (2023).
  15. Chang, J., et al. Matrine inhibits prostate cancer via activation of the unfolded protein response/endoplasmic reticulum stress signaling and reversal of epithelial to mesenchymal transition. Mol Med Rep. 18 (1), 945-957 (2018).
  16. de Alava, E. Ewing sarcoma, an update on molecular pathology with therapeutic implications. Surg Pathol Clin. 10 (3), 575-585 (2017).
  17. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: An emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
  18. Eoh, K. J., et al. Comparison of clinical features and outcomes in epithelial ovarian cancer according to tumorigenicity in patient-derived xenograft models. Cancer Res Treat. 50 (3), 956-963 (2018).
  19. Stewart, E. L., et al. Clinical utility of patient-derived xenografts to determine biomarkers of prognosis and map resistance pathways in EGFR-mutant lung adenocarcinoma. J Clin Oncol. 33 (22), 2472-2480 (2015).
  20. Kresse, S. H., Meza-Zepeda, L. A., Machado, I., Llombart-Bosch, A., Myklebost, O. Preclinical xenograft models of human sarcoma show nonrandom loss of aberrations. Cancer. 118 (2), 558-570 (2012).
  21. Dobrolecki, L. E., et al. Patient-derived xenograft (PDX) models in basic and translational breast cancer research. Cancer Metastasis Rev. 35 (4), 547-573 (2016).
  22. Abdolahi, S., et al. Patient-derived xenograft (PDX) models, applications and challenges in cancer research. J Transl Med. 20 (1), 206 (2022).
  23. Deng, N., et al. Deep whole-genome sequencing identifies recurrent genomic alterations in commonly used breast cancer cell lines and patient-derived xenograft models. Breast Cancer Res. 24 (1), 63 (2022).
  24. Chen, F., et al. Generation and characterization of patient-derived xenografts from patients with osteosarcoma. Tissue Cell. 79, 101911 (2022).
  25. Fortuna-Costa, A., et al. An association between successful engraftment of osteosarcoma patient-derived xenografts and clinicopathological findings. Histol Histopathol. 35 (11), 1295-1307 (2020).
  26. Beck, J., et al. Canine and murine models of osteosarcoma. Vet Pathol. 59 (3), 399-414 (2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

PDX

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены